ABSTRACT

INTRODUCERE

Prevalența obezității în S.U.A. populația adultă este estimată la aproximativ 36% (1, 2). Această prevalență ridicată a obezității ar trebui să ridice îngrijorări cu privire la abordarea noastră actuală de dozare a medicamentelor, care include în general utilizarea dozelor fixe fixe (indiferent de greutate) și a dozelor bazate pe greutate și pe suprafața corporală (3). Dozarea pe bază de greutate este frecvent utilizată pentru a doza mai mulți agenți antimicrobieni (3). Dintr-o perspectivă toxicologică, utilizarea dozelor pe bază de greutate poate duce la supraexpunerea și toxicitatea medicamentelor datorită creșterilor neproporționale ale clearance-ului medicamentului cu greutatea corporală la adulții obezi (4). Mai exact, antimicrobienele precum aminoglicozidele, colistina, telavancina și vancomicina, care sunt dozate în greutate, au fost asociate cu leziuni renale acute (AKI) la persoanele obeze (5-8).

asupra

Dacă AKI indusă de medicament este legată de expunerea mai mare la medicamente la pacienții obezi datorită dozării pe bază de greutate, atunci poate fi necesară o paradigmă de dozare alternativă. Testarea acestei ipoteze la pacienți necesită un studiu clinic amplu conceput prospectiv, care este adesea provocator din punct de vedere etic, financiar și tehnic din cauza condițiilor comorbide existente care confundă evaluarea AKI indusă de medicamente. În consecință, modelele animale servesc ca o alternativă utilă pentru a testa efectele unei anumite abordări de dozare a medicamentelor asupra dezvoltării AKI. Șobolanul a servit în mod istoric ca un model important pentru testarea AKI indusă de droguri (9). Cu toate acestea, profilul toxicologic al majorității medicamentelor este adesea studiat la șobolanii masculi de o vârstă specificată, ceea ce duce la selectarea unui grup de animale cu o distribuție îngustă a greutății (9). În consecință, modelul standard de șobolan poate avea un potențial limitat de traducere clinică la pacienții de ambele sexe cu o distribuție mai mare a greutății (9, 10). Prevalența ridicată a obezității face ca această limitare în modelul nostru de toxicologie preclinică să fie o preocupare relevantă (1, 2).

În ultimii ani, au fost dezvoltate mai multe modele de obezitate la șobolani (11). Aceste modele includ în general modele de obezitate modificate genetic sau induse de dietă (11). Deși aceste modele au fost utilizate cu succes pentru a studia consecințele patologice ale obezității, ele nu au fost utilizate suficient pentru testarea toxicologică. S-a demonstrat că modelul de șobolan obez indus de dietă imită modificările funcției renale observate la obezitatea umană mai mult decât la modelele de șobolani modificate genetic (12). În plus, modificările funcției renale sunt cel mai adesea evaluate folosind creatinina biomarker endogenă, care poate să nu fie sensibilă la detectarea precoce a AKI (13). În ultimul deceniu, molecula de leziuni renale 1 (KIM-1) și lipocalina asociată cu gelatinaza neutrofilă (NGAL) au fost identificate ca biomarkeri endogeni sensibili ai AKI (13). Testele disponibile comercial sunt de asemenea disponibile acum atât pentru KIM-1, cât și pentru NGAL pentru uz clinic.

Luată împreună, există o oportunitate clară de a îmbunătăți potențialul translațional clinic al datelor toxicologice generate de șobolan prin (i) utilizarea animalelor de ambele sexe, (ii) evaluarea unei distribuții mai largi a greutății și (iii) detectarea AKI cu biomarkeri sensibili. Prin urmare, studiul actual a fost efectuat pentru a valida un model de obezitate la șobolani ca sistem de comparare a efectelor obezității și sexului asupra AKI indusă de droguri. Gentamicina a fost selectată ca medicament de testat, deoarece este administrată clinic în funcție de greutate și este asociată cu AKI care poate fi dependentă de sex (14, 15). Clearance-ul gentamicinei este, de asemenea, cunoscut ca fiind un surogat excelent al funcției renale și, prin urmare, reducerea clearance-ului acestuia datorită AKI poate servi drept marker surogat al toxicității (16, 17). În cele din urmă, majoritatea datelor originale generate în modele de șobolani și care sugerează diferențele legate de tulpină, sex și obezitate în toxicitatea aminoglicozidelor au fost anterioare utilizării programului de reproducere Standard Genetic Internațional (IGS) (14, 18-23). Prezentul studiu compară diferențele farmacocinetice, potențialul AKI și diferențele histopatologice ale gentamicinei la șobolani masculi și femele IGS (Charles River, Wilmington, MA) care erau predispuși la obezitate (OP) și rezistenți la obezitate (OR).

MATERIALE ȘI METODE

Animale. Toate procedurile de pregătire, monitorizare și recuperare a animalelor au fost aprobate de comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor înainte de inițierea studiului. Șobolanii OP și OR de ambele sexe au fost obținuți de la Charles River Laboratories (Troy, NY) și menținuți individual într-un vivariu controlat de climă la 21 ° C pe un ciclu de întuneric de 12 ore lumină/12 ore cu hrană și apă ad libitum. Detalii privind dezvoltarea acestei tulpini au fost revizuite (24). Pe scurt, linia OP și OR are un receptor de leptină complet funcțional și au fost dezvoltate dintr-o linie Crl: CD (SD). Obezitatea este indusă în acest model prin menținerea animalelor pe o dietă bogată în grăsimi. White și Lee au detaliat anterior sistemul pentru dezvoltarea și întreținerea sistemului de reproducere IGS Crl: CD (SD) (Charles River, Wilmington, MA) (24). Șobolanii aveau vârsta de 10 săptămâni la achiziție și șobolanii OP și OR au fost menținuți pe o dietă de 60% grăsimi (RD12492; Research Diets, New Brunswick, NJ) timp de 6 săptămâni. Animalele au fost cântărite în fiecare săptămână în timpul aclimatizării (inițiale 4 săptămâni) și zilnic în timpul fazei experimentale de dozare (ultimele 2 săptămâni).

Achiziția și dozarea medicamentelor. Pentru acest studiu a fost utilizat un singur lot (lotul 90-433-DK) de sulfat de gentamicină (injecție, USP; Hospira, Lake Forest, IL). A fost studiat un grup inițial de șobolani masculi (5 obezi și 5 slabi) cărora li s-a administrat o doză zilnică de 50 mg/kg greutate corporală, dar acest experiment a fost încheiat prematur din cauza morbidității (vezi Rezultatele). În consecință, cea mai mare doză testată a fost redusă cu 50%. Animalele au fost cântărite zilnic înainte de injecția intraperitoneală (ip) unică zilnică a trei grupuri de dozare pe bază de greutate cărora li s-a administrat gentamicină (12,5, 18,75 sau 25 mg/kg) și unui grup i s-a administrat ser fiziologic normal (martor, volumul dozei asociat) timp de 14 zile . Au fost studiați optzeci de șobolani, care au permis alocarea a 5 șobolani la fiecare dintre cele 16 grupuri posibile, compuse din 2 sexe (masculin și feminin), 2 grupe de greutate (OP și OR) și 4 grupuri de dozare (control inclus).

Prelevarea de sânge și urină. Probele de sânge au fost colectate din vena laterală a cozii la momentul inițial și 0,25, 0,5, 0,75, 1,0, 3,0, 6,0 și 24 de ore după doza 1, doza 7 și doza 14. Sângele a fost colectat de la 2 animale (din același grup) într-o manieră eșalonată în timp, de exemplu, șobolanul 1 la punctele de timp 0,25, 0,75 și 3,0 h, de la șobolanul 2 la punctele de timp 0,5, 1,0 și 6,0 h și de la ambii șobolani la momentul inițial și 24 de ore punct în timp. Serul a fost separat de sângele integral și depozitat congelat la -70 ° C până la analiză. Urina a fost colectată prin adăpostirea a 2 animale pe grup de tratament individual în cuști metabolice timp de 24 de ore după doza 1, doza 3 și doza 5. Volumul de urină a fost măsurat, iar alicote au fost depozitate congelate la -70 ° C până la efectuarea analizei.

Testele biomarkerului AKI. Kituri de 96 de godeuri pentru testul imunosorbent enzimatic (ELISA) pentru șobolanul KIM-1 (Argutus Medical, Dublin, Irlanda) și șobolanul NGAL (ALPCO, Salem, NH) au fost utilizate pentru a măsura concentrațiile biomarkerilor în urină. Un test colorimetric cantitativ disponibil în comerț a fost utilizat pentru a măsura concentrațiile de creatinină în urină și ser (Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI). Toate testele biomarkerilor au fost efectuate conform instrucțiunilor producătorului. Toate măsurătorile au fost citite folosind sistemul de citire a plăcilor Tecan Infinite 200 PRO (Männedorf, Elveția).

Regresiile lineare ale parametrilor covariați-bayezieni în trepte (înainte și înapoi) au fost efectuate utilizând subrutina PMstep din PMetrics. Covariate semnificative au fost introduse în model în mod treptat, iar selecția finală a modelului s-a bazat pe bunătatea potrivirii și AIC. Evaluarea modelului final POP-PK a fost efectuată folosind graficele de diagnostic. Graficele diagnostice au inclus populația și graficele individuale prevăzute comparativ cu graficele observate, reziduurile în funcție de timp și reziduurile comparativ cu concentrația estimată individuală. Verificarea predictivă vizuală a modelului final POP-PK a fost efectuată prin prima simulare (SIMrun) a 1.000 de subiecți pentru fiecare șobolan folosind o abordare semiparametrică urmată de suprapunere (SIMparse și PMdiag) a 5-a, a 25-a, a 50-a, a 75-a și a 95-a intervalele de încredere ( CI) în timp pe datele observate. În cele din urmă, a fost testat un model farmacocinetic-farmacodinamic integrat care compară zona sub curba concentrație-timp integrată la 24 de ore (AUC0-24) cu biomarkeri ai AKI. Detalii suplimentare cu privire la procedurile descrise mai sus pot fi recuperate prin manualul PMetrics, tutoriale și forum disponibile pe site-ul web LAPK (27).

Histopatologie. Animalele au fost sacrificate printr-o procedură de eutanasie reglementată cu dioxid de carbon (7,5%), iar necropsii au fost efectuate la toți șobolanii. Rinichii recoltați au fost cântăriți, spălați de două ori cu soluție salină rece tamponată cu fosfat și depozitați în 10% formalină tamponată. Probele de țesut au fost trimise pentru pregătirea lamelelor și evaluarea microscopică de către un medic veterinar orb după doză de tratament (Taconic, Rockville, MD). Leziunea la rinichi a fost evaluată utilizând o scară de notare modificată pe baza procentului de tubuli proximali totali care demonstrează descuamare și necroză, unde 0 corespunde tubulilor proximali în limite normale, 1 corespunde la> 0% la 30% la 50%, 4 corespunde la> 50 la 70%, 5 corespunde la> 70 la 90% și 6 corespunde la> 90% (22).

Modificarea greutății șobolanilor masculi și femele în perioada experimentală de 14 zile pe baza greutății de referință în ziua zero (inițierea dozei de gentamicină).

Profilul concentrației-timp al gentamicinei. Concentrația maximă a gentamicinei în ser a fost observată la 0,5 ore după injecția intraperitoneală. Concentrațiile medii (SD) după doza 1 la 0,5 h (C0,5 h) după dozare au fost de 81,9 (30,3) mg/litru, 86,3 (38,6) mg/litru și 121 (85,1) mg/litru pentru 12,5-, Grupuri de 18,75 și, respectiv, 25 mg/kg. Concentrațiile observate cu fiecare regim de dozare pentru întreaga populație în timp sunt ilustrate în Fig. 2A. Profilul natural de concentrație-timp al logaritmului a scăzut într-o manieră bifazică, cu o scădere rapidă în primele 3 ore urmată de un declin mai lent între 3 și 24 de ore, așa cum este ilustrat în Fig. 2B. Concentrațiile medii (SD) la 3 h (C3 h) în doză au fost de 3,12 (4,40) mg/litru, 4,33 (5,46) mg/litru și 10,5 (13,2) mg/litru pentru 12,5-, 18,75 și 25 grupuri -mg/kg, respectiv. Concentrațiile medii 24 h (C24 h) după doza 1 au variat între 0,290 mg/litru și 1,62 mg/litru.

(A) Profiluri de concentrație-timp de împrăștiere pe o perioadă de 14 zile pentru întreaga populație după dozare; (B) logaritm natural seric concentrație-timp împrăștiere gentamicină și grafic adaptat (bandă mediană) după dozare în prima perioadă de 24 de ore.

Populația (stânga) prevăzută de modelul farmacocinetic și individuală (dreapta) prezisă de model comparativ cu concentrațiile observate de gentamicină.

Estimări ale parametrilor farmacocinetici ai populației, covarianța și covariabile semnificative identificate pentru fiecare parametru pentru modelul final cu două compartimente care descrie date de concentrație-timp gentamicină

Scatter și graficul de potrivire sigmoidală a relației dintre raportul maxim observat de lipocalină asociată cu urina neutrofilă gelatinază la creatinină (NGAL: Cr) pe zona gentamicinei sub curba concentrație-timp integrată de la zero la 24 h (AUC0-24).

Țesutul renal colorat cu hematoxilină și eozină (măriri, × 4 și × 20) care demonstrează leziunea tubulară de gradul 0 (martor), gradul 2 (femela OP) și gradul 4 (SAU masculin) cu doza zilnică de gentamicină de 25 mg/kg.

DISCUŢIE

Proiectarea noastră de fracționare a dozei pe bază de greutate a permis compararea grupurilor care au primit doze variabile de gentamicină absolută, dar au obținut expuneri foarte comparabile (Fig. 6). De exemplu, grupul feminin OP a obținut expuneri absolute la gentamicină similare cu cele ale bărbaților OR, dar gradul de AKI prin histologie a fost în mod clar mai mare în grupul masculin (Fig. 5). Această diferență între sexe a fost, de asemenea, evidentă de biomarkerii urinari ai AKI și creatininei serice. Deși NGAL/Cr a fost mai sensibil decât KIM-1/Cr, s-au observat concentrații mai mari ale acestor biomarkeri la bărbați decât la femei. În plus, NGAL/Cr a fost detectabil după prima doză de gentamicină la șobolanii masculi, dar a fost detectabil cu cea mai mare doză la șobolanii femele obezi numai după a cincea doză. În cele din urmă, histologia a demonstrat definitiv că, în medie, șobolanii tratați cu gentamicină au avut 10-30% leziuni tubulare proximale, spre deosebire de șobolani masculi, care au avut> 50 până la 70% leziuni tubulare proximale, în ciuda expunerii comparabile.

Zona prezisă de modelul populației sub curba concentrație-timp integrată la 24 de ore peste doza absolută pe grupul de șobolani.

Descoperirile noastre la șobolanii masculi sunt concordante cu cele ale lui Corcoran și Salazar, care au fost pionierii evaluării leziunilor de organ induse de droguri la șobolanul supraalimentat obez (18, 19). Au demonstrat anterior AKI la șobolani masculi în 5 zile de la tratament cu gentamicină la 30 mg/kg administrat i.p. la fiecare 12 ore (19). Modelul a fost stabilit prin atribuirea șobolanilor masculi înțărcați fie unei diete dense în energie (grup obez), fie unei diete standard (grup slab) pe parcursul a 52 de săptămâni (19). Această dietă a condus la o diferență medie în greutate de 1,8 ori între obezii și șobolanii masculi slabi. În schimb, modelul nostru a utilizat o dietă standardizată cu densitate energetică în ambele grupuri, a testat ambele sexe și a stabilit o diferență medie de 2,2 ori în greutate între grupuri. Această diferență de greutate a fost stabilită într-un timp mult mai scurt (14 săptămâni față de 52 de săptămâni) și a eliminat influența dietei ca agent de confundare extrinsecă atunci când se compară grupurile de tratament. Am folosit, de asemenea, șobolani mai tineri, ceea ce este relevant având în vedere că vârsta poate afecta și potențialul toxicologic al xenobioticelor (29). Prin urmare, acest model are potențialul de a defini interacțiunea vârstei, sexului și obezității cu privire la toxicologie în viitor. În cele din urmă, acest model a folosit șobolani IGS, ceea ce permite replicarea și confirmarea rezultatelor noastre de către alte grupuri de cercetare.

Ca și în cazul oricărui studiu, munca noastră are limitări importante care ar trebui luate în considerare. În primul rând, nu am evaluat impactul frecvenței de dozare asupra apariției AKI indusă de gentamicină. Adică nu am finalizat un studiu de fracționare a dozei (în funcție de frecvență) pentru a defini mai bine relația potențială dintre parametrii farmacocinetici alternativi ai gentamicinei, cum ar fi concentrația maximă de medicament în ser (Cmax) și Cmin la apariția AKI. În al doilea rând, am evaluat un singur punct de timp pentru histologie (după doza 14) și 3 puncte timpurii timpurii (după dozele 1, 3 și 5) pentru biomarkeri AKI. Eșecul nostru de a elimina o relație bine definită de expunere-toxicitate cu date histologice și biomarkere a fost probabil o consecință a acestei perioade limitate de evaluare și a gamei de expuneri. Am demonstrat o relație între raportul maxim NGAL: Cr și AUC0-24, dar numărul limitat de măsurători în intervalul superior de expunere justifică prudență atunci când interpretăm această constatare. În cele din urmă și cel mai important, nu am evaluat calea mecanicistă pentru această diferență bazată pe sex în AKI indusă de gentamicină. Investigațiile anterioare au arătat, de asemenea, acest dimorfism sexual în AKI induse de droguri, dar, de asemenea, nu au putut identifica o explicație mecanicistă clară pentru această constatare (10).

Indiferent dacă această constatare bazată pe sex se extinde sau nu la alte xenobiotice, este rezonabil să se evalueze cel puțin potențialul diferențelor de toxicitate între sexe în funcție de greutate cu experimente preclinice (10). Acest lucru este valabil mai ales pentru noile entități moleculare, cum ar fi neoglicozidele care sunt în curs de dezvoltare ca răspuns la creșterea rezistenței organismului Gram-negativ (30). Evaluarea acestui potențial și a diferențelor bazate pe sex pentru AKI ar trebui efectuată și pentru alte antimicrobiene obișnuite, cum ar fi vancomicina, telavancina, colistina și polimixina B. Dezvoltarea unui nou model de toxicologie creează o oportunitate de a reevalua potențialul toxicologic al medicamentelor care sunt dozate în greutate și eliminate prin rinichi. Deși evaluarea noastră s-a limitat la rinichi, influența obezității și a sexului asupra dozării și toxicologiei medicamentelor se va extinde probabil la alte organe țintă. Este justificată explorarea acestui model pentru a evalua potențialul toxicologic multiorganic al xenobioticelor în mărimea corpului. Disponibilitatea comercială a acestui model de șobolan obez, supraalimentat oferă o platformă rapidă, simplă și potențial rentabilă pentru a stabili influența dimensiunii corpului asupra farmacocineticii și toxicologiei antimicrobiene.

MULȚUMIRI

Acest studiu a fost finanțat parțial printr-o subvenție de la Northeast Kidney Foundation.

Recunoaștem sprijinul lui Thomas P. Lodise, Jr., (editorial) și al lui Roger W. Jelliffe și Michael N. Neely pentru instruire privind utilizarea și aplicarea programului PMetrics.