Abstract

  • FPLC, cromatografie lichidă cu performanță rapidă
  • HFD, dietă bogată în grăsimi
  • LFD, dieta saraca in grasimi
  • MUFA, acid gras monoinsaturat
  • PGC, receptor activat de proliferator peroxizom-γ coactivator
  • SCD, stearoil-CoA desaturază
  • SOCS, supresor al semnalizării citokinelor
  • SREBP, o proteină de legare a elementelor de reglare a sterolului

Sindromul metabolic este o constelație de constatări, incluzând obezitatea centrală, rezistența la insulină, dislipidemia, hipertensiunea și steatoza hepatică, care predispune la diabet, boli cardiovasculare și cancer. Deoarece prevalența diabetului, a obezității și a sindromului metabolic ating proporții uluitoare, multă atenție s-a concentrat asupra etiologiilor lor și a relației dintre aceștia (1,2). Deși atât factorii genetici, cât și cei de mediu joacă în mod clar un rol, exact modul în care acești factori interacționează pentru a produce sindromul metabolic și diferitele sale componente rămâne neclar.

efectele

La majoritatea oamenilor, rezistența la insulină pare a fi poligenică și eterogenă (3). Astfel, există mai multe gene care pot contribui la fenotip, iar dezvoltarea bolii la orice individ poate implica doar un subgrup specific al acestor gene care variază de la populație la populație. Se crede că populațiile cu risc ridicat predispuse la dezvoltarea obezității și a rezistenței la insulină, precum indienii Pima și mexicanii americani, sunt îmbogățite pentru grupuri de gene care acționează împreună pentru a produce sindromul metabolic în contextul unui factor de declanșare adecvat de mediu, cum ar fi dietă occidentală bogată în grăsimi.

Dereglarea metabolismului lipidic hepatic poate juca un rol central în patogeneza sindromului metabolic. McGarry (7) a propus că sinteza crescută a lipidelor de către ficat produce rezistență la insulină în alte țesuturi, cum ar fi mușchii. Depozitarea crescută a lipidelor în ficat are ca rezultat modificări ale grăsimilor, care sunt acum cunoscute a fi o caracteristică a sindromului metabolic (8). Aceste modificări formează un spectru de patologie, denumită boală hepatică grasă nealcoolică, variind de la steatoza benignă simplă la steatohepatita nealcoolică, care poate evolua până la ciroză și insuficiență hepatică (9). Se crede că boala hepatică grasă nealcoolică poate fi acum cea mai frecventă cauză a cirozei criptogene în această țară (10). Pacienții cu sindrom metabolic au, de obicei, trigliceride crescute și HDL scăzut (11). Dislipidemia este strâns legată de morbiditățile cardiovasculare asociate sindromului metabolic și poate fi atribuită, cel puțin parțial, manipulării aberante a lipidelor de către ficat (12).

Pentru a înțelege modul în care genele interacționează cu grăsimile din dietă pentru a produce modificările metabolismului lipidic care apar în sindromul metabolic, am folosit două tulpini de șoareci, reprezentând diferențe de susceptibilitate la dezvoltarea rezistenței la insulină. Șoarecii C57Bl/6 (B6) s-au dovedit anterior să dezvolte diabet atunci când sunt supuși rezistenței la insulină indusă genetic datorită unei deleții duble heterozigote a unei alele a receptorului de insulină și a unei alele substrat-1 a receptorului de insulină (13,14). Șoarecii 129Sv (129), pe de altă parte, sunt protejați de diabet atunci când poartă același defect heterozigot al receptorului de insulină/al receptorului de insulină substrat-1. În studiul de față, șoarecii B6 și 129 au fost plasați pe două extreme ale dietei: o dietă cu conținut scăzut de grăsimi (LFD; 14% calorii din grăsimi) și o dietă bogată în grăsimi (HFD; 55% calorii din grăsimi). Am comparat efectele factorilor genetici și dietetici nu numai asupra glucozei, ci și asupra profilurilor lipidice serice și hepatice și a expresiei genice lipogene hepatice, pentru a înțelege mai bine cum acești factori modifică metabolismul lipidic și pentru a identifica elementele cheie care controlează progresia sindromului metabolic.

PROIECTAREA ȘI METODELE CERCETĂRII

Șoarecii masculi C57Bl/B6 și 129S6/SvEvTac (Taconic) de șase săptămâni au fost plasați pe o dietă cu conținut scăzut de grăsimi cu conținut ridicat de carbohidrați (NIH # 31; Taconic) sau cu o dietă bogată în grăsimi cu conținut scăzut de carbohidrați (TD93075; Harlan Teklad). LFD obține 14% calorii din grăsimi, 25% calorii din proteine ​​și 61% calorii din carbohidrați și s-a constatat că conține 1,5% acizi grași saturați, 2,7% acizi grași mononesaturați (MUFA) și 0,6% acizi grași polinesaturați în greutate. HFD obține 55% calorii din grăsimi, 21% calorii proteine ​​și 24% calorii din carbohidrați și s-a constatat că conține 4,2% acizi grași saturați, 5,0% MUFA și 11,2% acizi grași polinesaturați. LFD și HFD au 15,4 și respectiv 7,1 mg de colesterol la 100 g, respectiv. Acidul arahidonic a fost nedetectabil în ambele diete. Șoarecii au fost menținuți pe un ciclu de lumină-întuneric de 12 ore; cu excepția cazului în care se indică altfel, au fost prelevate probe de ser, iar șoarecii au fost uciși între orele 9:00 și 11:00 a.m., în stare nedeterminată la vârsta de ∼6 luni. Nivelurile de insulină au fost măsurate în probe de plasmă de șoareci hrăniți aleatoriu utilizând kitul ELISA Crystal Chem și standardele de insulină de șoarece. Trei cohorte independente au fost utilizate pentru efectuarea acestor experimente.

Analiza lipidelor serice.

Au fost reunite volume egale de ser de la trei la patru șoareci la post de 6 ore (începând dimineața). Colesterolul și trigliceridele au fost măsurate folosind kiturile Sigma 352 și 339, adaptate pentru plăcile de microtitrare. În plus, serul a fost supus cromatografiei lichide cu performanță rapidă (FPLC) așa cum s-a descris anterior (15) și colesterolul a fost măsurat în fracțiile eluate. Analiza lipidelor serice a fost realizată de nucleul lipidelor, lipoproteinelor și aterosclerozei centrelor de fenotipare metabolică a șoarecelui Vanderbilt.

Imunohistochimie.

Ficatele provenite de la animalele moarte au fost înghețate în azot lichid, încorporate într-un compus de tăiere cu temperatură optimă și tăiate în secțiuni de 6 μm. Colorarea hematoxilinei/eozinei și a uleiului-roșu-O a fost efectuată folosind tehnici standard.

Analiza lipidelor hepatice.

Analiza lipidelor hepatice a fost efectuată de nucleul lipidelor, lipoproteinelor și aterosclerozei centrelor de fenotipare metabolică a șoarecelui Vanderbilt. Lipidele au fost extrase, filtrate și recuperate în faza de cloroform. Clasele individuale de lipide au fost separate prin cromatografie în strat subțire folosind plăci de silicagel 60 A și vizualizate cu rodamină 6G. Fosfolipidele, trigliceridele și esterii colesterolului au fost răzuite, metilate și analizate prin cromatografie gazoasă (16,17).

Microarrays oligonucleotidice.

ARN total (25 μg) a fost combinat de la două la trei animale pentru a produce ARNc așa cum s-a descris anterior (18). ARNc (15 μg) a fost hibridizat pe cipurile murine Affymetrix U74Av.2, cu patru cipuri reprezentând fiecare grup. Datele au fost analizate folosind MAS v5, fiecare cip fiind normalizat la o intensitate medie de 1.500.

PCR în timp real.

ARN total a fost extras și purificat folosind kitul RNeasy (Qiagen) și utilizat pentru a direcționa sinteza ADNc folosind kitul RT pentru PCR (Clontech). RT-PCR a fost efectuat utilizând SYBR green master mix (ABI), 5% din reacția de sinteză a ADNc și 300 nmol/l din primerii relevanți. Proteina de legare a elementelor de reglare a sterolului (SREBP) -1c și primerii SREBP-1a au fost specifici izoformei și au fost descriși anterior (19). Alți primeri au fost după cum urmează: supresorul citokinelor de semnalizare (SOCS) -3, 5'-CCTCGGGGACCATAGGAG-3 'și 5'-AACTTGCTGTGGGTGACCAT-3'; SREBP-2, 5'GCGTTCTGGAGACCATGGA-3 'și 5'-ACAAAGTTGCTCTGAAAACAAATCA-3'; receptor activat de proliferator peroxizom-γ coactivator (PGC) -1α, 5′-GTCAACAGCAAAAGCCACAA-3 ′ și 5′-TCTGGGGTCAGAGGAAGAGAg-3 ′; și PGC-1β, 5'-CCCTGTCCGTGAGGAACG-3 'și 5'-ATCCATGGCTTCGTACTTGC-3'. Primerii s-au descoperit că se amplifică liniar. Deoarece gene comune de menaj, cum ar fi proteina de legare TATA și proteina ribozomală 36B4, au variat între tulpini, expresia a fost normalizată la intrarea ARN și calculată ca o funcție de 2 -Ct .

Imunoblotarea SREBP-1.

Extractele de proteine ​​nucleare din ficatul de șoarece au fost preparate așa cum a fost descris de Sheng și colab. (20). Pentru fiecare afecțiune, porțiuni egale de doi până la trei ficatei de șoarece au fost reunite pentru a produce extracte nucleare; aceste experimente au fost făcute în duplicat sau triplicat. Imunoblotarea a fost efectuată pe protocolul kitului de sistem de detectare ECL Amersham, cu excepția faptului că soluțiile de spălare au fost suplimentate cu 0,1% SDS (greutate/vol), 1% (vol/vol) Nonidet P-40 și 0,5% (greutate/vol) sodiu deoxicolat. Anticorpii împotriva șoarecelui SREBP-1 au fost descriși anterior (21).

Activitatea enzimatică a desaturazei Stearoyl-CoA.

Conversia stearoil-CoA [1- 14 C] oleat a fost utilizată pentru a măsura activitatea enzimei stearoil-CoA desaturază (SCD) din microsomi preparați din extracte individuale de ficat așa cum s-a descris anterior (22).

Imunoblotarea SOCS-3.

Aproximativ 100 mg de ficat înghețat de la șoareci masculi de 16 săptămâni, hrăniți cu HFD timp de 6 săptămâni, au fost omogenizați în 25 mmol/l Tris 7,4, 2 mmol/l Na3VO4, 10 mmol/l NaF, 10 mmol/l Na4P2O7, 1 mmol/l EGTA, 1 mmol/l EDTA, 1% NP40 și un comprimat inhibitor de protează (tablete complete de inhibitori de protează; Roche) în 50 ml și supus ultracentrifugării la 50.000 rpm timp de 45 min într-un rotor TLA100.2. Concentrația de proteine ​​a fost determinată folosind un test Bradford (Bio-Rad). Proteinele (75 μg) au fost supuse SDS-PAGE, iar imunoblotarea a fost efectuată folosind un kit Roche Chemiluminescence cu anticorpi împotriva SOCS-3 (Santa Cruz).

analize statistice.

Efectele semnificative statistic ale dietei și tulpinii au fost identificate folosind un model ANOVA bidirecțional cu interacțiune. Normalitatea datelor a fost evaluată prin histograma și graficul de probabilitate normal al reziduurilor din modelul ANOVA. Datele care prezintă o abatere semnificativă de la normalitate au fost transformate în scară logaritmică și renovare. În fiecare model ANOVA, semnificația termenului de interacțiune a fost evaluată mai întâi și, dacă interacțiunea nu a fost semnificativă din punct de vedere statistic (proteine ​​P −1 · mg −1 prin hrănire bogată în grăsimi la 129 șoareci și de la 1,1 la 1,6 nmol · min - 1 · mg −1 prin hrănirea cu conținut ridicat de grăsimi la șoarecii B6 Astfel, hrănirea cu conținut ridicat de grăsimi și fondul B6 exercită efecte aditive asupra activității SCD1.

Alte gene candidate.

PGC-1α și PGC-1β sunt coactivatori transcripționali care sunt importanți în direcționarea metabolismului energetic. Ei coordonează răspunsul ficatului la post prin activarea a numeroase procese, inclusiv gluconeogeneza, biogeneza mitocondrială și oxidarea acizilor grași (28,29). Folosind PCR în timp real, am constatat că hrănirea cu conținut ridicat de grăsimi crește PGC-1α de aproximativ dublu în tulpina B6 (Fig. 7A). Cu toate acestea, hrănirea bogată în grăsimi nu a avut niciun efect asupra ARNm PGC-1α la tulpina 129. Nu au existat efecte semnificative ale dietei sau tulpinii asupra PGC-1β (Fig. 7B).

Se știe că rezistența la insulină și leptină crește SOCS-1 și SOCS-3 (30,31). Mai mult, am arătat anterior că creșterea proteinelor SOCS poate induce transcrierea SREBP-1c (32). PCR în timp real și Western blot au arătat că SOCS-3, la fel ca PGC-1α, a fost crescut prin hrănirea cu conținut ridicat de grăsimi la șoarecii B6, dar mai scăzut la șoarecii B6 LFD în comparație cu șoarecii 129 LFD, în ciuda faptului că șoarecii B6 au mai multă insulină rezistent (Fig. 7C și D). Nu s-au observat diferențe în ARNm SOCS-1 (datele nu sunt prezentate).

DISCUŢIE

Dereglarea metabolismului lipidic este o caracteristică centrală a sindromului metabolic și este intim asociată cu dezvoltarea steatozei hepatice, dislipidemiei și rezistenței la insulină. Patogeneza sindromului metabolic este slab înțeleasă, dar implică în mod clar atât factori genetici, cât și factori de mediu. În acest studiu, am profitat de variația genetică naturală dintre două tulpini de șoarece de laborator „normale”: tulpina B6, care este predispusă la dezvoltarea obezității și rezistenței la insulină, și tulpina 129, care nu este. Supunerea acestor tulpini la LFD și HFD produce un spectru de patologie, variind de la șoarecii normali 129 LFD la șoarecii B6 HFD sever deficienți, oferind o oportunitate de a observa efectele tulpinii genetice și ale dietei asupra sindromului metabolic.

În anumite privințe, atât tulpinile 129, cât și cele B6 au răspuns în mod similar hrănirii bogate în grăsimi. Pe HFD, ambele câștigă mai mult în greutate și dezvoltă hipercolesterolemie, o reducere a trigliceridelor serice și o creștere a acumulării de lipide hepatice. Ambele acumulează trigliceride și fosfolipide îmbogățite în acizi grași mononesaturați. De asemenea, descoperim că ambele tulpini de șoareci au o creștere relativă a arahidonatului asociat fosfolipidelor (20: 4) atunci când sunt expuse la un HFD. Deoarece arahidonatul este precursorul prostaglandinelor și leucotrienelor, care sunt mediatori puternici ai inflamației, este tentant să speculăm că abundența sa crescută contribuie la starea proinflamatorie asociată cu sindromul metabolic (33,34). În cele din urmă, ambele tulpini au răspuns la hrănirea cu conținut ridicat de grăsimi cu o creștere a glicerol-3-PO4 aciltransferazei și a acil elongazei grase cu lanț lung, constatare observată și la alte tulpini de șoareci (35).

În ciuda similitudinilor în răspunsul lor la hrana bogată în grăsimi, există diferențe dramatice între cele două tulpini. Șoarecii B6 sunt mai obezi, intoleranți la glucoză, hiperinsulinemici și hiperleptinemici decât 129 de șoareci din ambele diete. În timp ce ambele tulpini dezvoltă hipercolesterolemie ca răspuns la hrana cu conținut ridicat de grăsimi, excesul de colesterol seric este asociat cu particule HDL la 129 șoareci HFD, dar atât particule LDL cât și HDL la șoareci B6 HFD. Șoarecii B6 au, de asemenea, un conținut mai mare de trigliceride hepatice și o abundență crescută de MUFA în fracțiunea trigliceridelor. Expresia sintazei acizilor grași, a enzimei malice și a citratului liasa a fost, de asemenea, mai mare la șoarecii B6 comparativ cu 129.

Aceste modificări ale expresiei genei lipogene și ale conținutului de MUFA găsite cu profilarea transcripțională și lipidică au sugerat că ar putea exista modificări în SREBP-1c, un factor de transcripție capabil să activeze transcrierea tuturor enzimelor necesare pentru sinteza MUFA și SCD1, care catalizează rata etapă determinantă în producția de MUFA. Într-adevăr, atât ARNm-ul SREBP-1c, cât și proteina nucleară, precum și activitatea și ARNm-ul SCD1 sunt crescute prin hrănirea cu conținut ridicat de grăsimi și fondul genetic B6. Descoperirile noastre sunt oarecum în contrast cu cele ale lui Kakuma și colab. (38) că șobolanii Sprague-Dawley hrăniți cu HFD timp de 6 săptămâni au o supresie cu 80% a transcrierii SCD1. Nu se cunoaște dacă aceasta reprezintă o diferență în specii sau durata hrănirii cu conținut ridicat de grăsimi, dar în mod clar efectul hrănirii prelungite cu conținut ridicat de grăsimi în studiul nostru este de a crește atât ARNm, cât și activitatea acestei enzime și acest lucru este în concordanță cu creșterea MUFA conținutul fracțiunilor de trigliceride și fosfolipide.

Importanța SREBP-1c în reglarea metabolismului lipidic este ilustrată de șoarecii transgenici care exprimă o formă trunchiată constitutiv activă a SREBP-1c. Acești șoareci au transcrierea crescută a tuturor enzimelor necesare pentru sinteza acizilor grași nesaturați (27), sinteza crescută a lipidelor hepatice, în special MUFA și steatoza hepatică (39). În plus, șoarecii transgenici SREBP-1c, precum șoarecii B6, au scăzut trigliceridele serice; se crede că acest lucru se datorează inducției de patru ori a transcripției lipoprotein lipazei de către SREBP-1c, rezultând un clearance crescut al trigliceridelor (39). În schimb, șoarecii ob/ob cu un knockout suprapus de SREBP-1 nu dezvoltă steatoza masivă caracteristică șoarecilor ob/ob. Astfel, SREBP-1 pare a fi necesar și suficient pentru dezvoltarea steatozei.

Activarea SCD1 pare, de asemenea, necesară pentru dezvoltarea steatozei hepatice, deoarece șoarecii ob/ob cu o eliminare a SCD1 nu dezvoltă steatoză (22,40). Interesant este că șoarecii ob/ob cu o eliminare a SCD1 au, de asemenea, obezitate scăzută și cheltuieli de energie crescute în comparație cu șoarecii ob/ob (22). În mod similar, șoarecii knockout SCD1 fără deficit de leptină prezintă sensibilitate crescută la insulină, cheltuială energetică și oxidare a acizilor grași și sunt rezistenți la obezitatea indusă de dietă comparativ cu controalele de tip sălbatic (41). Aceste date sunt în concordanță cu rolul global al SCD1 în reglarea metabolismului energetic.

Mecanismul prin care SREBP-1c și SCD1 sunt activate de fondul genetic B6 nu este clar. Nici SREBP-1c, nici SCD1 nu se află în apropierea lociului trăsăturilor cantitative asociate până acum cu rezistența la insulină în aceste tulpini. Deoarece insulina este un regulator pozitiv cunoscut al ambelor gene, este posibil ca modificările SREBP-1c și SCD1 să fie secundare nivelurilor serice ridicate de insulină. De fapt, șoarecii B6 au niveluri de insulină de cinci ori mai mari decât 129 șoareci. Acest lucru se poate datora diferențelor în secreția de insulină de către insulițe, deoarece alte studii au arătat că șoarecii B6 au crescut secreția de insulină in vivo ca răspuns la glucoză și arginină, comparativ cu 129 de șoareci (45). Mai mult, insulele izolate de la șoareci B6 au conținut crescut de insulină și sensibilitate la glucoză comparativ cu cele izolate de la 129 șoareci (45).

Pe scurt, am caracterizat un model al sindromului metabolic în care heterogenitatea genetică și hrănirea bogată în grăsimi interacționează pentru a produce obezitate, rezistență la insulină, steatoză hepatică și hipercolesterolemie. Folosind o combinație de profilare transcripțională și lipidică, am identificat doi regulatori cheie care, cel puțin parțial, par să medieze aceste modificări: SREBP-1c și SCD1. SREBP-1c poate fi activat fie prin dietă, fie prin tulpină, în timp ce există un efect sinergic al dietei și tulpinii asupra SCD1. Propunem că aceste gene se află pe o cale finală comună în progresia sindromului metabolic și reprezintă ținte importante pentru intervenția terapeutică.