Abstract

Concentrațiile circulante de leptină se corelează cu masa grasă și semnalează starea stocurilor de energie somatică către creier. Studiile anterioare sugerează că creșterea greutății corporale indusă de dietă crește greutatea corporală „set-point”. Pentru a evalua dacă hiperleptinemia cronică este responsabilă pentru această schimbare a greutății corporale apărate, am crescut concentrațiile de leptină circulante la șoareci slabi la cele comparabile cu șoarecii obezi induși în dietă timp de optsprezece săptămâni. Am emis ipoteza că, după încetarea perfuziei cu leptină, va fi apărată o greutate corporală mai mare. Comparativ cu martorii cu infuzie salină, șoarecii cu leptină au avut concentrații crescute de leptină în circulație, au câștigat mai puțină greutate, dar au avut rate metabolice similare. După încetarea administrării de leptină, șoarecii cu infuzie de leptină au câștigat o oarecare greutate, dar au ajuns la 5-10% sub controale. Aceste rezultate sugerează că, spre deosebire de șoarecii care au devenit hiperleptinemici prin creșterea în greutate indusă de dietă, șoarecii infuzați cu leptină nu „apără” o greutate corporală mai mare, sugerând că hiperleptinemia în sine nu imită consecințele SNC ale creșterii cronice în greutate.

1. Introducere

La indivizii cu greutate stabilă, concentrațiile de leptină circulante sunt direct proporționale cu masa de grăsime [1]. După scăderea în greutate, scăderea concentrației de leptină în circulație datorită masei reduse de grăsime oferă unul dintre semnalele care induc o scădere mediată de SNC a cheltuielilor de energie și creșterea foamei la oamenii slabi și obezi [2-4] și la rozătoare [5] . Restabilirea concentrațiilor de leptină la nivelurile pre-pierdere în greutate abrogă unele dintre aceste răspunsuri metabolice, neuroendocrine, autonome și comportamentale [3,6]. În schimb, șoarecii masculi cu post de 48 de ore prezintă modificări induse de foame în axele gonadale, suprarenale și tiroidiene care sunt toate reversibile cu leptină, fără efect semnificativ asupra greutății corporale sau asupra re-hrănirii după foamete [7]. Luate împreună, aceste descoperiri indică faptul că concentrația circulantă a leptinei este un semnal aferent major al disponibilității globale a energiei și că fenotipul hipometabolic al indivizilor cu greutate redusă este rezultatul - cel puțin parțial - al unei stări de insuficiență relativă de leptină percepută [8] .

Spre deosebire de efectul puternic al administrării de leptină la oameni sau la rozătoare cu insuficiență de leptină (greutate redusă, post sau congenital deficient de leptină), administrarea de doze fiziologice sau suprafiziologice de leptină la rozătoare sau oameni la greutatea corporală obișnuită sau crescută are puțin de niciun efect asupra cheltuielilor de energie sau consumului de alimente [3,9-11]. Astfel de date sugerează că circuitele de detectare a leptinei din SNC sunt „concepute” pentru a fi inerent mai receptive la un deficit de leptină ambientală, mai degrabă decât la un exces [7,12]. Au fost propuse argumente evolutive pentru astfel de răspunsuri de reglementare „asimetrice” la modificările grăsimii corporale [13]. Determinarea „pragului” (semnal minim privind masa de grăsime) sub care sunt invocate aceste răspunsuri este determinată de factori genetici și de dezvoltare [13].

În studiul de față am căutat să izolăm efectele posibile ale leptinei ambiante ridicate în sine asupra greutății corporale apărate, adică să dezarticulăm experimental hiperleptinemia de numeroasele modificări ale sistemelor metabolice și neuroendocrine care apar ca urmare a creșterii grăsimii corporale și a conținutului ridicat de grăsimi din dieta utilizată pentru a atinge acest nivel de grăsime. Am examinat efectele a 18 săptămâni de perfuzie exogenă continuă de leptină asupra răspunsurilor metabolice ale șoarecilor C57BL/6J. Prin infuzarea de leptină murină recombinantă la șoarecii slabi care consumă o dietă cu conținut scăzut de grăsimi - pentru a obține concentrații circulante care imitau cele ale șoarecilor obezi (DIO) induse de dietă potrivite în funcție de vârstă - am căutat să creăm un model de șoarece cu concentrații crescute de leptină circulantă fără metabolizarea „Confuzii” ale obezității induse de dietă (de exemplu, FFA și glucoză crescute, insensibilitate la insulină, ficat gras etc.). Ipoteza noastră a fost că o creștere cronică a concentrațiilor de leptină ar duce la o creștere permanentă a nivelului minim de grăsime corporală apărată.

2. Materiale și metode

2.1. Animale

48 de șoareci C57BL/6J masculi de 6 săptămâni au fost obținuți de la Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). La primire, animalele au fost adăpostite 4 pe cușcă în stilouri de plastic cu așternut de așchii de lemn într-o instalație de barieră fără patogeni menținută la 22-24 ° C cu un ciclu de întuneric - lumină de 12 ore (luminile aprinse la 07:00 h). Accesul ad libitum la o dietă săracă în grăsimi (LFD: Research Diets, Inc. D12450Bi, 10% kcal din grăsimi) și apă au fost furnizate pe parcursul întregului experiment, cu excepția cazului în care se specifică altfel. Greutatea corporală și compoziția corporală au fost determinate la fiecare 14 zile, cu excepția cazului în care se specifică altfel.

Protocolul a fost aprobat de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor de la Columbia University.

2.2. Prezentare generală a proiectului de studiu

asupra

Cronologie experimentală. Cronologie experimentală a tuturor celor trei faze ale studiului. După o perioadă de 3 săptămâni de aclimatizare la Universitatea Columbia, șoarecii aveau nouă săptămâni la începutul experimentului. Mini-pompele care conțin cantități crescânde de leptină au fost înlocuite chirurgical la fiecare două săptămâni în timpul unei perioade de perfuzie de 18 săptămâni (faza 1). Sângele a fost obținut prin sângerare retro-orbitală după un repaus de 4 ore la opt zile după fiecare comutator de mini-pompă în timpul celor 18 săptămâni ale fazei 1, precum și la 5, 41 și 118 zile după îndepărtarea pompei finale (vezi negru cercuri).

Greutatea corporală, compoziția corporală și concentrația de leptină circulantă în timpul fazei de perfuzie cu leptină (A - C) Greutatea corporală medie (± sem) (A) masa grasa (B) și masă fără grăsimi (C) de șoareci infuzați cu leptină (șoareci LEP; n = 32; diamant negru) sau PBS- (șoareci PBS; n = 12; diamante deschise). Cercurile negre reprezintă operații de înlocuire cu mini-pompă (dozele de leptină sunt notate sub fiecare cerc în μg/zi). Linia neagră din dreapta jos reprezintă 72 de ore măsuri de calorimetrie indirectă pentru toți șoarecii. (D) Concentrațiile medii (± sem) de leptină serică (ng/ml) la creșterea ratei de perfuzie a leptinei (μg/zi) a grupurilor LEP și PBS colectate din serul de post de patru ore obținute la 7 zile după intervenția chirurgicală de înlocuire a mini-pompei. * p Figurile 2 B și C). Doza de leptină s-a bazat pe studii pilot în care am corelat ratele de perfuzie cu concentrațiile serice circulante intercurente de leptină. Folosind analize de regresie a masei grase și a leptinei serice făcute mai devreme [5], obiectivul nostru a fost de a ridica concentrațiile circulante de leptină la șoarecii neobezi hrăniți cu LFD la cei analogi cu șoarecii obezi induși în dietă. Cea mai mică doză administrată a fost de 1 μg/zi/șoarece (42 ng/h) și cea mai mare doză a fost de 25 μg/zi/șoarece (1042 ng/h); Au fost adăugate trepte de 3 μg/zi la fiecare punct de timp al comutatorului mini-pompă (adică 4 μg/zi, 7 μg/zi etc.). Sângele de post de patru ore a fost obținut prin sângerare retro-orbitală la 7 zile după fiecare implantare mini-pompă.

2.3.2. Greutatea corporală și compoziția corporală

Greutatea corporală (BW) a fost măsurată (± 0,1 g) săptămânal folosind o scală Ohaus Scout Pro 200 g (Nänikon Elveția, între orele 07: 45-08: 15 h). Compoziția corpului (masa grasă: FM, masa fără grăsimi: FFM și lichid extracelular) au fost măsurate pe un RMN calibrat în carcasă [20] în timp-domeniu-RMN (Minispec Analyst AD; Bruker Optics, Silberstreifen, Germania) la fiecare 2 săptămâni (1 săptămână după implantarea mini-pompă anterioară și cu o zi înainte de sângerarea retro-orbitală).

2.3.3. Calorimetre indirecte

2.4. Recâștigați faza

După îndepărtarea ultimei mini-pompe (ziua 155; Figurile 1 și 2A), 2 A), BW și aportul de alimente (FI) au fost măsurate zilnic timp de 10 zile în fiecare dimineață (07:45 h - 08: 15 h) și la fiecare 2-3 zile după aceea, pentru următoarele 15 zile, când șoarecii au avut acces ad-lib la LFD (Figura 4 A - D). Aportul de alimente a fost măsurat pe cușcă și împărțit la numărul de șoareci din cușcă, pentru a obține o estimare a aportului individual de energie. Compoziția corpului a fost obținută înainte de îndepărtarea ultimei mini-pompe și apoi la 5 și 41 de zile după excizia ultimei pompe.

2.5. Faza de preferință a dietei

Odată ce greutățile corporale s-au stabilizat după excizia ultimei mini-pompe (aproximativ 5 săptămâni), șoarecii au fost adăpostiți individual și li s-a permis să se aclimatizeze timp de 1 săptămână. Atât LFD cât și MFD au fost plasate în partea de sus a fiecărei cuști; BW și FI au fost determinate zilnic (10:00 h - 11:00 h). Eficiența furajelor a fost estimată prin împărțirea schimbării în greutate de 24 de ore la numărul de calorii consumate în acea perioadă (g/kcal). După 10 zile de testare a preferințelor dietetice, șoarecilor li s-a oferit acces ad-lib doar la MFD. Greutatea corporală a fost măsurată la fiecare 1-2 săptămâni în această perioadă de 8 săptămâni.

2.6. Leptina serică și insulina

Sângele a fost obținut prin sângerare retro-orbitală după un post de 4 ore la opt zile după fiecare comutator de mini-pompă în timpul celor 18 săptămâni. Faza de perfuzie cu leptină, precum și la 5, 41 și 118 zile după ultima îndepărtare a mini-pompei. Sângele a fost lăsat să se coaguleze timp de 2 ore la temperatura camerei, s-a rotit la 4 ° C timp de 20 min la 1000 × g și serul a fost colectat și înghețat la -80 ° C până la momentul testului. Leptina a fost testată folosind kitul Quantikine ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN) și insulina utilizând Mercodia Ultrasensitive Mouse Insulin ELISA (Mercodia, Uppsala, Suedia).

2.7. Analize statistice

Datele sunt exprimate ca mijloace ± SE. Analizele statistice au fost efectuate folosind JMP (versiunea 7; SAS, Carolina de Nord). După caz, ANCOVA au fost efectuate folosind grupul de dietă (cu LEP sau PBS) ca variabile independente și FM și FFM ca covariabile. Semnificația statistică a fost definită prospectiv, deoarece pα Figura 2 A - C) nu se distinge între șoarecii tratați cu LEP și PBS (BW: 24,0 ± 0,4 vs. 24,0 ± 0,6, masă fără grăsimi: 17,8 ± 0,4 vs. 17,7 ± 0,4 și masă grasă: 3,1 ± 0,1 față de 3,4 ± 0,2 g, respectiv). BW a fost semnificativ mai mic în grupul LEP la începutul dozei de leptină de 4 μg/zi (ziua 44; Figura 2 A), majoritatea acestei diferențe fiind cauzată de o scădere a FM (-0,9 ± 0,1 g, reprezentând o Scăderea cu 30%) la șoarecii LEP după implantarea primei mini-pompe (1 μg/zi; Figura 2 B). FM s-a stabilizat apoi în grupul LEP (ziua 30), iar FM a rămas neschimbat pe tot restul experimentului. FM nu a fost statistic diferit la prima doză (1 μg/zi; 2,2 ± 0,1 g) comparativ cu doza finală (25 μg/zi; 2,4 ± 0,3 g) la șoareci LEP, dar a crescut semnificativ la șoareci PBS (2,9 ± 0,2 vs. 4,6 ± 0,3 g respectiv; p Figura 2 C). O măsură repetată ANOVA a evidențiat un tratament puternic (p 7,5 ori mai mare la doza de 25 μg/zi comparativ cu grupul PBS (47,3 ± 6,0 față de 6,3 ± 3,0 ng/ml, respectiv; Figura 2 D).

3.1.2. Cheltuieli de energie, activitate ambulatorie și coeficient respirator la șoareci tratați cu LEP- (25 μg/zi) și PBS

Cheltuielile totale de energie (TEE) neajustate (pentru compoziția corpului) au fost ușor, dar semnificativ mai mici în grupul LEP față de grupul PBS (11,6 ± 0,2 față de 12,2 ± 0,2 kcal/24 h, respectiv 24 de ore); p = 0,04; Tabelul 1 și Figura 3 A), o reflectare a cheltuielilor energetice mai mici în repaus (REE) din grupul LEP (8,4 ± 0,1 față de 9,1 ± 0,2 kcal/24 h; p = 0,01; Tabelul 1). Indiferent dacă a fost ajustat pentru FM și FFM (Tabelul 1) sau numai pentru FFM (date neprezentate) de ANCOVA, TEE nu mai era semnificativ diferită între grupuri (p = 0,09 și, respectiv, p = 0,1), dar REE a rămas în continuare semnificativ mai mică în LEP comparativ cu șoarecii PBS. TEE mai mare observat la șoarecii LEP la începutul primei faze de stingere a luminilor (Figura 3 A) se corelează bine cu activitatea ambulatorie crescută (Figura 3 B). Când TEE și REE au fost ajustate pentru FM și FFM utilizând analiza de regresie multiplă [5], TEE a fost aproape identică între șoarecii LEP și PBS (datele nu sunt prezentate). Atât TEE cât și mișcarea ambulatorie au fost deplasate spre stânga (adică crescute mai devreme) la șoarecii LEP în perioada de lumină timpurie oprită (20:00 h - 02: 00 h; Figura 3 A și B). Coeficientul respirator mediu de 24 de ore (RQ) a fost similar în ambele grupuri (Tabelul 1) și s-au observat diferențe minore, tranzitorii, între grupuri pe parcursul întregilor 48 de ore (Figura 3 C).

tabelul 1

Neajustat și ajustat (folosind ANCOVA cu FM și FFM ca covariabile) cheltuieli totale de energie (TEE), cheltuieli energetice în repaus (REE) și cheltuieli energetice neîn repaus ale șoarecilor LEP și PBS în ultima infuzie mini-pompă ziua leptinei).

* Semnificativ diferit între grupuri prin testul t (p # Semnificativ diferit între grupuri prin ANCOVA tratând FM și FFM ca covariabile (p Figura 2 A), greutatea corporală și aportul de alimente au fost măsurate zilnic în primele 10 zile și apoi la fiecare 2– 4 zile pentru următoarele 15 zile Greutatea corporală a șoarecilor LEP a crescut cu ± 0,2 g/zi până la atingerea unui platou în ziua 7. Creșterea medie în greutate de 7 zile a fost de 1,3 ± 0,2 g (Figura 4 A), reprezentând un 5,2 ± 0,8 Creștere% în greutate corporală (Figura 4 B). Șoarecii PBS au pierdut în greutate până în ziua 4; pierderea medie în greutate în acea perioadă a fost de 1,1 ± 0,2 g (Figura 4 A), reprezentând o scădere cu 3,5 ± 0,7% a greutății corporale (Figura 4 B Greutatea corpului a revenit la niveluri înainte de îndepărtarea mini-pompei în grupul PBS în aproximativ ziua 10. În ciuda creșterii lor inițiale în greutate după îndepărtarea pompelor care conțin leptină, greutățile corporale ale șoarecilor LEP au rămas ușor, dar semnificativ mai mici decât cele ale grupul PBS până la sfârșitul experimentului (118 zile după îndepărtarea finală a mini-pompei: LE P = 34,6 ± 0,8 g și PBS = 37,6 ± 1,3 g în ultima zi a experimentului; Figura 4 A). Aportul de alimente a fost semnificativ mai mare în LEP decât animalele PBS în zilele 2-6 după îndepărtarea pompei, dar după ziua 7, aportul a fost similar cu șoarecii PBS (Figura 4 C). Eficiența hrănirii, estimată prin împărțirea modificării greutății corporale (g) la aportul de alimente (g) timp de 24 de ore, a fost semnificativ mai mare la șoarecii LEP în zilele 2-6 (Figura 4 d).

* Semnificativ diferit între grupuri prin testul t (p # Semnificativ diferit între grupuri prin ANCOVA care tratează FM ca covariabil (p Figura 5). Șoarecii LEP au ingerat puțin mai puține calorii totale ca urmare a aportului relativ mai mic de MFD în primele 5 zile, o tendință care a fost inversată în ultimele 2 zile. Când EI a fost normalizată la estimările FM și FFM utilizând analiza de regresie, nu mai exista o diferență în datele privind aportul de energie (datele nu sunt prezentate). Toți șoarecii au primit ad-libitum acces la MFD.

4. Discutie

Șaptezeci și unu la sută dintre subiecții umani cărora leptina le-a fost administrată în doze mari timp de 24 de săptămâni au dezvoltat anticorpi anti-leptină non-neutralizatori [11]. Serul insuficient a fost disponibil la șoarecii noștri LEP pentru a evalua prezența anticorpilor anti-leptină. Titrurile de anticorpi neutralizanți pentru leptină găsite la pacienții umani [30] au fost corelate invers cu pierderea în greutate [31]. Șoarecii și șobolanii lipsiți de alele funcționale ale receptorului de leptină (Lepr db/db și Lepr fa/fa, respectiv) au concentrații mai mari de leptină circulantă pe unitate de masă grasă decât controlul +/+ [32,33]. Rozătoarele heterozigoți pentru mutația Lepr sunt mai grase decât animalele +/+ și, prin urmare, au concentrații crescute de leptină plasmatică, care sunt totuși comparabile pe unitatea de masă de grăsime [33,34]. Concentrațiile plasmatice de leptină plasmatică normalizate (până la FM) la puii de șobolan de 10 zile cu Lepr fa/fa sau Lepr fa/+ sunt de 3,5 și respectiv de 1,6 ori mai mari decât la animalele Lepr +/+, iar aceste creșteri sunt asociate cu creșterea mRNA a leptinei niveluri în țesutul adipos (cu 60% mai mare în Lepr fa/fa și cu 26% mai mare în Lepr fa/+ în comparație cu animalele Lepr +/+) [33]. Șobolanii lepr fa/fa elimină leptina din circulație cu o rată mai mică datorită probabil legării leptinei de receptorul său solubil, care este crescut de 20 de ori în plasma șobolanilor lepr fa/fa [35].

Leptina scade răspunsurile legate de recompensa alimentelor prin acțiuni mediate de dopamina midbrain și căile opioidergice, efecte care pot duce la modificări ale preferinței alimentare [36,37]. La două luni de la întreruperea perfuziei cu leptină, un test de preferință pentru dietă nu a arătat diferențe între șoarecii LEP și PBS atunci când li s-au oferit atât diete de 10%, cât și 30% de grăsimi ad-libitum (Figura 5). Oamenii cu greutate redusă prezintă modificări ale activității neuronale specifice regiunii cerebrale comparativ cu ei înșiși înainte de pierderea în greutate. Multe dintre aceste modificări sunt inversate prin dozele de „înlocuire” de leptină, în zonele creierului cunoscute a fi implicate în controlul de reglementare, emoțional și cognitiv al consumului de alimente, sugerând în continuare o legătură între leptină și indicii cognitivi [38].

Mulțumiri

Îi suntem recunoscători lui Rick Rausch pentru expertiza tehnică excelentă. Mulțumim lui Anders Lehmann și Stefan Hjorth pentru conversații și sfaturi cu privire la acest proiect.