Centrul de informații pentru afiliere, Institutul Național de Sănătate și Nutriție, Institutele Naționale de Inovare Biomedică, Sănătate și Nutriție, Shinjuku-ku, Tokyo, Japonia

evaluarea

Centrul de informații pentru afiliere, Institutul Național de Sănătate și Nutriție, Institutele Naționale de Inovare Biomedică, Sănătate și Nutriție, Shinjuku-ku, Tokyo, Japonia

Centrul de informații pentru afiliere, Institutul Național de Sănătate și Nutriție, Institutele Naționale de Inovare Biomedică, Sănătate și Nutriție, Shinjuku-ku, Tokyo, Japonia

Departamentul de afiliere pentru știința alimentară și nutriție, Universitatea Kinki Facultatea de Agricultură, Nakamachi, Nara, Japonia

Centrul de informații pentru afiliere, Institutul Național de Sănătate și Nutriție, Institutele Naționale de Inovare Biomedică, Sănătate și Nutriție, Shinjuku-ku, Tokyo, Japonia

  • Tsuyoshi Chiba,
  • Sachina Suzuki,
  • Yoko Sato,
  • Tatsuki Itoh,
  • Keizo Umegaki

Cifre

Abstract

Steatohepatita nealcoolică (NASH) este o boală hepatică recunoscută la nivel mondial. O dietă cu deficit de metionină și colină este utilizată pentru a induce NASH la șoareci; cu toate acestea, această dietă determină și pierderea severă în greutate corporală. Pentru a rezolva această problemă, am examinat efectele conținutului de metionină într-o dietă bogată în grăsimi și cu deficit de colină (HFCD) asupra greutății corporale și dezvoltarea NASH la șoareci.

Metode

Șoarecii C57BL/6J (bărbați, cu vârsta de 10 săptămâni) au fost hrăniți cu o dietă de rozătoare (martor) L-aminoacizi, o dietă bogată în grăsimi (HF) sau o dietă HFCD conținând diferite cantități de metionină (0,1-0,6%))) pentru 12 săptămâni. S-au măsurat nivelurile de lipide plasmatice, conținutul de lipide hepatice și expresia genei markerului inflamator și s-a efectuat o analiză patologică pentru a evalua NASH.

Rezultate

0,1% metionină din dieta HFCD a suprimat creșterea în greutate corporală, care a fost mai mică decât cea din dieta de control. Pe de altă parte, 0,2% metionină din dieta HFCD a generat creșteri similare în greutate corporală ca și dieta de control, în timp ce mai mult de 0,4% metionină a prezentat aceleași creșteri în greutate corporală ca și dieta HF. Greutatea ficatului și conținutul de lipide hepatice au fost cele mai mari cu 0,1% metionină și au scăzut într-o manieră dependentă de doză de metionină. Analiza patologică, scorurile activității NAFLD și nivelurile de expresie genică în ficat au arătat că 0,1% și 0,2% metionină timp de 12 săptămâni au indus NASH, în timp ce 0,4% și 0,6% metionină au atenuat inducerea NASH prin dieta HFCD. Cu toate acestea, 0,2% metionină din dieta HFCD nu a indus rezistență la insulină, în ciuda creșterii în greutate corporală.

Concluzii

0,2% metionină din dieta HFCD timp de 12 săptămâni a fost capabilă să inducă NASH fără pierderea în greutate.

Citare: Chiba T, Suzuki S, Sato Y, Itoh T, Umegaki K (2016) Evaluarea conținutului de metionină într-o dietă bogată în grăsimi și cu deficit de colină asupra creșterii în greutate corporală și dezvoltarea steatohepatitei nealcoolice la șoareci. PLoS ONE 11 (10): e0164191. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0164191

Editor: Giovanni Li Volti, Universitatea din Catania, ITALIA

Primit: 20 mai 2016; Admis: 21 septembrie 2016; Publicat: 10 octombrie 2016

Disponibilitatea datelor: Toate datele relevante se află în hârtie și în fișierele sale de informații de suport.

Finanțarea: Autorii nu au primit fonduri specifice pentru această lucrare.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Boala hepatică grasă nealcoolică (NAFLD) și steatohepatita non-alcoolică mai progresivă (NASH) au devenit recent boli hepatice recunoscute în țările dezvoltate [1]. Prevalența NAFLD a crescut nu numai în țările occidentale, ci și în Asia [2] și Japonia [3, 4]. În plus, 10-15% dintre pacienții cu NAFLD au fost diagnosticați cu NASH [5], care poate evolua de la steatoză și fibroză la ciroză și carcinom hepatocelular [6, 7]. NASH se caracterizează prin constatările biopsiei hepatice observate în hepatita alcoolică, pe lângă indicatorii plasmatici crescuti de afectare hepatică și acumulare de lipide în ficat cu NAFLD. La om, NASH este asociat cu obezitatea și sindromul metabolic, cum ar fi rezistența la insulină, diabetul zaharat și dislipidemia [8, 9]. În prezent nu există o farmacoterapie stabilită pentru NASH; prin urmare, studiile pe animale sunt în prezent în curs. Cu toate acestea, chiar dacă au fost raportate mai multe modele animale de NASH [10, 11], nu există un model animal optim de NASH uman.

Deoarece fiecare dietă are avantaje și dezavantaje, am încercat să identificăm o dietă care să inducă patologia NASH fără pierderea în greutate. În studiul de față, șoarecii C57BL/6 au fost hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi și cu deficit de colină (HFCD) conținând mai multe doze de metionină timp de 12 săptămâni, iar creșterea în greutate corporală și progresia NASH la șoareci au fost evaluate. Mai mult de 0,2% metionină din dieta HFCD a fost necesară pentru creșterea în greutate corporală și mai puțin de 0,2% metionină din dieta HFCD a fost capabilă să inducă NASH după 12 săptămâni la șoareci.

Materiale și metode

Animale și design experimental

Șoarecii masculi C57BL/6J (cu vârsta de 9 săptămâni) au fost cumpărați de la CLEA Japan Inc. (Tokyo, Japonia). După o săptămână de aclimatizare, șoarecii (cu vârsta de 10 săptămâni) au fost hrăniți cu o dietă de rozătoare (martor) L-aminoacizi, o dietă bogată în grăsimi (HF) sau o dietă HFCD conținând diferite cantități de metionină (0,1-0,6%) (w/w)). Un nivel de 0,6% metionină este același ca în dietele martor și HF. Compozițiile exacte ale fiecărei diete sunt prezentate în tabelul S1. Aceste diete au fost achiziționate de la Research Diet Inc. (New Brunswick, NJ). Șoarecii au fost adăpostiți în cuști (mai puțin de 5 șoareci în fiecare cușcă) cu un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore și li s-a dat hrană și apă ad libitum. Toate experimentele pe animale au fost efectuate cu aprobarea Comitetului de etică a animalelor din Institutul Național de Inovare Biomedică, Sănătate și Nutriție (nr. 1413).

Chimia plasmatică

După 8 sau 12 săptămâni de hrănire, șoarecii au fost postiti peste noapte și uciși sub anestezie cu izofluran. Probele de sânge au fost obținute din inimă, iar probele de plasmă au fost preparate imediat. Nivelurile plasmatice de colesterol total (TC), TG, acizi grași neesterificați (NEFA), glucoză și markeri funcționali ai ficatului (GOT, GPT și fosfatază alcalină (ALP)) au fost măsurate utilizând metode enzimatice (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japonia ). Nivelurile plasmatice de insulină au fost măsurate utilizând kitul ELISA pentru insulină de șoarece ultrasunetos Mercodia (Mercodia, Uppsala, Suedia).

Măsurarea conținutului de lipide hepatice

Lipidele hepatice au fost extrase cu cloroform/metanol (2: 1) folosind metoda Folch [21]. Ficatul (aproximativ 100 mg) a fost omogenizat în 6 ml de cloroform/metanol (2: 1) cu un omogenizator polytron. Lipidele au fost extrase prin incubare peste noapte, filtrate pentru a elimina reziduurile insolubile și ajustate la 10 ml cu cloroform/metanol. Un mililitru din fiecare probă a fost adăugat la un microtub și solventul organic a fost evaporat. Reziduul a fost dizolvat în izopropanol (cu 10% Triton-X). Conținutul TC, TG și NEFA a fost măsurat folosind metode enzimatice (Wako Pure Chemical Industries).

Examen histologic

Ficatele au fost îndepărtate și o parte din fiecare ficat a fost imediat fixată cu soluție de formalină tamponată 10%. Probele de ficat au fost încorporate în parafină și secționate la o grosime de 3 μm pentru hematoxilină și eozină (HE) și colorarea roșu Sirius. Scorurile de activitate NAFLD au fost determinate de steatoză, inflamație lobulară și scoruri de balonare a hepatocitelor. A fost măsurată și zona fibrozei. Trăsăturile patologice ale steatozei (0-3), inflamației lobulare (0-3), balonării hepatocitelor (0-2) și fibrozei (0-4) au fost marcate de Allisere, Inc. (Tokyo, Japonia). Șoarecii cu un scor NAFLD de activitate mai mare de 5 au fost diagnosticați ca „NASH”, între 5 și 3 ca „limită” și mai puțin de 3 ca „nu NASH” [22]. Imuno-colorarea F4/80 a fost efectuată cu un anticorp F4/80 anti-șoarece de șobolan (A3-1; BIO-RAD Laboratories, Inc., Hercules, CA) ca anticorp primar, iepure policlonal de șobolan IgG greu și lanț ușor încrucișat -anticorp absorbit (A110-322A; BETHYL Laboratories, Inc., Montgomery, TX) ca anticorp secundar și un sistem de detectare a rafinării polimerului BOND (LEICA Biosystems, Nussloch, Germania).

RT-PCR cantitativ

ARN total a fost extras din ficat folosind sistemul de purificare ARN TRIzol Plus (Life Technologies, Carlsbad, CA) și transcris invers cu PrimeScript RT Master Mix (Takara Bio Inc., Shiga, Japonia). RT-PCR cantitativ a fost realizat în plăci cu 96 de godeuri cu amestecul SYBR Green PCR Master Mix și un sistem de timp în vrac cu ciclic termic unic (Takara Bio Inc.). Numerele de copii pentru fiecare genă au fost determinate prin metoda de cuantificare absolută utilizând standarde diluate în serie de concentrații cunoscute. Rezultatele sunt exprimate ca raportul numărului de copii al ARNm țintă față de ARNm GAPDH. Perechile de exemple specifice mouse-ului utilizate în acest experiment sunt prezentate în tabelul S2.

Test de toleranță intraperitoneală la glucoză

După post peste noapte, soluția de D-glucoză (2 g/kg BW) a fost administrată prin injecție intraperitoneală. Controalelor li s-au dat soluție salină. Nivelurile de glucoză din sânge au fost monitorizate prin sângerarea cozii înainte de administrarea glucozei (0 minute) și la 15, 30, 60, 120 și 180 de minute după injectarea glucozei folosind Breeze2 (Bayer Pharma AG, Berlin, Germania).

Analize statistice

Datele sunt prezentate ca mijloace ± SEM. Comparațiile datelor din mai multe grupuri au fost efectuate de ANOVA unidirecțional cu un test post-hoc Bonferroni (SPSS 18.0J pentru Windows; IBM Co., Armonk, NY). Comparațiile de date între cele două grupuri au fost efectuate prin testul t al Studentului nepereche (PASW Statistics Base 18; IBM). O valoare P Tabelul 1. Greutatea corporală, greutățile țesuturilor și biomarkerii plasmatici (8 săptămâni).

Hrănire de 12 săptămâni

Creșterea în greutate corporală suprimată de HFCD și afectarea hepatică indusă au fost atenuate într-o manieră dependentă de doza de metionină.

Șoarecii C57BL/6J (bărbați, cu vârsta de 10 săptămâni) au fost hrăniți cu o dietă de control, dietă HF sau dietă HFCD conținând 0,1%, 0,2%, 0,4% sau 0,6% metionină timp de 12 săptămâni. După post peste noapte, șoarecii au fost uciși și ficatul a fost îndepărtat. Lipidele hepatice au fost extrase conform metodei Folch, iar nivelurile TC, TG și NEFA au fost măsurate folosind metode enzimatice. * P Tabelul 3. Greutatea corporală, greutățile țesuturilor și biomarkerii plasmatici (12 săptămâni).

Expresia genei inflamatorii și a markerului de fibroză indusă de HFCD a fost atenuată într-o manieră dependentă de doză de metionină.

Șoarecii C57BL/6J (bărbați, cu vârsta de 10 săptămâni) au fost hrăniți cu fiecare dietă experimentală timp de 12 săptămâni. ARN-ul total a fost extras din ficat, iar nivelurile de expresie ale factorilor transcripționali (A), (B) gene asociate cu acidul gras sintetaza, (C) gene inflamatorii și (D) gene legate de fibroză au fost măsurate prin RT- în timp real Metode PCR. Datele sunt reprezentate ca mijloace și SEM, n = 7 sau 8 în fiecare dietă. * P Fig 3. Analiza patologică.

Șoarecii C57BL/6J (bărbați, cu vârsta de 10 săptămâni) au fost hrăniți cu fiecare dietă experimentală timp de 12 săptămâni. După post peste noapte, șoarecii au fost uciși și ficatul a fost îndepărtat. (A) A fost efectuată o analiză patologică cu colorare HE, colorare roșie în serie și imunocolorare F4/80. Bara indică 100 μm. Mărire originală x200. (B) Scorul fibrozei a fost determinat ca raportul dintre zona sirius roșie pozitivă și întreaga zonă din fiecare secțiune. Datele sunt reprezentate ca mijloace și SEM, n = 7 sau 8 în fiecare dietă. *** P Tabelul 4. Scorul activității NAFLD (12 săptămâni).

0,2% metionină din dieta HFCD nu a indus intoleranță la glucoză.

Șoarecii hrăniți cu 0,2% metionină în dieta HFCD timp de 12 săptămâni au dezvoltat patologia NASH fără a fi suprimată creșterea în greutate corporală. Prin urmare, am efectuat IPGTT pe șoareci hrăniți cu 0,2% metionină în dieta HFCD timp de 12 săptămâni. Cu toate acestea, nu s-au observat diferențe semnificative în IPGTT, ASC sau nivelurile de insulină plasmatică între șoarecii hrăniți cu dieta de control și cei hrăniți cu 0,2% metionină din dieta HFCD (Fig. 4). Aceste rezultate sugerează că metionina 0,2% din dieta HFCD nu a indus intoleranță la glucoză, similar cu dieta MCD, chiar dacă au fost observate creșteri în greutate corporală.

Șoarecii C57BL/6J (bărbați, cu vârsta de 10 săptămâni) au fost hrăniți cu o dietă de control sau cu 0,2% metionină în dieta HFCD timp de 12 săptămâni, iar IPGTT s-a efectuat după post peste noapte. (A) După injectarea de glucoză (2 g/kg BW, i.p.), nivelurile de glucoză plasmatică au fost măsurate la fiecare moment. (B) ASC a fost calculată în (A). (C) Nivelurile de insulină plasmatică au fost măsurate folosind un kit ELISA. n = 6 în fiecare dietă.

Discuţie

Cea mai frecvent utilizată dietă pentru a induce NASH la rozătoare este dieta MCD; cu toate acestea, provoacă o scădere severă în greutate, care diferă de NASH uman. Un studiu anterior a demonstrat că o deficiență de metionină și colină a indus pierderea în greutate chiar și cu o dietă HF [15]. Pentru a depăși această problemă, am examinat efectele suplimentării cu metionină cu o dietă HFCD asupra greutății corporale și a patologiei NASH. În studiul de față, greutatea corporală la șoarecii hrăniți cu 0,1% metionină în dieta HFCD a fost mai mică decât cea a șoarecilor hrăniți cu dieta de control, în timp ce mai mult de 0,2% metionină a indus creșterea în greutate corporală. Mai mult de 0,4% metionină timp de 12 săptămâni poate induce obezitate, dar nu și patologia NASH. Prin urmare, 0,2% metionină din dieta HFCD timp de 12 săptămâni este adecvată pentru inducerea NASH fără scăderea greutății corporale la șoareci.

PPARα este un factor important de transcripție în NASH. Nivelurile de expresie a mARN-ului PPARα au fost semnificativ mai mici la șoarecii hrăniți cu 0,1% metionină în dieta HFCD și au crescut într-o manieră dependentă de doză de metionină. Dieta MCD a indus acumularea de lipide hepatice nu numai prin prevenirea sintezei și secreției de VLDL din ficat, ci și prin prevenirea β-oxidării FFA în ficat. PPARα are, de asemenea, o proprietate antiinflamatoare. Un studiu anterior a raportat că activarea NFκB și PPARα a fost reglementată reciproc de interacțiunile proteină-proteină [29]; prin urmare, inflamația indusă de dieta MCD poate suprima expresia mARN-ului PPARα prin activarea NFκB. Wy14.643, un agonist al genei PPARα, a îmbunătățit steatoza și balonarea la șoarecii diabetici model NASH [30] și un agonist dublu PPARα/ex a exercitat efecte de protecție hepatică asupra steatozei, inflamației și fibrozei în mai multe modele de rozătoare [31]. La om, expresia genei PPARα a ficatului se corelează negativ cu severitatea NASH [32]. Prin urmare, PPARα atrage interesul ca țintă terapeutică pentru NAFLD/NASH [33, 34].

Dietele HF care conțin acizi grași trans sunt, de asemenea, utilizate pentru a induce NASH la modelele de șoarece [19, 20]. În plus, colesterolul și colatul au indus nu numai lipotoxicitatea ficatului, ci și pierderea în greutate și reducerea țesutului adipos, chiar dacă această dietă conținea 60% grăsimi [18]. Cu toate acestea, unul dintre obiectivele noastre este de a stabili o dietă care induce NASH, care să fie cât mai asemănătoare cu dieta umană. Prin urmare, nu am adăugat acizi grași trans, colesterol sau colat de sodiu în dietele examinate. O dietă HF, care induce obezitatea, conține de obicei 45-60% energie din grăsimi, dar 60% energie din grăsimi din dietă este atipică pentru oameni, chiar și în țările occidentale și am considerat că 46% energie din grăsimi din dieta noastră este suficient pentru a induce obezitatea. Pe de altă parte, dieta MCD conține doar 20% energie din grăsimi, iar această dietă a scăzut greutatea corporală și masa țesutului adipos. Pentru a stabili un model NASH fără pierderea în greutate, trebuie să combinăm caracteristicile dietelor HF și MCD.

Concluzii

Rezultatele prezentului studiu au indicat faptul că este necesară cel puțin 0,2% metionină în dieta HFCD pentru ca șoarecii să câștige greutate corporală. Pe de altă parte, leziunile hepatice induse de dietă HFCD au fost atenuate într-o manieră dependentă de doza de metionină și mai puțin de 0,2% metionină a indus patologia NASH la șoareci după 12 săptămâni. 0,2% metionină din dieta HFCD timp de 12 săptămâni a fost capabilă să inducă NASH fără pierderea în greutate.

informatii justificative

S1 FIG. Studiu preliminar al influenței metioninei în dieta HFCD asupra greutății corporale și progresia NASH.