Vinay Kumar

Departamentul de farmacologie, Facultatea de farmacie, Universitatea Hamdard, New Delhi-110062, India

Un Bhandari

Departamentul de farmacologie, Facultatea de farmacie, Universitatea Hamdard, New Delhi-110062, India

Chakra Dhar Tripathi

1 Departamentul de Farmacologie, Colegiul Medical Vardhman Mahavir, Spitalul Safdarjung, New Delhi-110029, India

Geetika Khanna

2 Departamentul de patologie, Colegiul de medicină Vardhman Mahavir, Spitalul Safdarjung, New Delhi-110029, India

Abstract

Obiectiv:

Obezitatea joacă un rol central în sindromul de rezistență la insulină, care este asociat cu hiperinsulinemie, hipertensiune arterială, hiperlipidemie, diabet zaharat de tip 2 și un risc crescut de boli cardiovasculare aterosclerotice. Prezentul studiu a fost realizat pentru a evalua efectul extractului Gymnema sylvestre (GSE) în obezitatea celulară indusă de diete bogate în grăsimi (HFD) și leziuni cardiace la șobolanii Wistar.

Materiale și metode:

Șobolani Wistar masculi adulți (150-200 g greutate corporală) au fost folosiți în acest studiu. HFD a fost utilizat pentru a induce obezitatea. Au fost evaluați indicele de masă corporală, parametrii hemodinamici, leptina serică, insulina, glucoza, lipidele, apolipoproteinele, apoptoza miocardică și enzimele antioxidante. Au fost, de asemenea, efectuate greutăți ale organelor și viscerelor grăsimii și studii histopatologice.

Rezultate:

Hrănirea orală a HFD (20 g/zi) pentru o perioadă de 28 de zile a dus la o creștere semnificativă a indicelui de masă corporală, a greutăților organelor, a greutății viscerale a grăsimii, a caspazei cardiace-3, a nivelului de ADN cardiac (indicând fragment de ADN inter-nucleosomal apoptotic ) și nivelurile de peroxid lipidic ale țesuturilor cardiace ale șobolanilor. Mai mult, tensiunea arterială medie, ritmul cardiac, leptina serică, insulina, LDH, LDL-C, colesterolul total, trigliceridele și apolipoproteina-B au fost semnificativ îmbunătățite, în timp ce nivelurile serice de HDL-C, apoliporoteina-A1 și Na + cardiacă K + ATPaza, nivelurile de enzime antioxidante au fost semnificativ reduse. Mai mult, tratamentul cu GSE etanolic standardizat (200 m/kg/p.o.) pentru o perioadă de 28 de zile a dus la inversarea semnificativă a modificărilor menționate mai sus la șobolanii obezi Wistar.

Concluzie:

Prezentul studiu a demonstrat potențialul anti-obezitate semnificativ al GSE în modelul murin al obezității.

Introducere

Obezitatea, cele mai frecvente tulburări nutriționale la om, este o problemă majoră nu numai în Asia, ci și în întreaga lume. [1] Potrivit Organizației Mondiale a Sănătății (OMS), prevalența obezității crește rapid într-un ritm alarmant față de proporția epidemiei la nivel global. Grupul de lucru internațional pentru obezitate estimează că peste 300 de milioane de indivizi din întreaga lume sunt obezi cu un indice de masă corporală (IMC) ≥ 30 kg/m 2 și 800 de milioane sunt supraponderali (IMC între 25 și 29,9 kg/m 2). În prezent, 66% dintre adulții din SUA sunt supraponderali sau obezi, 16% din copiii și adolescenții din SUA sunt supraponderali și 34% sunt expuși riscului de a deveni supraponderali. [2]

Obezitatea prezintă un risc major pentru boli cronice grave legate de dietă, inclusiv diabet de tip 2, hiperlipidemie, boli cardiovasculare, hipertensiune și accident vascular cerebral, apnee obstructivă în somn, astm, tulburări ortopedice, probleme de sănătate socială și mentală și anumite forme de cancer. [3 ] Apoptoza cardiacă joacă un rol critic în dezvoltarea și progresia obezității [4] și s-a observat o corelație pozitivă semnificativă între aportul mediu de grăsimi din dietă și incidența obezității și a complicațiilor aferente și a factorilor de risc. [5]

Extractul Gymnema sylvestre (GSE) (Asclepiadaceae), o plantă originară din pădurile tropicale din India, a fost folosit frecvent în medicina tradițională pentru tratamentul diabetului. Maji și colab. [6] au raportat că porțiunea solubilă în apă din extractul alcoolic de frunze de G. sylvestre are un efect semnificativ de scădere a glucozei în comparație cu agenții hipoglicemici standard. Shanmugasundaram și colab. [7] au testat două extracte solubile în apă, GS3 și GS4, obținute din frunzele de G. sylvestre, la șobolanii tratați cu streptozotocină pentru efectele lor asupra homeostaziei glicemiei și a țesutului endocrin pancreatic. Administrarea orală a G. sylvestre R. Br. sa constatat că extractul de frunze are efect hipolipidemic și antiaterosclerotic la șobolanii albini hrăniți cu dietă bogată în grăsimi (HFD). [8] Prezenta investigație a fost concepută pentru a studia efectul GSE la obezitatea indusă de HFD și tulburările metabolice asociate folosind șobolani Wistar sănătoși normali.

Materiale și metode

Autentificarea și extragerea frunzelor G. Sylvestre

Frunzele de G. sylvestre au fost achiziționate local, uscate la aer și autentificate de Head, Herbarium and Museum, NISCAIR, New Delhi, India. Specimenul de voucher (Ref. NISCAIR/RHMD/Consult/2008-09/980/11) a fost păstrat în Departamentul de Farmacologie, Facultatea de Farmacie Jamia Hamdard, New Delhi. Frunzele uscate de G. sylvestre au fost extrase cu etanol (70%) în aparatul Soxhlet. Extractul etanolic a fost standardizat în conformitate cu orientările OMS.

Proiectare experimentală

Studiul a fost aprobat de Comitetul de etică animală instituțională (IAEC) al Universității Hamdard, New Delhi, care este înregistrat la Comitetul pentru scopul controlului și supravegherii experimentelor pe animale (CPCSEA), Guvernul Indiei, (înregistrarea nr. 173/CPCSEA, din 28 ianuarie 2000). Șobolani albini masculi Wistar, cu o greutate de 150-200 g, au fost achiziționați de la Central Animal House Facility, Hamdard University, New Delhi și s-au aclimatizat în condiții standard de laborator la 25 ± 2 ° C, umiditate relativă (50 ± 15%).

Obezitatea a fost indusă prin hrănirea orală a HFD pentru o perioadă de 28 de zile. HFD a fost achiziționat de la Centrul Național pentru Științe Animale de Laborator (NCLAS), Institutul Național de Nutriție (NIN), Hyderabad, Andhra Pradesh, India. Un kilogram de HFD conține (g/kg) cazeină 342 g, cistină 3 g, amidon 172 g, zaharoză 172 g, celuloză 50 g, ulei de arahide 25 g, seu 90 g, ulei mineral 37 g și amestec de vitamine 10 g.

După aclimatizare, animalele au fost împărțite în mod aleatoriu în cinci grupe de câte opt animale și tratate după cum urmează: grupa I (control normal sănătos) - alimentate cu dietă standard timp de 28 de zile; grupul II (control HFD) - alimentat cu HFD timp de 28 de zile; grupul III (grup tratat cu GSE etanolic) - alimentat cu HFD timp de 28 de zile + de la a 8-a zi, GSE etanolic (200 mg/kg/p.o.) până la a 28-a zi; grupul IV (grup de tratament cu rimonabant) - alimentat cu HFD timp de 28 de zile + de la a 8-a zi, rimonabant (10 mg/kg/p.o.) până la a 28-a zi; grupul V (grup în sine) - alimentat cu dietă normală timp de 28 de zile + de la 8-a zi GSE etanolic, 200 mg/kg/p.o. până la ziua a 28-a.

Măsurarea creșterii în greutate corporală și a IMC

Creșterea greutății corporale a fost calculată ca o diferență între greutatea finală și greutatea corporală inițială. IMC a fost calculat prin măsurarea greutății corporale (kg) împărțit la pătratul lungimii nazo-anale a șobolanului [IMC = greutate (kg)/lungime (m) 2].

Măsurarea parametrilor hemodinamici

Parametrii hemodinamici (sistolică, diastolică, tensiunea arterială medie și ritmul cardiac) au fost măsurați cu ajutorul unui aparat de înregistrare a tensiunii arteriale neinvazive folosind metoda coșului de șobolan (Kent Scientific Corporation, SUA).

Măsurarea parametrilor biochimici în ser

Concentrațiile de lactat dehidrogenază (LDH) și lipoproteină-colesterol de înaltă densitate (HDL-C) (Reckon Diagnostics Pvt. Ltd., Baroda, Gujarat, India), glucoză, colesterol total (TC) și trigliceride (TG) trei au fost din Span diagnostics Ltd., Surat, Gujarat, India), în ser, au fost măsurate cu kituri comerciale. Concentrațiile de insulină, leptină și apolipoproteină-A1 și B din ser au fost măsurate, respectiv, cu kit ELISA de insulină de șobolan (Alpco Diagnostics, Salem, NH, SUA), kit ELISA de leptină de șobolan (BioVendor, Brno, Republica Cehă) și apo -A1 și B, kit imunoturbidimetric de imunologie (Randox Laboratories Ltd., Antrim, Marea Britanie).

Măsurarea organelor și a greutăților tamponului de grăsime viscerală

Diferite organe (inimă, ficat și rinichi) și tampoane de grăsime viscerală (epididimale, perirenale și mezenterice) au fost îndepărtate, spălate cu soluție salină normală și cântărite.

Măsurarea parametrilor antioxidanti și lipdperoxidarea în țesuturile cardiace

Toate activitățile enzimei antioxidante au fost determinate după ce țesutul a fost omogenizat cu soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) la un pH de 7,0. Glutationul a fost măsurat conform metodei Ellman. [9] Țesutul cardiac omogenizat a fost utilizat pentru testarea activității glutation peroxidazei (GPx), [10] glutation reductazei (GR), [11] glutation S transferazei (GST), [12] superoxid dismutazei (SOD) [13], și activitatea catalazei. [14] Peroxidarea lipidelor a fost determinată prin măsurarea spectrofotometrică a cantității de echivalenți de malondialdehidă cu acid tiobarbituric și exprimată ca substanțe reactive ale acidului tiobarbituric (TBARS; nmol malondialdehidă/mg proteină), conform metodei lui Ohkawa și colab. [15]

Măsurarea apoptozei miocardice

Activitatea ATPazei de sodiu și potasiu a fost măsurată în țesutul cardiac prin metoda raportată de Bonting. [16] Activitatea Caspase-3 a fost măsurată utilizând setul de testare colorimetrică Caspase-3/CPP32 (BioVision, SUA). Din fiecare probă s-au luat aproximativ 50 pl de supernatant din țesut omogenizat cu tampon de liză răcit și s-au adăugat 50 pl de tampon de reacție 2 × (conținând 10 mM DTT). Apoi, s-au adăugat 5 μl de substrat DEVD-pNA de 4 mM (200 μM concentrație finală) și s-au incubat la 37 ° C timp de 1-2 ore pentru a permite disocierea p-nitroanilidei (pNA) de conjugatul DEVD-pNA. Activitatea CPP-32 a fost măsurată spectrofotometric la 405 nm. Activitatea Caspase-3 a fost calculată ca nmol/h/mg proteină. [17]

Apoptoza a fost evaluată prin examinarea tiparului caracteristic al scărilor ADN generate în miocardul apoptotic utilizând electroforeza pe gel. Probele de miocard au fost omogenizate într-o soluție conținând 50 mmol/l Tris-HCI (pH 8,0), 100 mmol/l EDTA, 100 mmol/l NaCI și 1% dodecil sulfat de sodiu. Omogenatul tisular a fost digerat cu 5 μl de proteină K (soluție stoc 20 mg/ml) la 56 ° C timp de 2 ore și incubat cu RNază A (1 μl/ml) la 37 ° C timp de 1 oră. După aceea, extracția fenolului/cloroformului (1: 1) a fost efectuată de două ori. Tuburile au fost agitate și ținute la temperatura camerei (5-10 min). Țesuturile au fost apoi precipitate și centrifugate la 4 ° C și 10.000 rpm timp de 10 min. Supernatantul care conține ADN a fost precipitat cu 600 μl de izopropanol și peletele de ADN rezultate după centrifugare au fost spălate cu 75% etanol răcit și dizolvate în 100 μl de soluție tampon TE (10 mmol/l Tris-HCI [pH 8,0], 1 mmol/l EDTA ). Probele de ADN (5 μl ADN + 1 μl colorant de încărcare a gelului) au fost supuse electroforezei pe gel de agaroză 2%, colorat cu bromură de etidiu. Scara ADN, un indicator al fragmentării ADN nucleozomală apoptotică a țesutului a fost vizualizată și fotografiată cu transiluminatorul ultraviolet. [18]

Analize statistice

tabelul 1

Efectul extractului etanolic Gymnema sylvestre asupra indicelui de masă corporală și parametrii hemodinamici la șobolanii wistar

efectului

Efectele GSE asupra nivelurilor serice ale profilului lipidic

masa 2

Efectul extractului etanolic Gymnema sylvestre asupra lipidelor serice, a indicelui aterogen, a organelor și a greutății tamponului adipos visceral la șobolanii wistar

Efectul GSE asupra nivelului seric al leptinei, insulinei, glucozei, apolipoproteinelor A1 și B și LDH

Tabelul 3

Efectul extractului etanolic Gymnema sylvestre asupra leptinei serice, insulinei, lactatului dehidrogenazei serice (LDH), glucozei și apolipoproteinei A1 și B, la șobolanii wistar

Efectul GSE asupra Na + -K + ATPazei, Caspazei-3 și electroforezei gelului ADN

După 4 săptămâni de HFD, nivelurile de Na + -K + ATPază în țesuturile cardiace și hepatice au fost semnificativ (activitatea P + -K + ATPazei și activitatea caspazei-3 în grupul V [Tabelul 4]. Scara ADN a fost mai proeminentă în grupul HFD a comparat grupul de control normal în timp ce banda ADN a fost păstrată în țesutul cardiac din grupa III [Figura 1].

Tabelul 4

Efectul extractului etanolic Gymnema sylvestre asupra peroxidării lipidelor, enzimelor antioxidante, activității Na-K ATPaza și caspazei-3 în țesutul cardiac al șobolanilor wistar

Efectul extractului etanolic Gymnema sylvestre asupra electroforezei în gel ADN. M-Marker, V1-Grupul de control normal nu a prezentat nici o scădere a ADN-ului, V2- Grupul tratat cu dietă bogată în grăsimi a prezentat o bandă de scădere a ADN-ului, V3- Gymnema sylvestre extract etanolic (200 mg/kg/po) grupul tratat a restabilit scara de ADN, V4 = rimonabant ( 10 mg/kg/po) grup tratat, V5 = extract etanolic Gymnema sylvestre (200 mg/kg/po, adică, grup în sine)

Efectul GSE asupra nivelurilor de enzime antioxidante și peroxidarea lipidelor în țesutul cardiac

Toate enzimele antioxidante glutation (GPx, GR și GST), SOD și nivelurile de catalază în țesutul cardiac au fost semnificativ [Tabelul 4]. După 4 săptămâni de dietă, nivelul peroxizilor lipidici, exprimat ca TBARS, a fost semnificativ crescut în țesutul cardiac al grupului II în comparație cu grupul I. Nivelul TBARS a scăzut semnificativ [P Tabelul 4].

Efectele GSE asupra organelor și greutăților tamponului de grăsime viscerală

Discuţie

Obezitatea rezultă dintr-un dezechilibru între consumul de alimente și consumul de energie, care culminează cu acumularea excesivă de grăsime în țesutul adipos, ficat, mușchi, insulele pancreatice și alte organe implicate în metabolism. Obezitatea crește riscul de diabet, boli coronariene, ficat gras, calculi biliari, apnee în somn, artrită și cancer și poate scurta durata de viață. [19] Un model de obezitate indusă de HFD la șobolani este bine controlat, împărtășește multe caracteristici cu obezitatea umană și este avantajos în studiul anomaliilor cardiovasculare legate de obezitate. [20] Deoarece dietele bogate în grăsimi sunt de obicei dense și plăcute, o dietă relativ bogată în grăsimi duce la o creștere a aportului de energie. Consumul de HFD duce la creșterea în greutate și obezitate.

În acest studiu, IMC a crescut la șobolanii hrăniți cu HFD în comparație cu șobolanii de control sănătoși normali. Altunkaynak a raportat că IMC a crescut semnificativ la șobolanii cu HFD hrăniți timp de 8 săptămâni, comparativ cu grupul de control. [21] Tratamentul cu GSE (200 mg/kg/po) a fost semnificativ crescut în grupul de tratament cu GSE (200 mg/kg/po) în comparație cu grupul alimentat cu HFD. Na-K-ATPaza este o enzimă membranară care energizează Na- pompează prin hidrolizarea adenozin trifosfatului și irosirea energiei ca căldură, jucând astfel un rol în termogeneză și echilibrul energetic. Obezitatea animală și umană este asociată cu reducerea Na + K + ATPazei tisulare, legată de hiperinsulinemie. [30]

Wang și colab. [31] au raportat că hepatocitele apoptotice au fost semnificativ mai mari la ficatul șobolanilor hrăniți cu HFD decât la cei hrăniți cu dieta de control și aceștia au fost asociați cu un nivel mai ridicat de caspază-3 scindată. Apoptoza rezultă din activarea caspazelor care scindează diverse proteine ​​citoplasmatice subcelulare și un fragment de ADN nuclear. [32] În studiul actual, calea apoptotică dependentă de caspază a fost semnificativ crescută în țesuturile cardiace ale șobolanilor obezi induși de HFD, dovadă fiind o creștere a nivelului de caspază-3 activat cardiac în inimile șobolanilor obezi. GSE (200 mg/kg/p.o.) a redus semnificativ nivelurile de caspază-3 în comparație cu grupul alimentat cu HFD.

În studiul de față, moartea apoptotică a celulelor miocardice a fost demonstrată în obezitatea indusă de HFD la șobolanii Wistar prin electroforeză cu gel de agaroză ADN. Electroforeza ADN demonstrează prezența unor fragmente mici de ADN sub forma unei scări ADN în grupul alimentat cu HFD. Constatarea este în conformitate cu cea a lui Li și colab. [33] care au raportat că HFD care hrănește în mod semnificativ fragmentarea ADN citoplasmatică în probele de inimă și ficat de șobolani hrăniți cu HFD comparativ cu cei din grupul hrănit cu diete cu conținut scăzut de grăsimi, în timp ce în grupul cu tratament GSE (200 mg/kg/po), s-a păstrat scara ADN . Scara ADN este un indice al apoptozei miocitelor. [32]

În studiile la animale și la oameni, obezitatea este asociată cu o scădere a capacității antioxidante a țesuturilor sau a plasmei. [34] Datele actuale indică faptul că conținutul de glutation (GSH) a fost epuizat la șobolani cu obezitate indusă de un HFD și au fost restabiliți după tratamentul extractului de G. sylvestre. Antioxidanții enzimatici, cum ar fi SOD, catalaza sau GPx, pot elimina speciile reactive de oxigen și radicalii liberi sau pot preveni formarea lor. Rezultatele prezente arată că activitățile enzimei antioxidante (GPx, GRd și GST) din grupul HFD au scăzut semnificativ, în timp ce grupul HFD + G. extract de sylvestre a crescut semnificativ activitățile enzimelor antioxidante în ficat și inimă. Liou și colab. [35] au arătat că hiperlipidemia reduce puterea sistemului de apărare antioxidant. Mehta și colab. [36] a indicat faptul că HFD duce la leziuni hepatice și rezistență la insulină prin stres oxidativ.

Astfel, concluzionăm că mecanismul posibil pentru un efect antiobesitate al extractului de G. sylvestre poate fi prin suprimarea nivelurilor de leptină, insulină, dislipidemie, apolipoproteine, lipide, greutăți ale grăsimii viscerale și stres oxidativ la șobolanii obezi hrăniți cu HFD. Mai mult, previne apoptoza miocardică prin scăderea nivelului cardiac de caspază-3, fragmentarea ADN-ului cardiac și creșterea nivelului cardiac de Na-K ATPaza. Prin urmare, poate fi investigat în continuare ca un potențial medicament anti-obezitate.