Departamentul de afiliere pentru nutriție monogastrică, Institutul Kielanowski de fiziologie și nutriție a animalelor Academia Poloneză de Științe, Jabłonna, Polonia

interactive

Departamentul de afiliere pentru nutriție monogastrică, Institutul Kielanowski de fiziologie și nutriție a animalelor Academia Poloneză de Științe, Jabłonna, Polonia

Departamentul de afiliere pentru nutriție monogastrică, Institutul Kielanowski de fiziologie și nutriție a animalelor Academia Poloneză de Științe, Jabłonna, Polonia

Departamentul de afiliere pentru nutriție monogastrică, Institutul Kielanowski de fiziologie și nutriție a animalelor Academia Poloneză de Științe, Jabłonna, Polonia

  • Marcin Taciak,
  • Marcin Barszcz,
  • Anna Tuśnio,
  • Barbara Pastuszewska

Cifre

Abstract

Citare: Taciak M, Barszcz M, Tuśnio A, Pastuszewska B (2015) Efecte interactive ale carbohidraților indigestibili, tipul de proteine ​​și nivelul de proteine ​​asupra biomarkerilor de sănătate a intestinului gros la șobolani. PLoS ONE 10 (11): e0142176. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0142176

Editor: Mihai Covasa, Western University of Health Sciences, STATELE UNITE

Primit: 10 decembrie 2014; Admis: 18 octombrie 2015; Publicat: 4 noiembrie 2015

Disponibilitatea datelor: Toate datele relevante se află în hârtie și în fișierele sale de informații de suport.

Finanțarea: Acest studiu a fost susținut financiar de Ministerul Științei și Învățământului Superior din Polonia, Grant No. N N311 046634. Finanțatorii nu au avut nici un rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Materiale și metode

Animale și diete

Măsurarea pH-ului digestei și a SCFA

PH-ul Digesta a fost măsurat cu un pH-metru WTW/340 pH (WTW GmbH, Weilheim, Germania) și analiza SCFA a fost efectuată utilizând cromatograful de gaz HP 5890 Series II (Hewlett-Packard, Waldbronn, Germania) cu acid izocaproic ca standard intern [9].

Analiza fenolului și a p-crezolului

Concentrațiile de fenol și p-crezol în digestia cecală au fost evaluate pe baza metodelor descrise anterior [10] cu următoarele modificări. Fiecare probă (1,0 g) a fost amestecată cu 1,5 ml metanol și incubată timp de 1 oră pe gheață cu vortexare frecventă. După incubare, probele au fost centrifugate la 12.000 rpm timp de 15 minute la 4 ° C. Supernatantul (500 μL) a fost transferat în flacoane și amestecat cu 15 μL de 5-metilindol ca standard intern. A fost analizat în continuare folosind cromatograful de gaz HP 5890 Series II (Hewlett-Packard, Waldbronn, Germania) cu un detector de ionizare a flăcării și coloană capilară de silice condensată Supelco Nukol ™ (Supelco, Bellefonte, SUA) (60 m × 0,32 mm ID; 0,25 μm). Temperatura cuptorului a fost setată la 55 ° C timp de 1 min, apoi ridicată la 180 ° C la o rată de 20 ° C/min și menținută timp de 25 min. Temperatura a fost apoi ridicată la 200 ° C la 20 ° C/min și menținută timp de 27 min. Temperatura injectorului și a detectorului a fost de 220 ° C și heliul a fost utilizat ca gaz purtător. Durata totală de rulare a fost de 60,25 min. Concentrațiile de fenol și p-crezol au fost calculate pe baza curbelor standard.

Analiza β-glucuronidazei

Activitatea β-glucuronidazei în probele de digestă cecală a fost cuantificată spectrofotometric [9], pe baza cantității de fenolftaleină eliberată de substrat (fenolftaleină β-D-glucuronidă). Absorbanța a fost măsurată la 540 nm folosind un spectrofotometru Unicam UV 300 (Thermo-Spectronic, Cambridge, Marea Britanie).

Analiza amoniacului

Concentrația de amoniac în conținutul de colon a fost cuantificată spectrofotometric pe baza reacției ionului de amoniu cu reactivul Nessler. Proba (0,5 g) a fost amestecată cu 2 ml de apă ultra pură, acidulată cu HCI 1M pentru a regla pH-ul la 5,0-6,0 și s-a omogenizat timp de 30 s la viteză mare. Probele au fost apoi centrifugate la 10.000 rpm timp de 10 minute la 4 ° C. Supernatantul (1,0 ml) a fost transferat într-un tub nou și incubat cu aproximativ 0,18 g de carbonat de magneziu bazic timp de 20 de minute la temperatura camerei, cu amestecare frecventă pentru îndepărtarea ionilor feroși, ceea ce ar putea denatura rezultatele analizei. După incubare, probele au fost centrifugate la 3000 rpm timp de 10 min. Următorii pași au fost apoi realizați utilizând platforma de diagnostic multidisciplinară Maxmat PL (Erba Diagnostics France SARL, Montpellier, Franța). Supernatantul (5 μL) a fost plasat pe o placă de micro titrare, diluat cu 220 μL de apă ultra pură și amestecat cu 25 μL de reactiv Nessler. Absorbanța a fost măsurată imediat la 425 nm și concentrația de amoniu a fost calculată din curba standard preparată folosind soluție de clorură de amoniu.

Cecul și histologia colonului

Probele de țesut au fost încorporate în parafină, tăiate în secțiuni de 5 μm și colorate cu hematoxilină și eozină. Adâncimea criptelor și grosimea myenteronului (15 măsurători pe lamă, două lamele pe probă) au fost măsurate folosind microscopul cu lumină Zeiss Axio Star Plus (Carl Zeiss, Göttingen, Germania) și software-ul de analiză a imaginii Axio Vision LE Release 4.5 (Carl Zeiss, 2002– 2005).

Izolarea colonocitelor și analiza cometei alcaline

Testul cometei alcaline a fost efectuat conform instrucțiunilor producătorului utilizând Trevigen CometSlide ™ (Trevigen, Gaithersburg, MD, SUA) și unitatea de electroforeză orizontală. Imaginile cometelor au fost vizualizate prin colorare cu bromură de etidiu (2 μg/mL) și analizate la o mărire 40X, folosind un microscop fluorescent Olympus BX51 (Olympus Corp., Tokyo, Japonia) echipat cu un filtru de excitație de 510-550 nm și un filtru de barieră de 590 nm . Cometele au fost analizate utilizând software-ul de imagistică Cell D (Olympus Soft Imaging Solutions GmbH, Munster, Germania). Pentru fiecare eșantion, 75 de comete selectate aleatoriu au fost alocate la cinci clase de la 0 (nedeteriorat) la 4 (maxim deteriorat). „Intensitatea cozii” a fost exprimată în unități arbitrare [11] și a variat de la 0 la 400.

analize statistice

Datele au fost analizate prin analiza în trei direcții a varianței (ANOVA), urmată de testul post hoc Tukey HSD pentru determinarea diferențelor dintre tratamente. În plus, au fost calculați coeficienții de corelație ai lui Pearson între parametrii analizați. Toate analizele au fost efectuate folosind STATGRAPHICS ® Centurion XVI ver. Pachetul statistic 16.1.03 (StatPoint Technologies, Inc., Warrenton, Virginia, SUA). Efectele și corelațiile au fost considerate semnificative la P ≤ 0,05.

Rezultate

Creșterea în greutate corporală și parametrii cecali

Dietele experimentale au afectat parametrii legați de fermentația cecală, inclusiv greutatea relativă a digestei și țesutului cecal și pH-ului digestei cecale (Tabelul 2), dar nu au afectat aportul de hrană (datele nu sunt prezentate) sau creșterea în greutate corporală a șobolanilor. Greutatea relativă a digestei cecale a fost mai mare la șobolanii hrăniți cu PPC și HP decât la cei hrăniți cu diete CAS și LP, respectiv (P = 0,001). Greutatea relativă a țesutului cecal a fost, de asemenea, mai mare la șobolanii hrăniți cu PPC decât dieta CAS (P = 0,002), dar nu a fost influențată de nivelul proteinelor. Tipul de carbohidrați nedigerabili a afectat atât digestele cecale, cât și greutățile țesuturilor, care au fost mai mari la șobolanii hrăniți cu pectină decât la cei hrăniți cu celuloză și RPS (P ≤ 0,001). Cu toate acestea, efectul glucidelor asupra greutății țesutului cecal s-a găsit numai la șobolanii hrăniți cu CAS și nu la cei hrăniți cu PPC (P = 0,017). Șobolanii hrăniți cu diete cu pectină au avut greutăți similare ale țesutului cecal, indiferent de tipul de proteină; întrucât șobolanii hrăniți cu RPS și celuloză cu PPC au avut greutăți mai mari ale țesutului cecal decât animalele hrănite cu diete CAS.

Datele sunt prezentate ca valori medii ± SEM.

PH-ul digestei cecale a fost mai mare la șobolanii hrăniți cu celuloză decât la cei hrăniți cu pectină și RPS și a fost afectat de interacțiunile dintre factorii experimentali. Șobolanii hrăniți cu diete PPC sau HP au avut un pH digestiv mai mic decât șobolanii din diete CAS sau LP, cu excepția șobolanilor hrăniți cu diete PPC sau HP cu RPS (P = 0,001 și P = 0,043). A existat, de asemenea, o interacțiune semnificativă între tipul de proteină și nivel (P = 0,026). Dietele cu un nivel mai scăzut de proteine ​​furnizate de cazeină au crescut pH-ul, în timp ce aceeași cantitate de proteine ​​din cartof a scăzut pH-ul în comparație cu un nivel mai ridicat de proteine. Greutatea cecală relativă a fost corelată pozitiv cu greutatea conținutului cecal (r = 0,74, P = 0,005) și invers corelată cu pH-ul digestei (r = –0,63, P = 0,027).

Acizi grași cu lanț scurt

Concentrațiile de acizi acetic și propionic, precum și suma SCFA au fost mai mari în digestia cecală a șobolanilor hrăniți cu LP decât dietele HP (P = 0,043, P = 0,004 și, respectiv, P = 0,022) (Tabelul 3). Carbohidrații nedigerabili și tipul de proteine ​​nu au avut niciun efect asupra concentrației SCFA, dar interacțiunea semnificativă între tipul de proteină, nivelul proteinei și concentrațiile afectate de glucide de acetic (P = 0,022), izobutiric (P = 0,004), izovaleric (P = 0,001) și valeric acizi (P = 0,047), precum și suma SCFA (P = 0,039). Greutatea relativă a digestei cecale a fost invers corelată cu acidul propionic (r = –0,68, P = 0,014) și concentrația acidului butiric (r = –0,75, P = 0,005) și a avut tendința de a fi corelată invers cu concentrația totală a SCFA = - 0,55, P = 0,060). Rezerva Cecal de acid butiric a fost direct proporțională cu pH-ul digestei (r = 0,60, P = 0,038).

Datele sunt prezentate ca valori medii ± SEM.

Datele sunt prezentate ca valori medii ± SEM.

Fenol și p-crezol

Tipul de proteine ​​a afectat concentrația de fenol (Tabelul 5), care a fost mai mare la cecumul șobolanilor hrăniți cu CAS decât la cei hrăniți cu diete PPC (P = 0,029). Factorii experimentali nu au avut niciun efect asupra concentrațiilor de fenol sau p-crezol. Concentrația de p-crezol a fost corelată pozitiv cu grupul cecal de acizi valerici (r = 0,67, P = 0,018) și izovalerici (r = 0,67, P = 0,017). Rezerva Cecal de p-crezol a fost semnificativ mai mare la șobolanii hrăniți cu diete PPC decât la cei hrăniți cu diete CAS (P = 0,011).

Datele sunt prezentate ca valori medii ± SEM

β-glucuronidaza

Activitatea β-glucuronidazei, exprimată per g de digestă cecală, nu a fost afectată de factori experimentali (Tabelul 5), totuși a fost evident un efect semnificativ al interacțiunii dintre tipul de proteină, nivelul de proteine ​​și carbohidrați (P = 0,033). Cel mai scăzut nivel de activitate a β-glucuronidazei a fost în cecul șobolanilor hrăniți cu dietă cu PPC cu 14% proteină brută suplimentată cu RPS, în timp ce cel mai ridicat a fost la șobolanii hrăniți PPC cu 20% proteină brută suplimentată cu pectină. Activitatea β-glucuronidazei a fost direct proporțională cu fondul cecal de acizi izobutirici (r = 0,58, P = 0,047) și izovalerici (r = 0,63, P = 0,028). Activitatea β-glucuronidazei totale, exprimată per cecum, a fost semnificativ influențată de carbohidrați (P = 0,044) și a fost mai mare la șobolanii hrăniți cu pectină decât la cei hrăniți cu RPS.

Amoniac

Concentrația de amoniac în digesta colonică a fost mai mare la șobolanii hrăniți cu PPC comparativ cu cei hrăniți cu CAS (P = 0,011) și la șobolanii hrăniți cu RPS și pectină comparativ cu cei hrăniți cu celuloză (P = 0,004) (Fig. 1). Nivelul și interacțiunile proteinelor nu au afectat concentrația de amoniac. Concentrația de amoniac în digesta colonică a fost invers corelată cu pH-ul digestei cecale (r = –0,71, P = 0,009) și corelată pozitiv cu greutatea relativă a țesutului cecal (r = 0,72, P = 0,008).

Barele de erori reprezintă o eroare standard a mediei. Mijloacele cu litere diferite diferă semnificativ (P Tabelul 6. Parametrii morfologici (μm) ai Cecum și daunelor ADN-ului colonului și colonocitelor (unități de intensitate a cozii) la șobolani.

Datele sunt prezentate ca valori medii.

Deteriorarea ADN-ului

Măsura deteriorării ADN-ului în celulele epiteliale colonice, exprimată ca „Unități de intensitate a cozii”, a fost afectată de nivelul proteinelor din dietă (Tabelul 6). Șobolanii hrăniți cu diete HP au avut mai puține daune ADN comparativ cu șobolanii hrăniți cu diete LP (P Tabelul 7. Rezumatul efectelor factorilor experimentali asupra biomarkerilor sănătății intestinului gros la șobolani.

Modificările (↑ creștere sau ↓ scădere) ale parametrilor sunt prezentate în raport cu dietele de cazeină, dietele cu proteine ​​mai mici și, respectiv, celuloza. PPC - concentrat de proteine ​​din cartof, CAS - cazeină, HP - dietă cu proteine ​​mai ridicate, LP - dietă cu proteine ​​mai scăzute, P - pectină, amidon de cartof rezistent la RPS.

Discuţie

Se știe că proteina din cartof este mai rezistentă la digestie decât cazeina și, prin urmare, scade creșterea în greutate corporală la șobolanii în creștere [12]. Animalele mai în vârstă, utilizate în studiul nostru, păreau a fi insensibile la digestibilitatea mai mică a PPC, astfel încât impactul său negativ asupra creșterii nu a fost observat. Cu toate acestea, alimentarea cu diete PPC și HP a crescut greutatea relativă a digestiei cecale la șobolani, sugerând un aflux mai mare de proteine ​​nedigerate și acumularea acesteia în cecum. Carbohidrații nedigerabili au afectat, de asemenea, parametrii cecali. Pectina părea să exercite cel mai puternic efect asupra greutății relative a digestei și țesutului cecal, care poate fi atribuită fermentabilității sale mai mari în comparație cu alți carbohidrați [7]. Corelațiile dintre greutatea cecală relativă, greutatea relativă a conținutului cecal și pH-ul digestei pot sugera că un mediu mai acid, cauzat de fermentarea indigestibilă a carbohidraților, a contribuit la extinderea cecală, care a fost găsită și în alte studii [12, 13].

Descoperirile noastre referitoare la rezerva cecală de SCFA confirmă studii anterioare legate de digestibilitatea redusă a proteinei din cartof [12, 14] și sugerează că fermentația sa duce la o producție mai mare de acizi acetici, izobutirici și izovalerici. Acidul acetic poate proveni din fibre dietetice și aminoacizi neesențiali, în timp ce izoacizii sunt produsele finale ale catabolismului bacterian al aminoacizilor esențiali, adică valină și leucină [15]. Rezerva cecală mai mare de BCFA la șobolanii hrăniți cu diete HP poate fi atribuită unui aport mai mare de aminoacizi cu lanț ramificat.

Activitatea β-glucuronidazei este un biomarker al riscului de carcinogeneză, bazat pe hidroliza conjugatelor glucuronide și activarea agenților cancerigeni și a toxinelor din intestinul gros [25]. Fibrele dietetice pot reduce riscul dezvoltării cancerului de colon prin efectul său inhibitor asupra activității acestei enzime [26]. Efectele benefice ale RPS asupra activității β-glucuronidazei observate în studiul nostru sunt în concordanță cu rezultatele raportate anterior [1]. Mecanismul din spatele acestor efecte rămâne neclar, dar poate fi legat de modificările compoziției microflorei induse de diferite tratamente dietetice. Unele specii bacteriene, inclusiv Bacteroides [27], Bifidobacterium, Eubacterium, Ruminococcus, E. coli, Lactobacillus, Staphylococcus și Clostridium [25], prezintă niveluri ridicate de activitate a β-glucuronidazei și orice schimbări ale populației lor din cauza factorilor experimentali trebuie să fie considerat.

Efectul factorilor experimentali asupra grosimii myenteronului a fost găsit numai în colon, unde a fost crescut prin hrănirea celulozei, comparativ cu pectina. S-a raportat că o grosime mai mare a myenteronului corespunde cu motilitatea intestinală crescută [36]. Prin urmare, hipertrofia mienterică din colon poate, de asemenea, îmbunătăți efectele celulozei asupra concentrațiilor de amoniac, facilitând îndepărtarea amoniacului din intestinul gros prin motilitate intestinală sporită. Această presupunere este susținută de corelații semnificative între grosimea myenteronului în colon, parametrii cecali și concentrația de amoniac.

Concluzii