Abstract


  • 1 divizie de medicamente pentru alergii, pulmonare și de îngrijire critică, Școala de Medicină a Universității Vanderbilt, Nashville, Tennessee

  • 2 Divizia de Cardiologie

  • 3 Departamentul de farmacologie

  • 4 Departamentul de patologie, microbiologie și imunologie

  • 5 Catedra de anestezie

  • 6 Departamentul de Biologie a Cancerului și

  • 7 Departamentul de Oncologie a Radiațiilor, Centrul Medical al Universității Vanderbilt, Nashville, Tennessee
  • Abstract
  • Text complet
  • Referințe
  • Suplimente
  • Citat de
  • PDF
  • Legate de

Abstract

Raţional: În hipertensiunea arterială pulmonară ereditară cu mutație a liniei germinale în gena receptorului proteinei morfogenetice osoase tip 2 (BMPR2), disfuncția ventriculului drept (RV) este asociată cu lipotoxicitatea RV; cu toate acestea, mecanismul de bază pentru acumularea lipidelor nu este cunoscut.

receptorul

Obiective: Am emis ipoteza că acumularea de lipide în cardiomiocite cu mutație BMPR2 are loc din cauza modificărilor transportului lipidelor și a oxidării afectate a acizilor grași (FAO), care este agravată de o dietă bogată în lipide (occidentale) (WD).

Metode: Am folosit un model de șoarece transgenic de hipertensiune arterială pulmonară cu BMPR2 mutant și am generat o linie celulară cardiomiocitară cu mutație BMPR2. Microscopia electronică și analiza metabolomică au fost efectuate pe RV-uri de șoarece.

Măsurători și rezultate principale: Prin analiza metabolomicii, am constatat o creștere a acizilor grași cu lanț lung în VRV mutant BMPR2 de șoarece comparativ cu martorii, care s-au corelat cu indicele cardiac. Cardiomiocitele mutante BMPR2 au crescut lipidele în comparație cu martorii. Măsurarea directă a FAO în RV mutant BMPR2 alimentat cu WD a arătat consumul de oxigen legat de palmitat afectat, iar analiza metabolomicii a arătat indicii reduși ai FAO. Folosind atât VRV mutant de șoarece BMPR2, cât și cardiomiocite, am constatat o creștere a absorbției de 14 C-palmitat și a transportorului de acizi grași CD36, care a fost în continuare exacerbată de WD.

Concluzii: Luate împreună, datele noastre sugerează că deficitul FAO și expresia crescută a transportorului de lipide CD36 sunt mecanisme cheie care stau la baza depunerii lipidelor în BMV2-mutant RV, care sunt exacerbate în prezența lipidelor dietetice. Aceste constatări sugerează caracteristici importante care conduc la lipotoxicitatea RV în hipertensiunea arterială pulmonară și pot indica noi domenii de intervenție terapeutică.

Acumularea lipidelor în ventriculul drept (RV) cu mutația receptorului proteinei morfogenetice osoase tip 2 (BMPR2) se arată că este asociată cu eșecul hipertrofiei RV atât în ​​modelul animal, cât și în forma ereditară umană de hipertensiune arterială pulmonară (HAP), dar mecanismele de acumulare a lipidelor în VD sunt încă necunoscute.

Studiul actual dezvăluie principalele mecanisme care conduc la lipotoxicitatea RV în PAH ereditar folosind o nouă linie de celule cardiomiocitare cultivate cu expresie mutantă BMPR2 și un model transgenic de șoarece de PAH cu aceeași mutație BMPR2. Studiile noastre demonstrează că oxidarea afectată a acizilor grași este mecanismul cheie care stă la baza acumulării lipidelor în RV mutant BMPR2, iar expresia crescută a moleculei transportoare de lipide CD36 contribuie, de asemenea, la acumularea lipidelor. Acest studiu demonstrează în continuare că aceste modificări sunt exacerbate în prezența lipidelor dietetice crescute. Aceste descoperiri vor ajuta la dezvoltarea de noi domenii de intervenție terapeutică.

Hipertensiunea arterială pulmonară (HAP) este o boală devastatoare caracterizată prin obliterarea progresivă a vasculaturii pulmonare, care determină disfuncția ventriculului drept (RV) care duce la insuficiență cardiacă dreaptă și, în cele din urmă, la moarte (1). S-a raportat că pacienții cu HAP ereditar (HPAH) cu mutații ale liniei germinale în gena receptorului de proteină morfogenetică de tip 2 (BMPR2) prezintă aproximativ 10 ani mai devreme și cu boală mai severă și hemodinamică compromisă comparativ cu pacienții cu HAP idiopatică (2-5), sugerând că în HAP, mutațiile BMPR2 sunt asociate cu fenotipuri distincte ale bolii RV. Semnalizarea superfamiliară a factorului de creștere transformator-β/BMP a fost legată de dezvoltarea hipertrofiei ventriculare stânga neadaptatoare (6), deși se știe puțin despre această cale în VD. La omul cu HPAH și în modelele animale HPAH am publicat că expresia BMPR2 mutantă în RV este asociată cu eșecul hipertrofiei RV, creșterea genelor transformatoare de semnalizare a factorului de creștere β, anomalii ale genelor metabolice ale acizilor grași și creșterea depunerii lipidelor în Cardiomiocite RV (7), implicând o cardiomiopatie lipotoxică (8, 9), dar mecanismul de acumulare a lipidelor RV în PAH este în prezent necunoscut.

În cardiomiocite, acumularea de lipide s-ar putea datora absorbției crescute de lipide libere prin intermediul moleculelor transportoare de acizi grași, alterării oxidării acizilor grași (FAO) sau creșterii sintezei lipidelor în interiorul celulei. În cardiomiocite, acizii grași sunt sursa predominantă de energie. Cu toate acestea, cardiomiocitele sunt capabile de plasticitate metabolică și, prin urmare, se pot adapta la schimbările din mediu prin trecerea la alte substraturi (10). Deși trecerea mitocondrială de la acizi grași la glucoză poate fi un mediator critic al disfuncției RV în HAP, dovezi în creștere sugerează că afectarea metabolismului acizilor grași și disfuncția mitocondrială poate promova depunerea lipidelor și eșecul RV (7, 11-13). În plus, o dietă bogată în lipide (occidentale) (WD) poate induce, de asemenea, acumularea de lipide cardiomiocitare și poate promova disfuncția RV (14). Prin urmare, am emis ipoteza că acumularea de lipide în cardiomiocite cu mutație BMPR2 are loc din cauza FAO afectată, care este exacerbată de WD. Am testat această ipoteză folosind un model transgenic de șoarece de PAH cu expresie omniprezentă a BMPR2 mutant și, de asemenea, in vitro folosind o nouă linie de celule cardiomiocitare cu mutație BMPR2. Unele dintre rezultatele acestor studii au fost raportate anterior sub forma unui rezumat (15, 16).

Consultați M etode în suplimentul online pentru detalii.

figura 1. Acizii grași cu lanț lung (LCFA) sunt crescuți în ventriculul drept al șoarecelui (RV) în prezența mutației receptorului proteinei morfogenetice osoase tip 2 (BMPR2). (A) Cantitatea totală de LCFA în control (cutie alba; n = 7), control cu ​​bandaj arterial pulmonar (PAB; cutie gri deschis; n = 8), BMPR2 R899X cu indice cardiac normal (CI; cutie gri închis; n = 7) și BMPR2 R899X cu CI scăzut (cutie neagră; n = 8). *P # P R899X cu CI normal (cercuri gri) și BMPR2 R899X cu CI scăzut (cercuri negre).

Pentru a arăta că acumularea de lipide RV în fenotipul BMPR2 mutant are loc independent de boala vasculară pulmonară, am efectuat apoi experimente de cultură celulară în linia celulară H9c2 (17-19). Am generat clone H9c2 care exprimă în mod stabil fie vectorul gol (C), fie două forme ale genei umane BMPR2: mutație în domeniul citoplasmatic (M1) sau kinază (M2) (Figura 2A). Toate clonele H9c2 au exprimat markeri cardiaci specifici (Acta1; Acta2; Desmin; troponină T2, tip cardiac; tropomiozină 1α) (Figura 2B) și au demonstrat imunoreactivitate pentru troponina T cardiacă (Figura 2C) și F-actină (Figura 2D), markeri ai cardiomiocitelor. Pentru a determina dacă acumularea de lipide este prezentă în aceste linii celulare și, prin urmare, independentă de stresul de încărcare, am efectuat colorarea Oil Red O pe celulele H9c2 de control și mutante (Figura 2E) și am cuantificat lipidele acumulate utilizând software-ul Image J. Am constatat că acumularea de lipide a fost prezentă exclusiv în cardiomiocitele care exprimă gena BMPR2 mutantă (Figura 2F). Rezultatele noastre arată că acumularea de lipide în celulele H9c2 mutante BMPR2 este o consecință a mutației BMPR2 și nu necesită stres de încărcare.

Figura 3. Proteina CD36 este crescută în celulele H9c2 cu mutație de tip 2 a receptorului proteinei morfogenetice osoase. (A) Proteina CD36roșu) este localizat în membrana celulară și citoplasma celulelor martor (C), mutant1 (M1) și mutant2 (M2) cu colorare mai mare în ambele linii mutante. Nucleul este colorat albastru. (B) Proteina CD36 totală este crescută în M1 (n = 4; *P Absorbția de palmitat de 14 C este observată în celulele M2 (n = 3; P Figurile 4A și 4B). Cu WD, volumul de lipide a fost semnificativ mai mare la BMPR2 mutant RV de șoarece decât la BMPR2 mutant litterer (P Figurile 4A și 4B). În țesutul RV din toate grupurile, picăturile de lipide erau clar vizibile aproape de mitocondrii, sugerând că lipidele pot fi subutilizate pentru FAO mitocondrială. Aceste date arată că WD singur este asociat cu depunerea lipidelor RV, iar acest lucru este sporit în contextul mutației BMPR2.

Figura 4. În ventriculul drept al șoarecelui (RV), proteina CD36 este crescută și asociată cu acumularea de lipide ca urmare a mutației receptorului proteinei morfogenetice osoase tip 2 (BMPR2) sau a dietei occidentale (WD). (A) Imagini microscopice electronice ale corpurilor lipidice (săgeți negre), mitocondriisăgeți albe), și nucleu (săgeți roșii) în țesutul RV de la șoareci martori sau BMPR2 R899X hrăniți cu dietă standard (SD) sau WD. (B) Grafic cu bare reprezentând analiza cantitativă a creșterii ori a volumului lipidelor la volumul citoplasmei în țesutul RV de la șoarecii martori sau BMPR2 R899X hrăniți SD sau WD. Volumul lipidelor este crescut în cardiomiocitele RV de la șoarecii BMPR2 R899X hrăniți cu WD comparativ cu colegii mutanți BMPR2 (# P R899X (bare solide) comparativ cu șoarecii martor (bare deschise). Expresia genei CD36 este crescută în RV de la BMPR2 R899X și șoarecii de control hrăniți cu WD comparativ cu SD (*P R899X (n = 2) a alimentat SD și a fost semnificativ mai mare în RV de la BMPR2 R899X (n = 3; P R899X hrănit SD, precum și în cardiomiocitele RV de la BMPR2 R899X și șoarecii de control hrăniți cu WD, CD36 este localizat distinct în citoplasmă și membrană plasmatică. Nucleul este albastru in culoare. HSP70 = proteina de șoc termic 70.

În cardiomiocite, ATP este generat prin β-oxidare a acizilor grași. În calea clasică a FAO, acizii grași sunt legați de Coenzima A după intrarea în celulă și formează ulterior acil carnitine grase pentru a facilita intrarea lor în mitocondrii, unde suferă β-oxidare. Deși s-a constatat că alte modele animale de eșec al VD au suprimat FAO, nu este cunoscut dacă acest lucru este prezent ca o consecință a mutației BMPR2 (28-32). Am investigat mai întâi intermediarii căii FAO folosind datele noastre metabolomice în cardiomiocitele RV mutante BMPR2. A existat o scădere semnificativă a acilcarnitinelor cu lanț lung în RV mutant BMPR2 de șoarece comparativ cu RV șoarece de control (Figura 5A, Figura E1). Și, când VRV-urile mutante BMPR2 de șoarece au fost stratificate pe baza funcției cardiace, nivelurile acestor acilcarnitine, deși nu au scăzut semnificativ, arată o tendință cu CI mai mică (Figura 5A). Am constatat că nivelurile de metaboliți din sinteza carnitinei au fost similare la martorii șoareci BMPR2 șoareci RV (Figura 5B), sugerând că, deși carnitinele sunt prezente în citoplasmă, acilcarnitinele nu sunt formate în BMPR2 mutant RV de șoarece pentru a suferi β-oxidare mitocondrială.

Am investigat în continuare volumul mitocondrial în cardiomiocitele RV prin microscopie electronică pentru a determina dacă scăderea observată a β-oxidării sa datorat volumului mitocondrial redus. Am constatat că volumul mitocondriilor în cardiomiocitele RV mutante de șoarece BMPR2 a fost similar cu cardiomiocitele RV de la șoarecii martor hrăniți fie SD, fie WD, sugerând că scăderea consumului mitocondrial de O2 atribuit de FAO este independent de dimensiunea sau numărul de mitocondrii (Figura 5E, Figura E3 ). Luate împreună, aceste descoperiri indică faptul că calea FAO în RV mutant BMPR2 este afectată în mai multe puncte, inclusiv transportul în mitocondrii și β-oxidarea în sine.

Figura 6. În cardiomiocite, mutația receptorului proteinei morfogenetice osoase tip 2 (BMPR2) nu reglează în sus acil CoA: diacilglicerol aciltransferaza (DGAT). (A) În celulele martor (C), mutant1 (M1) și mutant2 (M2), DGAT1 localizat în citoplasmă și nucleu. (B) În cardiomiocitele ventriculului drept (VD) de la probe martor (n = 3) și probe de la subiecți cu hipertensiune arterială pulmonară ereditară (HPAH; n = 3), DGAT1 localizat în principal în citoplasmăculoarea maro). Nucleul este albastru. (C) În mouse-ul RV, Dgat1 (bare deschise) și Dgat2 (bare solide) expresia genei a fost similară la martor și BMPR2 R899X atunci când a fost hrănită cu dieta standard (SD) și a avut tendința către o scădere a VR control și a scăzut semnificativ (P Tonelli AR, Zein J, Ioannidis JP. Geometria probelor randomizate pentru tratamentele hipertensiunii pulmonare . Cardiovasc Ther 2013; 31: e138 - e146 .