Daniele Bani

De la * Departamentul de Medicină Experimentală și Clinică, Secția de Anatomie și Histologie (Unitatea de histologie), Universitatea din Florența, Florența, Italia; † Unitatea de chirurgie plastică și ‡ Unitatea de chirurgie generală, Departamentul de Chirurgie și Medicină Translațională, Universitatea din Florența, Florența, Italia.

Alessandro Quattrini Li

De la * Departamentul de Medicină Experimentală și Clinică, Secția de Anatomie și Histologie (Unitatea de histologie), Universitatea din Florența, Florența, Italia; † Unitatea de chirurgie plastică și ‡ Unitatea de chirurgie generală, Departamentul de Chirurgie și Medicină Translațională, Universitatea din Florența, Florența, Italia.

Giancarlo Freschi

De la * Departamentul de Medicină Experimentală și Clinică, Secția de Anatomie și Histologie (Unitatea de histologie), Universitatea din Florența, Florența, Italia; † Unitatea de chirurgie plastică și ‡ Unitatea de chirurgie generală, Departamentul de Chirurgie și Medicină Translațională, Universitatea din Florența, Florența, Italia.

Giulia Lo Russo

De la * Departamentul de Medicină Experimentală și Clinică, Secția de Anatomie și Histologie (Unitatea de histologie), Universitatea din Florența, Florența, Italia; † Unitatea de chirurgie plastică și ‡ Unitatea de chirurgie generală, Departamentul de Chirurgie și Medicină Translațională, Universitatea din Florența, Florența, Italia.

Abstract

Fundal:

În medicina estetică, cele mai promițătoare tehnici de sculptură a corpului neinvaziv se bazează pe cavitația grăsimii indusă de ultrasunete. Dispozitivele cu ultrasunete liporeductive permit reducerea relevante din punct de vedere clinic a grăsimii subcutanate fără reacții adverse semnificative. Acest studiu vizează evaluarea modificărilor histologice și ultrastructurale induse de cavitația cu ultrasunete pe diferitele componente celulare ale pielii umane.

Metode:

Probele de piele cu grosime abdominală ex vivo și controlul cu ultrasunete și biopsiile de piele tratate cu ultrasunete au fost studiate histologic, morfometric și ultrastructural pentru a evalua posibilele modificări ale dimensiunii și morfologiei adipocitelor. Apoptoza adipocitelor și eliberarea trigliceridelor au fost, de asemenea, testate. Evaluarea clinică a efectelor a 4 tratamente săptămânale cu ultrasunete vs simulări a fost efectuată prin plicometrie.

Rezultate:

În comparație cu probele de control tratate cu simulări, cavitația cu ultrasunete a indus o reducere semnificativă statistic a dimensiunii adipocitelor (P 1 există o cerere crescândă de metode neinvazive de reducere a grăsimilor, care sunt la fel de eficiente, dar confortabile și sigure, cu perioade de nefuncționare minime. 2 O varietate de tratamente fizice, incluzând masaj mecanic, stimulare electrică, emisie de radiofrecvență și iradiere cu laser la nivel scăzut „rece”, au fost cercetate pentru capacitatea de a induce reducerea localizată a grăsimii.2-5 Cu toate acestea, atunci când au fost testate clinic, cele mai multe dintre ele nu au reușit să îndeplinească așteptările și unii și-au ridicat, de asemenea, preocupări de siguranță

În ciuda eficienței lor clinice fără îndoială, mecanismele biologice care stau la baza efectelor liporeuctive observate nu sunt pe deplin înțelese. S-a demonstrat că cavitația celulelor adipoase poate induce modificări focale ale membranei plasmatice și scurgeri de lipide 15, dar se știe puțin despre posibilele efecte nocive ale ultrasunetelor asupra adipocitelor, a altor tipuri de celule ale țesutului adipos (vasele de sânge și mastocitele), și țesuturile învecinate traversate de fasciculul de ultrasunete (epidermă și dermă).

Studiul actual a fost conceput pentru a evalua și cuantifica modificările histologice și ultrastructurale induse de cavitația cu ultrasunete asupra diferitelor componente celulare ale grăsimii subcutanate umane - adică adipocite, celule ale vaselor de sânge și celule adipoase perivasculară - și țesuturi superioare ale pielii, adică fibroblaste dermice și keratinocite epidermice. În acest scop, s-au folosit probe de piele ex vivo cu grosime completă prelevate la intervenția chirurgicală și biopsii subcutanate ale zonelor de piele tratate cu fals și cu ultrasunete de la pacienți individuali.

MATERIALE ȘI METODE

Acest studiu a respectat orientările Declarației de la Helsinki, astfel cum a fost modificată la Edinburgh, 2008. A fost aprobat de Comitetul de Etică al Facultății de Medicină, Universitatea din Florența, Italia. Toți subiecții și-au dat consimțământul informat în scris pentru participarea lor la studiu.

Studiu Ex Vivo

Pentru analiza morfometrică a dimensiunii adipocitelor, s-au realizat fotomicrografii digitale cu secțiuni de semitină, cu grosimea de 2 m, la microscop cu lumină (Microstar IV, Reichert, Seefeld, Germania) echipate cu o cameră video și software Eurekam-9 de înaltă rezoluție (BEL Engineering, Monza, Italia). Din fiecare specimen, au fost colectate 10 micrografii alese aleatoriu, fiecare corespunzând unei suprafețe de testare de 65.700 µm 2. Suprafața vacuolelor lipidice adipocitare secționate transversal a fost măsurată utilizând programul de analiză a imaginii ImageJ 1.33 (http://rsb.info.nih.gov/ij), la stabilirea unui prag adecvat pentru a include doar vacuolele lipidice osmiofile ale adipocite. Profilele vacuolare ≤ 1000 µm 2, în concordanță cu secțiunile transversale polare, au fost excluse. Datele au fost raportate ca valori medii (± SEM) ale grupurilor de control și ale celor tratate.

Pentru microscopia electronică de transmisie, secțiunile ultra subțiri au fost colorate cu acetat de uranil apos și subnitrat de bismut alcalin, vizualizate și fotografiate sub un microscop electronic de transmisie JEM 1010 (Jeol, Tokyo, Japonia) echipat cu o cameră digitală de înaltă rezoluție MegaView III și un software de imagine (Jeol ). Diferitele componente ale țesutului adipos subcutanat, adică adipocite, microvase de sânge și stomă interstițială, în probele martor și tratate cu ultrasunete au fost examinate și comparate cu atenție.

Măsurarea eliberării trigliceridelor a fost efectuată în volume mici de mediu condiționat, luate la 1, 15, 30 și 60 de minute după tratamentul cu ultrasunete sau fals al explantelor cutanate (n = 3). În acest scop, a fost utilizat un test TRIG (ADVIA Chemistry, Bayer, CH). Valorile, în mg/dl, au fost normalizate la greutatea specimenului de piele și exprimate ca µg/mg de țesut (greutate umedă), presupunând că P ≤ 0,05 este semnificativă.

În Studiul Vivo

Analize statistice

Parametrii cantitativi analizați au fost analizați statistic, presupunând pacienții individuali ca unități de probă (n = 3). Pentru morfometria adipocitelor și testul TUNEL, semnificația statistică a diferențelor dintre grupuri a fost evaluată prin testul t al Studentului nepereche. Curbele în timp ale nivelurilor de trigliceride în mediul condiționat de control și al probelor tratate cu ultrasunete și ale măsurătorilor plicometrice ale studiului in vivo au fost comparate prin analiza bidirecțională a varianței. În ambele cazuri, a fost utilizat software-ul statistic Graph Pad Prism 4.03 (GraphPad, San Diego, CA). O valoare P ≤ 0,05 a fost considerată semnificativă.

REZULTATE

Examinarea vizuală a secțiunilor de semitină și analiza morfometrică a țesutului adipos subcutanat al explanților ex vivo ai pielii (Fig. 1) a arătat că cavitația cu ultrasunete a indus o scădere semnificativă statistic semnificativă (-23%) a dimensiunii vacuolelor lipidice în adipocite (control: 15,654 ± 942 µm 2; cavitație: 11.423 ± 558 µm 2; P Fig. 2). La pacienții 1 și 2 (biopsiile au fost luate la 1 zi după ultima aplicare cu ultrasunete), tratamentul a determinat o reducere semnificativă (-26%) a dimensiunii vacuolelor lipidice adipocite (martor: 11.908 ± 373 µm 2; cavitație: 8637 ± 530 µm 2; P 2; cavitație: 6323 ± 200 µm 2; P Fig. 3), nu a arătat diferențe semnificative în raportul de etichetare/dezetichetare nucleară între zonele de control și de testare a țesutului adipos (control: 0,09 ± 0,01; cavitație: 0,11 ± 0,03; valori combinate de la cei 3 pacienți).

ultrastructurale

Constatări histologice și morfometrice ale adipocitelor subcutanate din explante cutanate ex vivo. Cavitația cu ultrasunete determină o reducere semnificativă statistic a suprafeței medii a secțiunii transversale a vacuolelor lipidice, legată de volumul total al adipocitelor (testul t Student, n = 3 biopsii pe grup experimental). Fixarea/colorarea OsO4 și contracolorarea albastru de toluidină. Bare = 10 um.

Constatări histologice și morfometrice ale adipocitelor subcutanate de la biopsii cutanate abdominale controlate sau pretratate cu ultrasunete, efectuate la momentele notate după tratament. Cavitația cu ultrasunete determină o reducere semnificativă statistic a suprafeței medii a secțiunii transversale a vacuolelor lipidice, legată de volumul total al adipocitelor (testul t Student, n = 10 câmpuri microscopice per biopsie). Nu s-au observat diferențe între probele martor de la cei 2 pacienți. Fixarea/colorarea OsO4 și contracolorarea albastru de toluidină. Bare = 10 um.

Testul TUNEL efectuat pentru a detecta adipocitele apoptotice în biopsiile subcutanate din pielea abdominală pretratată cu falsificare sau cu ultrasunete. Săgețile indică nucleele apoptotice. Nu au fost observate sau măsurate diferențe între cele două grupuri. Bare = 10 um.

Analiza ultrastructurală a țesutului adipos din explante cutanate ex vivo tratate cu falsitate a demonstrat adipocite normale, arătând o vacuolă lipidică mare, osmiofilă, cu o margine electronică-lucentă periferică, contiguă unui strat citoplasmatic subțire care conține organite slabe, microvesicule de pinocitoză și picături lipidice mici (Fig. 4A). Celulele erau înconjurate de o membrană bazală continuă. Țesutul conjunctiv interstițial a fost compus dintr-o matrice liberă, electron-lucentă, care conține fascicule subțiri de fibre de colagen. Microvasele din sânge, în principal capilare, au prezentat, de asemenea, un aspect normal (Fig. 4B): celulele endoteliale au prezentat membrane plasmatice intacte, conțin numeroase microvezicule de transcitoză și au fost unite de complexe joncționale pentru a forma un endoteliu continuu; erau înconjurați de o membrană bazală care adăpostea câteva pericite. Caracteristicile normale ale adipocitelor și ale capilarelor sanguine au fost, de asemenea, observate în biopsiile țesutului adipos prelevate din zonele tratate cu fals din cei 3 pacienți înscriși în studiu (neprezentat).

Imagini reprezentative de microscopie electronică cu transmisie a țesutului adipos din explante cutanate ex vivo tratate cu fals. A, Adipocitele prezintă caracteristici normale. B, Interstitiu de control al țesutului adipos prezintă, de asemenea, morfologie normală. BM, membrana bazală; E, eritrocit; CE, celulă endotelială; L, vacuole lipidice; PC, pericit; pm, membrana plasmatică; pv, vezicula pinocitoza. Bare = 1 µm.

În schimb, țesutul adipos subcutanat al explanelor cutanate ex vivo tratate cu ultrasunete a prezentat diferențe bine apreciabile în comparație cu specimenele tratate cu fals. În special, multe adipocite au prezentat anomalii deosebite, constând în gruparea microvesiculelor și rupturi focale ale marginii citoplasmatice periferice (Fig. 5). Astfel de rupturi au fost de obicei limitate la zone mici ale suprafeței celulei, cu diametrul de aproximativ 0,5-1,5 µm, dar suficient de mari pentru a permite scurgerea picăturilor de trigliceride din vacuolul citoplasmatic interior către spațiul extracelular. De remarcat, nu s-au observat semne de dispariție a adipocitelor sau resturi de celule. Stroma interstițială a fost compusă dintr-o matrice liberă, electron-lucentă, care conține fascicule subțiri de fibre de colagen. Picături mici de lipide au fost adesea întâlnite (Fig. 5). Microvesele din sânge, în principal capilare, au prezentat un aspect normal (Fig. 6): celulele endoteliale au prezentat membrane plasmatice intacte, conțin numeroase microvezicule de transcitoză și au fost alăturate de complexe joncționale pentru a forma un endoteliu continuu și au fost înconjurate de o membrană bazală continuă care adăpostește unele pericite. . Eritrocitele intravasculare au prezentat, de asemenea, caracteristici normale. Mastocitele perivasculare nu au prezentat semne de activare și descărcare a granulelor (nereprezentate).

Imagini reprezentative de microscopie electronică cu transmisie a țesutului adipos din explante cutanate ex vivo tratate cu ultrasunete. Panouri superioare: sunt afișate două adipocite adiacente. BM, membrane bazale; Cy, citoplasma; L, vacuole lipidice; pv, vezicule de pinocitoză. Vârfurile săgeții din inserție (b) indică 2 zone, cu grupuri microvesiculare, în care citoplasma pare să se rupă. Panouri centrale și inferioare: adipocite anormale supuse eliberării lipidelor. L, vacuole lipidice; LD, picături lipidice în matricea extracelulară. Asteriscurile indică rupturi citoplasmatice focale care permit scurgerea picăturilor de trigliceride în interstițiu. Bare = 1 µm.

Imagini reprezentative de microscopie electronică cu transmisie a țesutului adipos din explante cutanate ex vivo tratate cu ultrasunete. Celulele endoteliale (EC) ale microvaselelor din sânge prezintă caracteristici normale. BM, membrana bazală; Cy, citoplasma adipocitelor; E, eritrocite; jc, complex joncțional; L, vacuole lipidice; pv, vezicule de pinocitoză. Bare = 1 µm.

Testul eliberării trigliceridelor în mediul condiționat al explanelor cutanate ex vivo a arătat o creștere legată de timp atât a specimenelor tratate cu falsificare, cât și a ultrasunetelor (Fig. 7). De remarcat, cavitația a indus o eliberare semnificativ mai mare de trigliceride în comparație cu martorii, cu un vârf la 15 minute (P Fig. 8). Aceste caracteristici nu au fost găsite niciodată în adipocitele tratate fals și sunt în concordanță cu reducerea marcată a volumului celular, posibil legată de descărcarea trigliceridelor. În conformitate cu această constatare, picături lipidice rare au fost adesea întâlnite în stroma țesutului adipos în vecinătatea vaselor de sânge (Fig. 8).

Imagini reprezentative de microscopie electronică cu transmisie a țesutului adipos din zone cutanate abdominale pretratate cu ultrasunete (1 zi). A, Un adipocit care prezintă profile neregulate, înfășurate și picături de lipide multiple (dintre care unele sunt marcate de asteriscuri) grupate în marginea citoplasmatică. B, interstitiul țesutului adipos care prezintă microvase sanguine normale și picături lipidice libere (săgeți) în apropierea lor. BM, membrana bazală; Cy, citoplasma adipocitelor; CE, celule endoteliale; L, vacuole lipidice. Bare = 1 µm.

Evaluarea masei țesutului adipos subcutanat prin plicometrie a arătat o scădere legată de timp a valorilor măsurate în regiunile pielii abdominale tratate cu ultrasunete în comparație cu zonele de control corespunzătoare (Fig. 9).

Procentul de modificări ale grosimii pliurilor cutanate abdominale tratate cu fals și cu ultrasunete măsurate prin plicometrie la 4 tratamente săptămânale și la 1 săptămână după ultimul tratament (+1). O scădere semnificativă statistic legată de timp a fost observată în zonele cutanate tratate cu ultrasunete, comparativ cu controalele tratate cu fals. Analiza bidirecțională a varianței și a post-testului lui Bonferroni: n = 3, * P 2 Dispozitiv cu ultrasunete de contur, poate produce o reducere substanțială a dimensiunii celulelor adipoase și a grăsimii subcutanate, confirmând observațiile clinice anterioare ale unui efect liporeductiv marcat al acestei tehnici. 8,14 Acest studiu oferă, de asemenea, dovezi circumstanțiale pentru mecanismul de acțiune al ultrasunetelor asupra adipocitelor. Datele histomorfometrice indică faptul că expunerea explantelor cutanate cu grosime completă la 2 cicluri ultrasunete scurte (6 s fiecare), cu o putere de energie similară cu cea utilizată în scopuri clinice, a dus la o scădere semnificativă statistic a adipocitelor subcutanate (-23%, P 15 Pe de altă parte, integritatea componentelor vasculare ale țesutului adipos poate favoriza îndepărtarea picăturilor de grăsime interstițială și a mediatorilor proinflamatori putativi eliberați din adipocite, posibil prin drenajul limfatic.

Observațiile histomorfometrice și ultrastructurale de mai sus se potrivesc bine cu rezultatele testului trigliceridelor în mediul de incubație al explanelor ex vivo ale pielii, indicând faptul că cavitația indusă de ultrasunete determină o eliberare semnificativă statistic a trigliceridelor din țesutul adipos în lichidul interstițial, după cum sa raportat anterior . 15.16

Prezentele constatări sunt în concordanță cu cele din studiile anterioare porcine in vivo, atât cu Conturul I, cât și cu Conturul Med 2, în care cavitația indusă de ultrasunete s-a dovedit a determina o reducere selectivă a celulelor adipoase, fără a afecta leziunile pielii, vaselor, nervilor sau țesutului conjunctiv . 7,15 Similar cu cele prezentate, sa raportat că tratamentul cu ultrasunete induce formarea mai multor pori mici în adipocite, permițând dispersia trigliceridelor în spațiul interstițial și în vasele limfatice. 7.15 Este de conceput ca trigliceridele să poată fi apoi absorbite și metabolizate de lipazele endogene în glicerol și acizi grași liberi și încorporate în rezerva totală de lipoproteine. De remarcat, lipidele serice au fost nemodificate 8,12,15 sau ușor crescute, dar totuși în intervalul normal, 14 la animalele experimentale și la pacienții supuși tratamentelor cu ultrasunete liporeductive, reprezentând siguranța substanțială a acestei proceduri din punct de vedere metabolic. În contrast cu un raport anterior, 16 nu am observat semne de dezorganizare a rețelei de colagen de țesut adipos sau de inducere a apoptozei adipocitelor, dar această discrepanță se datorează în mod rezonabil expunerii mult mai lungi (10 minute) a probelor de piele la ultrasunetele adoptate în studiul notat. 16

CONCLUZII

În concluzie, acest studiu întărește în continuare viziunea actuală conform căreia cavitația cu ultrasunete transcutanată neinvazivă, una dintre cele mai căutate proceduri chirurgicale plastice și estetice, este o tehnologie promițătoare pentru reducerea localizată a grăsimilor. Generalizarea sensului studiului nostru este împiedicată de faptul că am înscris un număr limitat de pacienți; totuși, consistența rezultatelor observate susține noțiunea că Med 2 Contour, datorită designului său unic, oferind un câmp cu ultrasunete slab concentrat în tamponul de grăsime subcutanat, poate fi un instrument eficient și sigur în scopuri liporeductive.

MULȚUMIRI

Îl recunoaștem pe Dr. Moreno Naldoni, MSEE, pentru că a furnizat cu amabilitate dispozitivul Med 2 Contour și Dr. Anna Paola Cellai, DSc, pentru ajutor iscusit în analiza trigliceridelor.

Note de subsol

Dezvăluire: Autorii nu au niciun interes financiar de declarat în legătură cu conținutul acestui articol. Taxa de procesare a articolelor a fost achitată de General Project Ltd., Montespertoli, Italia.