John L. Shannonhouse

1 Institut pentru Neuroștiințe, Universitatea Texas A&M, College Station, Texas 77843

Danielle M. Grater

2 Departamentul de Psihiatrie, Colegiul Medical Weill Cornell, New York, New York 10021

Daniel York

2 Departamentul de Psihiatrie, Weill Cornell Medical College, New York, New York 10021

Paul J. Wellman

3 Departamentul de Psihologie, Universitatea Texas A&M, College Station, Texas 77843

Caurnel Morgan

1 Institute for Neuroscience, Texas A&M University, College Station, Texas 77843

2 Departamentul de Psihiatrie, Weill Cornell Medical College, New York, New York 10021

4 Departamentul de Nutriție și Știința Alimentelor, Universitatea Texas A&M, College Station, Texas 77843

5 Facultatea Intercolegială de Nutriție, Universitatea Texas A&M, College Station, Texas 77843

Abstract

INTRODUCERE

Efectele benefice ale alimentelor bogate în grăsimi asupra perturbărilor motivaționale la om contribuie probabil la desemnarea lor ca „alimente de confort”, dar măsura în care sexul joacă un rol nu a fost raportată pe larg. Interesant este că se consideră că diferențele de sex în motivarea și preferința de a consuma alimente bogate în grăsimi contribuie la prevalența obezității la femei mai mult decât la bărbați [1, 2]. În studiile care au controlat fondul genetic cu gemeni monozigoți, obezitatea a fost asociată cu consumul restrictiv, gustarea frecventă și încercarea de restricționare a alimentelor bogate în grăsimi [3, 4]. Mai mult, femeile obeze au raportat de sine o vulnerabilitate mai mare la consumul de „alimente confortabile” decât femeile cu greutate normală [4]. În mod paradoxal, s-a descoperit că femeile prezintă mai multă constrângere dietetică, consum emoțional și consum excesiv decât bărbații [5]. Investigația în acest domeniu este importantă, deoarece prejudecățile feminine sunt stabilite pentru tulburările alimentare și consumul excesiv de alimente bogate în grăsimi [6, 7], precum și tulburările motivaționale [8, 9], dar bazele lor biologice nu sunt. Anhedonia și anxietatea sunt considerate a reprezenta disfuncții neuronale în motivația pozitivă și respectiv negativă [10, 11] și sunt frecvent comorbide cu tulburări alimentare [12, 13].

Studiile anterioare pe rozătoare au arătat că grăsimile din dietă influențează comportamentele legate de depresie și anxietate. La șobolanii Sprague Dawley adulți, supuși separării materne ca pui, hrănirea bogată în grăsimi a exercitat efecte anxiolitice, în special la bărbați [14, 15]. Efecte anxiolitice similare ale grăsimilor alimentare au fost demonstrate la șobolanii Sprague Dawley masculi fără separare maternă [16]. În plus, consumul excesiv de alimente bogate în grăsimi a prevenit anxietatea după întreruperea acesteia la șobolani [17]. Interesant este faptul că grăsimea cronică bogată în grăsimi a crescut imobilitatea șobolanilor Wistar masculi și femele în testul de înot forțat, care este legat de inhibarea psihomotorie, un simptom de bază al depresiei la om [18]. La șoarecii masculi C57BL/6, hrana cu conținut ridicat de grăsimi a atenuat anxietatea și imobilitatea indusă de stres, dar nu și anhedonia [19]. Cu toate acestea, la șoarecii masculi CD-1, hrănirea cu conținut ridicat de grăsimi a exercitat efecte asemănătoare antidepresivelor, dar și efecte anxiogene [20]. Întreruperea dietei bogate în grăsimi a înrăutățit comportamentele anxioase și de recompensare la șoareci și le-a crescut dorința de a suporta condițiile anxioase pentru a recâștiga accesul la chow bogat în grăsimi [21]. Cu toate acestea, diferențele dintre specii, tulpini și sexe, aceste descoperiri sugerează că grăsimile din dietă pot îmbunătăți emoționalitatea în anumite condiții experimentale.

Există dovezi crescânde că consumul ridicat de grăsimi exercită efecte satisfăcătoare prin acțiuni în nucleul accumbens, care este o componentă integrantă a sistemului de recompensare mezolimbică și importantă pentru integrarea bioenergetică și emoțională. Această structură limbică influențează stările legate de depresie, anxioase și de recompensă la șobolani, șoareci și oameni [22-24], precum și comportamentele de recompensă și preferințele alimentare la hamsteri [25, 26]. La șobolani, o masă bogată în grăsimi a indus o eliberare mai mare de dopamină accumbală, care este un semnal puternic de recompensă [27]. Studiile care evaluează corelația cu expresia ΔFosB sau efectele supraexprimării ΔFosB sugerează că acest factor de transcripție crește motivația pentru recompensa bogată în grăsimi și promovează conservarea energiei și adipozitatea [28-30]. Șoarecii care supraexprimă osFosB în nucleul accumbens au prezentat, de asemenea, un răspuns de recompensă îmbunătățit și anxietate după retragerea cu conținut ridicat de grăsimi [31]. Mai mult, hrănirea cronică cu conținut ridicat de grăsimi la șobolanii Long Evans a redus activarea accumbală a unui semnal anxiogen, CREB fosforilat [32], iar la șoareci supraexpresia osFosB a împiedicat o scădere a fosforilării CREB accumbale [31]. Cu toate acestea, în ultimele două studii, comportamentul de recompensă nu a fost evaluat.

Expresia hipotalamică a citokinei, TLR4, a fost implicată ca mediator în efectele stimulatoare ale dietei bogate în grăsimi asupra inflamației neuronale, apoptozei și rezistenței la insulină [33-35]. Am arătat că creșterea nivelului de ARNm hipotalamic Tlr4 este asociată cu anxietatea indusă de separare și anorexia la hamsteri [36]. În plus, s-a demonstrat că activarea TLR4 mediază recompensa medicamentului [37-40], dar locul de acțiune neuroanatomic nu a fost stabilit. Deoarece CREB și ΔFosB joacă roluri opuse în accumbens față de alte regiuni ale creierului [41-44], este plauzibil ca expresia Tlr4 accumbală să crească odată cu recompensa. Prin urmare, am explorat această posibilitate în prezentul studiu.

Studiile citate mai sus ilustrează colectiv necesitatea unui model relevant clinic pentru a testa ipoteza că modularea grăsimilor alimentare contribuie la diferențele de sex în stările motivaționale. Am arătat anterior că, în raport cu locuințele sociale, separarea socială a indus anorexia și anxietatea cu prejudecăți feminine la hamsterii sirieni [36, 45, 46]. În studiul de față, am căutat să stabilim dacă separarea socială induce și anhedonia cu tendințe feminine folosind un nou test, testul de preferință investigațională a recompensei (RIP). Important, am căutat, de asemenea, să stabilim dacă grăsimile din dietă reduc comportamentele anedonice și anxioase cu diferențe de sex.

METODE ȘI MATERIALE

Subiecte

Hamsterii aurii sirieni (Mesocricetus auratus) din tulpina Crl: LVG (SYR) (Charles River, Kingston, NY) au fost cumpărați pentru a fi folosiți la Weill Cornell Medical College sau au fost crescuți până la trei generații în unitatea de cercetare a animalelor din laboratorul Kleberg la Texas A&M University. S-au păstrat un program 14h: 10h lumină-întuneric (luminile aprinse la 0600h) și temperatura de 23 ± 3 ° C. Dieta cu conținut scăzut de grăsimi, LabDiet 5001 (Purina Mills, Richmond, IN), dieta cu conținut ridicat de grăsimi, D12451 (Research Diets, New Brunswick, NJ) și apă de la robinet au fost furnizate ad libitum. Procedurile utilizate în acest studiu au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor.

Proiecte experimentale

Hamsterii au fost adăpostiți 2-4/cușcă în timpul locuințelor sociale de același sex (SH) după înțărcare. Unii au fost adăpostiți 1/cușcă în timpul separării sociale (SS) la vârsta de 10 săptămâni (a se vedea Fig. 1 pentru calendarele studiilor și cursurile de timp pentru tratamentele medicamentoase). Agresiunea teritorială a fost redusă la minimum folosind colegii de gunoi pentru SH și screeningul pentru supraagresivitate zilnic de la vârsta de 6 săptămâni. Nu era necesar să separați niciun coleg de cușcă.

răspunsurile

Sunt prezentate cronologii pentru manipularea socială și administrarea drogurilor, precum și pentru evaluarea comportamentelor motivate, a anorexiei și a expresiei acumbale a genelor țintă.

Studiul 1

Hamsterii feminini și masculi (n = 8) au fost evaluați pentru anxietate și anhedonie între 1000h-1600h într-o cameră de comportament dedicată în timpul SH sau SS. Experiment 1.1. Anxietatea a fost evaluată în testul conflictului de hrănire/explorare legat de anxietate (descris mai jos) după 8 săptămâni de SS. Am stabilit anterior acest punct de timp să fie aproape de vârf pentru anxietate [36]. Experiment 1.2. Hamsterii au fost evaluați pentru anhedonia în testul de preferință de investigare a recompensei (descris mai jos) imediat după experimentul 1.1.

Studiul 2

A doua și a treia cohortă, conținând femele (n = 6), au fost evaluate după 8 săptămâni de SS pentru răspunsuri la dozele standard de antidepresive în timpul SS în testul RIP. Experimentul 2.1. Inhibitorul prototip selectiv al recaptării serotoninei, fluoxetina (0 sau 10 mg/kg/zi, po), a fost administrat în apă potabilă, începând după 5 săptămâni de separare, iar comportamentele au fost evaluate după 7 și 21 de zile. Experiment 2.2. A fost administrat antidepresivul triciclic prototipic, desipramina (0 sau 20 mg/kg/zi, po), iar comportamentele au fost evaluate ca mai sus. Am raportat anterior că desipramina la aceeași doză a redus comportamentul anxios la hamsteri [46]

Studiul 3

A patra și a cincea cohortă, conținând femele (n = 6), au fost evaluate după 8 săptămâni de SH sau SS pentru răspunsuri la non-antidepresive în testul RIP în timpul SS. Experiment 3.1. Hamsterii au fost injectați cu vehicul, antagonist al receptorilor beta-adrenergici, propranolol (2 mg/kg, ip), modulator al receptorului GABAA, tracazolat (1 mg/kg, ip) sau antagonist al receptorilor opioizi, naltrexonă (4 mg/kg, ip), Cu 30 de minute înainte de testare. Experiment 3.2. Hamsterii au fost injectați cu benzodiazepină diazepam prototipică (0 sau 1 mg/kg, ip) ca mai sus. Am raportat anterior că propranololul și diazepamul, dar nu naltrexona, utilizate la aceleași doze au redus comportamentul anxios la hamsteri [46]. Tracazolatul este un anxiolitic supus [47].

Studiul 4

A șasea și a șaptea cohortă, care conțin femele și bărbați, au fost evaluate pentru anorexie după 8 săptămâni de SS. Am stabilit anterior acest punct de timp să fie aproape de vârf pentru aproape valorile de vârf pentru anorexia indusă de SS [36]. Experiment 4.1. Hamsterii (n = 8) și alimentele au fost cântărite în momentul modificărilor regulate ale cuștii în timpul fazei luminoase la cel mai apropiat 0,1 g. Aportul de alimente a fost evaluat prin cântărirea chow-ului îndepărtat din buncăr, așternut și pungi pentru obraz, după cum este necesar. În timpul SH, aportul de alimente pe cușcă a fost împărțit la numărul de hamsteri pe cușcă. Eficiența calorică a fost calculată ca creștere în greutate (g) normalizată la aport caloric (kcal). Experimentul 4.2. Ratele metabolice, raporturile de schimb respirator și temperaturile pielii au fost măsurate la femele (n = 6-10) și la bărbați (n = 6-8) prin calorimetrie indirectă (descrisă mai jos).

Studiul 5

Un subset de hamsteri din studiul 4 (n = 5) a fost evaluat după 10 săptămâni de SS pentru expresia genei și greutățile țesuturilor. Experiment 5.1. Expresia genelor acumbale a fost evaluată prin RT-PCR (vezi Tabelul 1, de exemplu secvențe și condiții de amplificare). Experimentul 5.2. Țesuturile au fost excizate post mortem și au cântărit la cel mai apropiat 0,1 g (adipos) sau 1 mg (toate celelalte). Lungimile corpului și tibiei au fost măsurate post mortem la cel mai apropiat 1 cm și, respectiv, 1 mm. Greutățile suprarenalei și ale splinei au furnizat indici ai activității cronice a corticosteroizilor [36, 48]. Lungimile corpului și tibiei au furnizat indici de creștere liniară. Greutatea și lungimea tibiei au furnizat un indice brut al densității osoase. Greutatea tibială anterioară a furnizat un indice de muscularitate. Greutățile țesutului adipos alb au furnizat indici de adipozitate. Greutățile țesutului adipos maro au furnizat un indice al capacității de epuizare a energiei prin termogeneză.

tabelul 1

Principii și condiții PCR

Gene: Primer SequenceConditions
ActbFwd: GGTATGGAATCCTGTGGCATCCATGA
Rev: ACTCCTGCTTGCTGATCCACATCT		24 de cicluri, TM = 93 ° C
Creb1Fwd: ACAGATTGCCACATTAGNCCAGGTA
Rev: TCCACAGACTCCTGTGAATCTTCACT		33 cicluri, TM = 92 ° C
ΔFosbFwd: GGAGGGTTCGCAGAGAGAGAAACAA
Rev.: CCGAGGACTTGAACTTCACTCGG		35 cicluri, TM = 94 ° C
Tlr4Fwd: CTCCCTGAGACCTGAAAGCTTGGAT
Rev: GGTGTAGACCCTGATATGCCTTGTCTT		35 de cicluri, TM = 91 ° C

Testul privind conflictul de hrănire/explorare legat de anxietate (AFEC)

După cum am descris [36, 46], indivizii au fost transferați în cuști de testare curate, iar crackerul Graham (Nabisco, East Hanover, NJ) a fost prezentat imediat. Intervalele pentru adulmecarea mâncării testate (latența de abordare) sau mușcătura (latența hranei) au fost temporizate de un marcator orb de tratament. Pentru a controla factorii non-emoționali, latențele de abordare și hrănire au fost, de asemenea, măsurate după întoarcerea în cuștile de acasă. Alimentele au fost scoase din cuștile de acasă cu 90 de minute înainte de testare. Timp de 7 zile înainte de testare, subiecții erau obișnuiți zilnic cu

30 mg de alimente de testat.

Recompensarea testului de preferință investigațională (RIP)

Pentru a minimiza anxietatea indusă de noutate, indivizii au fost evaluați imediat după testul AFEC, care a permis aproximativ 10 minute de aclimatizare la cuștile de testare. Recompensele (cracker-ul Graham) și casetele goale (goale) au fost plasate în buncărul pentru alimente pentru 5 minute. Casetele erau recipiente de plastic transparente cu casetă video MiniDV (Maxell, Woodland Park, NJ). Timpul cumulativ petrecut investigând (adică adulmecând, zgâriind și mușcând) fiecare casetă a fost măsurat folosind un cronometru. Creșteri ale investigației recompensei și preferințelor investigaționale ale recompensei (investigația recompensei/după investigația totală x 100) au fost utilizate ca indici ai impulsului hedonic.

Calorimetre indirecte

Persoanele au fost evaluate într-un sistem Oxymax (Columbus Instruments, Columbus, OH) așa cum am descris [36, 45]. Aerul eșantionat a fost trecut prin senzori de O2 și CO2 și s-a determinat producția de căldură ca rată metabolică (kcal/h/kg 2/3) și catabolism lipidic ca raport de schimb respirator (CO2/O2).

Microdisecție accumbală

Creierele congelate au fost excizate post mortem, congelate în izopentan pe gheață uscată și depozitate la -80 ° C. Ulterior au fost blocate, montate pe un stadiu de microtom înghețat și secționate la 150 μm prin striat, folosind atlasul creierului de hamster [49]. Secțiunile de țesut au fost plasate pe diapozitive de sticlă pe o placă de îngheț și striatul ventral care conține nucleul accumbens a fost disecat la microscop chirurgical folosind perforatoare de miez metalic cu diametrul de 0,75 mm (Ted Pella, Redding, CA).

Extracția ARN-ului

Am folosit o modificare a metodei fenolului, alcoolului izoamilic, izotiocianatului de guanidiniu, β-mercaptoetanolului (PIG-B) [50]. Pe scurt, probele de țesut au fost omogenizate în PIG-B trecându-le în mod repetat prin seringi de 1 cc prevăzute cu ace de 18 G. Omogenatele monofazice au fost separate în 2 straturi cu o cincime din volumul de cloroform, urmate de centrifugare. Faza apoasă a fost extrasă de două ori folosind un volum de 5: 1 fenol: cloroform (pH 4,5) și o dată cu un singur volum de cloroform, urmat de precipitare cu izopropanol și spălare cu 75% etanol. Calitatea ARN a fost evaluată prin electroforeză pe gel de agaroză și spectrofotometrie.

Transcriere inversă PCR

Transcrierea inversă a fost efectuată așa cum este descris [46, 51], utilizând transcriptaza inversă M-MLV (New England Biolabs, Ipswich, MA). Reacțiile PCR au fost efectuate folosind Taq 2X Master Mix (New England Biolabs). Amplificările au fost efectuate cu primerii enumerați în tabelul 1. Am efectuat PCR cu pornire la cald la 91 ° C, denaturare la 94 ° C timp de 50 de ani și ciclare la temperaturi de topire enumerate în Tabelul 1 timp de 20 de ani. Hibridizarea a avut loc la 60 ° C timp de 20 de secunde, cu extindere la 72 ° C timp de 30 de secunde utilizând numerele de ciclu enumerate în Tabelul 1. Ampliconii au fost vizualizați pe agaroză 1,4%, geluri de tetraborat de sodiu 5 mM și colorate cu bromură de etidiu (ISC Bioexpress, Kaysville, UT). Intensitățile benzilor au fost analizate folosind software-ul Kodak 1D Image Analysis (Eastman Kodak, Rochester, NY). Datele de la gene de interes sunt mijloace de reacții triplicate normalizate la mediană. Standardele beta-actinei au fost rulate în triplicat și corelate între ele (r 2> 0,9). Semnalele țintă au fost normalizate la mijloacele standardelor.

Droguri

Fluoxetina-HCI și desipramina-HCI au fost administrate în apă potabilă așa cum este descris [46]. Propranolol-HCI, tracazolat-HCI și naltrexonă au fost dizolvate în soluție salină 0,9%. Diazepamul a fost dizolvat în etanol și 0,9% soluție salină. Drogurile au fost cumpărate de la Sigma (St. Louis, MO).

Analize statistice

ANOVA unidirecțional (experiment 3.1), testul t Student (experiment 3.2) și ANOVA bidirecțional urmat de testul t Bonferroni (experimentele rămase) au fost utilizate pentru a determina diferențele dintre medii, care au fost considerate semnificative la valorile p mai puțin de 0,050. Rezultatele ANOVA sunt prezentate în tabelele 2 - 10. Analizele au fost efectuate folosind Prism 5.04 și InStat 3.00 (GraphPad, San Diego, CA).