Joost G.J. Hoenderop

dapagliflozin

Departamentul de fiziologie, Institutul Radboud pentru științele moleculare ale vieții

Centrul Medical al Universității Radboud

Casetă poștală 9101, NL - 6500 HB Nijmegen (Olanda)

Articole similare pentru „”

  • Facebook
  • Stare de nervozitate
  • LinkedIn
  • E-mail

Abstract

Diabetul zaharat de tip 2 este o problemă majoră de sănătate care afectează 415 milioane de oameni din întreaga lume [1, 2]. Aceasta reprezintă 8,3% din populația adultă, cu rate egale la femei și bărbați [3]. Din 2012 până în 2015, aproximativ 1,5-5,0 milioane de decese în fiecare an au rezultat din diabet [4]. Diabetul și hipertensiunea apar frecvent împreună [5]. Hipertensiunea arterială la acești pacienți crește și mai mult riscurile cardiovasculare deja crescute, dar este dificil de gestionat. Într-adevăr, la aproximativ jumătate din populația diabetică, obiectivele tensiunii arteriale nu sunt îndeplinite, în ciuda utilizării mai multor medicamente care scad tensiunea arterială, inclusiv diuretice [6-8].

Recent, dapagliflozin, un inhibitor al co-transportorului de sodiu-glucoză 2 (SGLT2), a fost introdus ca o nouă clasă de agenți care scad glucoza pentru tratamentul diabetului de tip 2. Deoarece SGLT2 este responsabil pentru aproximativ 90% din reabsorbția filtrată a glucozei în segmentul 1 și 2 al tubulului proximal (PT) [9-11], inhibarea acestuia reduce reabsorbția glucozei renale și a sodiului (Na +), ducând la excreția urinară de glucoză și reducerea nivelului glicemiei [12]. Prin urmare, dapagliflozin este un medicament nou eficient pentru tratarea pacienților cu diabet zaharat de tip 2 [13-16].

Unele studii au demonstrat, de asemenea, că inhibitorii SGLT2 prezintă un efect diuretic impresionant și, prin urmare, reducerea tensiunii arteriale, în timp ce altele au descris efecte modeste asupra stării volumului [17-20]. Inhibarea SGLT2 reduce reabsorbția PT Na + și astfel crește sarcina tubulară distală de Na +, care inhibă activarea sistemului renină-angiotensină-aldosteron [21]. Rinichii reabsorb eficient 99% din Na + filtrat prin acțiunea combinată a (i) PT unde 60-70% este reabsorbit prin Na + -hidrogen antiporter 3 (NHE3), SGLT1 și SGLT2 [22]; (ii) membrul ascendent gros (TAL) al buclei Henle care este responsabilă pentru reabsorbția de 15-25% prin căi paracelulare și cotransportor Na-K-2Cl (NKCC2); (iii) tubul contort distal (DCT) care reabsorbe 15-25% prin cotransportorul Na-Cl (NCC) sensibil la tiazidă [23]; (iv) conducta de colectare (CD) în care ENaC facilitează reabsorbția restului de 1-2% [10, 24].

Un studiu recent a constatat că tratamentul cu un inhibitor SGLT2 mărește expresia transportorului de uree-A1, acvaporină-2 și proteine ​​NKCC2 [1]. Cu toate acestea, lipsește o analiză sistematică a mecanismelor compensatorii care reglează reabsorbția renală a Na + după tratamentul cu SGLT2. Cunoașterea segmentului de nefron care compensează pierderea proximală de Na + este de mare interes fundamental și clinic, deoarece aceasta ar oferi ținta farmacologică majoră pentru tratamentul antihipertensiv.

Scopul acestui studiu a fost de a identifica impactul compensator al pierderii proxime de Na + de către inhibitorul SGLT2, dapagliflozin, asupra transportatorilor renali de Na + la șoarecii diabetici cu conținut ridicat de grăsimi.

Materiale și metode

Au fost utilizați următorii anticorpi primari

NCC (Millipore, Billerica, MA, SUA; # AB3553; imunoblotare [IB] 1: 2.000) și ovine anti NKCC2, IB 1: 2.000 [25], cotransportor Na +/fosfat (NaPi-2a; dar bun de Dr. Custer și colab. [26]; IB 1: 2.000), NHE3 (Millipore, Billerica, MA, SUA; # AB3085; IB 1: 500) [27], ATP1b1 (Merck KGaA, Darmstadt, Germania; # 05-382; IB 1: 500) [28]. Anticorpii secundari au fost după cum urmează: peroxidază conjugată de capră anti-iepure (Sigma-Aldrich; # A4914; IB 1: 10.000); anti-șoarece conjugat cu peroxidază (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, SUA; # 515-035-003; IB 1: 10.000).

Tampoane

Tampon de liză: 150 mM NaCI, 50 mM Tris-HCI (pH 7,5), 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM ortovanadat de sodiu, 1% (v/v) Triton X-100, 10 mM glicerofosfat de sodiu, 50 mM sodiu fluor, zaharoză 0,27 M, pirofosfat de sodiu 10 mM, conținând tabletă proaspăt adăugată de cocktail complet inhibitor de protează (Roche, Basel, Elveția) și 0,1% (v/v) β-mercaptoetanol. Tampon de probă SDS-PAGE: 5 × 10% (g/v) SDS, 10 mM β-mercaptoetanol, 50% (v/v) glicerol, 0,3 M Tris-HCI (pH 7,5), 0,05% (g/v) bromofenol albastru. TBS-T (soluție salină tamponată cu Tris, 0,1% [v/v] Tween 20): Tris-HCI (200 mM, pH 7,5), 0,15 M NaCI și 0,2% (v/v) Tween-20.

Model animal

Șoarecii masculi elvețieni adulți (Harlan, Oxon, Marea Britanie) la vârsta de 16 săptămâni au fost găzduiți într-o cameră cu aer condiționat la 22 ± 2 ° C cu 12: 12 h ciclu lumină/întuneric. Șoarecii au avut acces gratuit la o dietă bogată în grăsimi (45% grăsimi AFE; Servicii de dietă specială, Witham, Marea Britanie; energie totală 26,15 kJ/g). Un grup suplimentar slab a avut acces gratuit la chow standard pentru rozătoare (Teklad Global 18% Protein Rodents Diet; Harlan, Marea Britanie; energie totală 13,0 kJ/g). Toate animalele au avut acces liber la apa potabilă și la dieta adecvată și nu s-au observat efecte adverse pe parcursul întregului studiu experimental. Toate experimentele au fost efectuate în conformitate cu Principiile de îngrijire a animalelor de laborator (publicația NIH nr. 86-23, revizuită în 1985) și Reglementările pentru biroul de acasă din Regatul Unit (Legea privind procedurile științifice pentru animale din Marea Britanie, 1986).

Tratamente experimentale

Șoarecii au început o dietă bogată în grăsimi în ziua –20 și au rămas pe această dietă pe durata studiului. În ziua –6, streptozotocina (50 mg/kg; ip; Sigma-Aldrich, Dorset, Marea Britanie) proaspăt preparată în tampon citrat 0,1 M Na + citrat (HCI/pH 4,5) a fost administrată în total cu 3 doze pe o perioadă de 6 zile pentru a induce diabetul. În ziua 0, un grup de șoareci cu conținut ridicat de grăsimi (n = 8) a început tratamentul zilnic cu dapagliflozin (1 mg/kg; p.o .; Stratech Scientific Ltd., Suffolk, Marea Britanie) timp de 18 zile, în timp ce grupul de control cu ​​conținut ridicat de grăsimin = 8) a primit vehicul salin (0,9% g/v NaCI; p.o.) o dată pe zi pentru aceeași perioadă de timp. Volumul pentru gavajul oral a fost de 100 μL. O reprezentare schematică a proiectului experimental este prezentată în Figura 1.

FIG. 1.

Cronologie pentru studiul experimental. Grupa 1 (control slab): șoareci slabi la dieta normală timp de 38 de zile. Grupa 2 (controale bogate în grăsimi): șoarecii au început o dietă bogată în grăsimi în ziua –20 și ulterior au primit tratament STZ în ziua –6. În ziua 0, vehiculul salin a fost administrat timp de 18 zile. Grupa 3 (dapagliflozin bogat în grăsimi): șoarecii au început o dietă bogată în grăsimi în ziua –20 și ulterior au primit STZ în ziua –6. În ziua 0, dapagliflozin a fost administrat timp de 18 zile. Șoareci de control slabi, slabi; HFD, tratament dietetic bogat în grăsimi; DAPA, șoareci tratați cu dapagliflozin; STZ, șoareci tratați cu streptozotocină.

Analize cantitative ale expresiei genei

La terminarea studiului, ARN-ul total a fost extras din țesuturile renale de șoarece cu Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, SUA) conform protocolului producătorului. Ulterior, probele de ARN de șoarece au fost supuse tratamentului cu DNază pentru a preveni contaminarea ADN genomic și reacția de transcriptază inversă a fost efectuată ulterior pentru a sintetiza ADNc [29]. Nivelurile de ARNm ale genelor țintă au fost determinate de RT-qPCR relativ, urmând liniile directoare MIQE 20, cu un sistem de detecție PCR în timp real CFX96 ™ (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, SUA) utilizând detectarea iQTM SYBR Green Supermix (Bio Rad) a acumulare unică de produs PCR. Fiecare grup avea 8 rinichi și experimentele RT-qPCR au fost începute în trei exemplare. Grunduri pentru SGLT2, SGLT1, NHE3, NaPi-2a, NKCC2, NCC, Ncx1, ENaC (α, β, γ) au fost achiziționate de la Biolegio BV (Nijmegen, Olanda). În acest studiu, nivelurile de expresie ale genelor au fost normalizate la nivelurile de expresie ale genelor standard de referință specifice speciei gliceraldehidă 3-fosfat dehidrogenază. Aici, expresia relativă a ARNm a fost analizată folosind metoda Livak (2 –ΔΔCt). Exemple de secvențe sunt prezentate în Tabelul 1.

tabelul 1.

Exemple de secvențe utilizate pentru RT-PCR cantitativă în timp real

Izolarea proteinelor

Țesuturile renale au fost izolate de la șoareci și omogenizate în tampon de liză rece cu gheață. Lizatele de rinichi au fost clarificate prin centrifugare la 4 ° C timp de 15 minute la 16, 110 g și supernatanții depozitați la –80 ° C. Metoda Bradford a fost utilizată pentru a determina concentrațiile de proteine ​​conform protocolului producătorului (Bio-Rad).

Imunoblotarea

Lizatele (20 μg) în tampon de probă SDS au fost adăugate la electroforeză pe gelurile prefabricate Criterion TGX (Bio-Rad) și apoi gelurile au fost transferate pe membranele PVDF. Membranele au fost blocate în TBS-T conținând 5% (greutate/volum) lapte uscat fără grăsimi (NFDM) timp de 1 oră la temperatura camerei. Ulterior, au fost imunoblotați la 4 ° C cu anticorp primar peste noapte. A doua zi, bloturile au fost spălate cu TBS-T pentru a îndepărta anticorpul primar nelegat și incubate cu anticorpi secundari conjugați cu peroxidază de hrean timp de 1 oră la temperatura camerei. După spălările ulterioare, proteina a fost vizualizată cu un reactiv chemiluminiscent (SuperSignal West femto/pico; Thermo Scientific, Waltham, MA, SUA) și procesată cu Bio-Rad ChemiDoc XRS. Benzile NaPi-2a, NaPi-2c, NHE3, NCC, NKCC2 și ATP1b1 de pe imunobloti au fost cuantificate cu analizor de gel.

Analize statistice

Datele sunt prezentate ca mijloace ± SEM. ANOVA unidirecțională urmată de testul lui Scheffe a fost utilizată pentru a examina diferențele dintre grupuri. A p value + Transporter Expression în PT

RT-qPCR a fost efectuat pentru a analiza expresia renală a SGLT1, SGLT2, NHE3, NaPi-2a la șoarecii tratați cu dapagliflozin și șoareci din grupul de control. Expresia genei NHE3 și NaPi-2a a crescut semnificativ cu 33 și 34% (p 0.2) între grupul tratat cu dapagliflozin și grupul de control al vehiculului (Fig. 2a, b). Nivelul expresiei proteinelor de NaPi-2a și NHE3 a fost investigat în continuare prin analiza Western blot (Fig. 2e). Expresia NaPi-2a și NHE3 a fost crescută cu 55 și 139% în grupul de tratament cu dapagliflozin în comparație cu șoarecii diabetici cu vehicule saline (p + -antiporter de hidrogen 3; NaPi-2a, cotransportor Na +/fosfat.

Efectul Dapagliflozin asupra expresiei transportorului Na + în TAL și DCT

Pentru a studia efectul dapagliflozinei asupra expresiei transportorilor de Na + în TAL și DCT, expresia NKCC2, NCC și Ncx1 a fost analizată prin RT-qPCR. Expresia NKCC2 și NCC a avut tendința de a crește cu 23 și, respectiv, 17%, în grupul de tratament cu dapagliflozin (Fig. 3a, b). Cu toate acestea, aceste modificări nu au atins semnificația statistică. Expresia Ncx1 a scăzut cu 27% în grupul de tratament cu dapagliflozin în comparație cu cel al grupului de control al vehiculului (p + Transporter/Channel Expression în CD

Pentru a investiga în continuare efectul pierderii proximale de Na + asupra CD-ului, am testat expresia ENaC (α, β și γ) prin RT-qPCR. Tratamentul cu Dapagliflozin a crescut expresia canalului epitelial Na + (ENaCα) cu 29% în comparație cu șoarecii de control vehiculp + -K + -ATPază și transportoare de glucoză

De asemenea, am evaluat efectul dapagliflozinei asupra transportorului de glucoză 2 (Glut2) și a transportorilor Na + -K + -ATPază prin RT-qPCR. Expresia Atp1b1 a fost crescută semnificativ cu 32% la șoarecii tratați cu dapagliflozin, comparativ cu cea a grupului de control al vehiculului (p 0,2). Tratamentul cu Dapagliflozin a determinat o ușoară reducere a expresiei Glut2 comparativ cu grupul de control al vehiculului, dar acest efect nu a reușit să atingă semnificația statistică (p = 0,08; FIG. 5a, c). Analiza Western blot a fost folosită în continuare pentru a investiga nivelul de exprimare a proteinelor din ATP1b1 (Fig. 5d). Expresia ATP1b1 a fost crescută cu 123% în grupul de tratament cu dapagliflozin în comparație cu șoarecii diabetici cu vehicul salin (p + reabsorbția prin SGLT2 este compensată de o expresie crescută a transportorilor locali de Na + în PT, dar nu în TAL, DCT și CD.

Inhibitorii SGLT2 îmbunătățesc controlul glucozei prin inducerea glicozuriei, dar reduc și reabsorbția Na +. Inhibarea reabsorbției Na + în PT va activa sistemele compensatorii în segmente situate mai distal pentru a contracara pierderea proximală de Na +. Un studiu recent a arătat că tratamentul cu dapagliflozin a reglementat în mod expres expresia transportorului de uree-A1, aquaporin-2 și proteine ​​NKCC2 [1]. Cu toate acestea, se știe puțin despre efectele inhibitorilor SGLT2 asupra transportatorilor de Na + local și din aval. Am investigat modul în care pierderea proximală de Na + afectează expresia transportoarelor/canalelor Na + locale și din aval la șoarecii diabetici cu conținut ridicat de grăsimi.

Tratamentul hipertensiunii în diabet nu este lipsit de controverse [17]. Prin urmare, nivelul precis la care trebuie inițiată terapia antihipertensivă și care este tensiunea arterială țintă ar trebui să rămână probleme dificile. Mulți pacienți cu diabet de tip 2 primesc mai multe medicamente pentru a trata atât hiperglicemia, cât și hipertensiunea. Noua clasă de inhibitori SGLT2 induce, de asemenea, risipa de Na + renală și, prin urmare, va avea proprietăți de reducere a tensiunii arteriale. Cu toate acestea, unele studii raportează un efect diuretic impresionant și, prin urmare, reducerea tensiunii arteriale, în timp ce altele au descris efecte modeste asupra stării volumului [17, 35]. Se știe că capacitatea compensatorie a rinichiului este imensă [36]. Inhibarea reabsorbției Na + în PT va activa sistemele compensatorii în segmente locale sau mai distal situate pentru a contracara pierderea proxima de Na +.

SGLT2 este localizat în segmentul S1 și reprezintă 90% din reabsorbția glucozei din rinichi [44-47]. Absorbția Na + prin membrana celulară creează un gradient de energie care la rândul său permite absorbția glucozei. Pe cealaltă parte a celulei, Na + este extrudat prin Na + -K + -ATPaza în fluxul sanguin [48-50]. Gradientul de concentrație din interiorul celulei rezultat din acest schimb determină reabsorbția glucozei în sânge prin GLUT2 [51-53]. Pentru a evalua dacă expresia crescută a transportorilor Na + în PT și CD a influențat expresia Na + -K + -ATPase și GLUT2, am testat în plus expresia transportorilor Atp1a1 și Atp1b1 și Glut2 prin RT-qPCR. Rezultatele au arătat că expresia Atp1b1 a crescut semnificativ în grupul tratat cu dapagliflozin; cu toate acestea, expresia Atp1a1 și Glut2 nu s-a schimbat. Mai mult, nivelul de expresie a proteinei ATP1b1 a fost, de asemenea, crescut în grupul tratat cu dapagliflozin. Expresia crescută a ATP1b1 poate facilita transportul Na + în sânge, ceea ce ar putea duce la retenție de sare și hipertensiune. Aceste efecte pot reduce efectele potențiale de scădere a TA ale inhibitorului SGLT2. Acesta este, de asemenea, un risc pentru pacienții cu diabet zaharat de tip 2 de a avea hipertensiune [54].

În concluzie, am demonstrat că inhibitorul SGLT2, dapagliflozin, a crescut expresia NHE3, NaPi-2a în PT. Mai mult, ATP1b1 a fost, de asemenea, reglat în sus, ceea ce poate facilita absorbția Na + în sânge.

Confirmare

Această lucrare a fost susținută de subvenții de la Institutul Radboud pentru Științe Moleculare ale Vieții (către Joost Hoenderop și Bastiaan de Galan).

Declarație de etică

Autorii nu au conflicte etice de dezvăluit.

Declarație de divulgare

Autorii declară că nu au conflicte de interese de dezvăluit.