Abstract

INTRODUCERE

Demența vasculară este a doua formă cea mai frecventă de demență, după boala Alzheimer. Demența vasculară reprezintă aproximativ 30% din cazurile de demență în țările asiatice și 10% din cazurile de demență în țările occidentale (1,2). Demența vasculară este cauzată de leziuni vasculare și poate fi clasificată în trei tipuri majore: demență vasculară subcorticală, demență multi-infarct și demență strategică. Demența vasculară subcorticală este cel mai răspândit tip de demență, reprezentând aproximativ 50% din cazurile de demență vasculară (3). Trăsăturile patologice proeminente ale demenței vasculare subcorticale sunt leziuni confluente de substanță albă caracterizate printr-o pierdere a oligodendrocitelor care duce la demielinizare, vacuolizare, activare astrocitară (cunoscută și sub denumirea de astroglial) și activare microglială (4-6). Aceste caracteristici patologice sunt cauzate de infarctul incomplet al substanței albe datorat aportului redus de sânge în regiune, cum ar fi hipoperfuzia cronică (4). În timp ce s-au efectuat o varietate de studii clinice farmaceutice, niciun medicament pentru prevenirea sau tratarea demenței vasculare nu a fost aprobat de vreo agenție de reglementare (7). Astfel, este urgent să se dezvolte nutraceutice pentru a preveni demența vasculară.

Modelul de ocluzie a arterei carotide comune bilaterale de șobolan (BCCAO) a fost utilizat pe scară largă pentru a studia demența vasculară subcorticală, deoarece imită evenimentele patologice care apar în această boală (Fig. 1A) (8,9). Modelul BCCAO reflectă bine demența vasculară subcorticală umană prin faptul că induce leziuni ale substanței albe prin demielinizare, vacuolizare și activare astrocitică și microgliană (10,11).

grâu

Diagramele schematice ale modelului BCCAO și locațiile substanței albe. (A) Arterele carotide comune bilaterale (BCCA) au fost ocluse prin ligatură cu suturi de mătase 4-0. CCA, ICA și OA reprezintă artera carotidă comună, artera carotidă internă și respectiv artera occipitală. (B) Cele trei locații ale substanței albe care au fost examinate în acest studiu: corpul calos (cc), capsula internă (ic) și regiunile tractului optic (opt). Secțiunea prezentată este situată la -2,8 mm de bregma (23).

Un bob de grâu este alcătuit din endosperm, straturile de tărâțe și germeni (12). Fiecare parte a bobului este compusă dintr-o distribuție variabilă a amidonului, a proteinelor și a peretelui celular (13). Pereții celulari constau în principal din polizaharide fără amidon (NSP), cum ar fi arabinoxilan (AX) și β-glucan, cu cantități minore de arabinogalactan-peptidă și glucomanani (13,14). AX este alcătuit dintr-o coloană vertebrală liniară D-xiloză (xil) cu lanțuri laterale L-arabinoză (ara) (13,14). Procesul de măcinare produce făină de grâu din endospermul boabelor de grâu, lăsând restul boabelor [adică straturile de tărâțe de grâu (WB) cu cantități variabile de endosperm rămas] ca tărâțe de grâu (15). Boabele de grâu integral sunt aproximativ 65% amidon, 15% proteine ​​și 10% NSP, în timp ce tărâțele de grâu au aproximativ 25% amidon, 20% proteine ​​și 30% NSP (15). Deși boabele de grâu integral și tărâțele de grâu conțin niveluri foarte diferite de AX total (6% greutate/greutate față de 17% greutate/greutate), ele conțin niveluri comparabile de AX extractibil din apă (aproximativ 0,5% greutate/greutate).

Într-o încercare anterioară de a dezvolta un nutraceutic care să prevină demența vasculară, am constatat că supernatantul unui extract de apă fierbinte la scară de laborator din grâu integral măcinat (Triticum aestivum L.) (TALE) cu centrifuge tip batch a atenuat leziunile substanței albe și astrocitice activare într-un model BCCAO de șobolan, ducând la îmbunătățirea memoriei (17). Pentru a determina componentele active ale TALE, am folosit același model animal pentru a testa efectele mai multor componente TALE asupra leziunilor de substanță albă. Rezultatele acestor experimente au arătat că AX era un component activ (17). Rezultatele experimentului nostru anterior ne-au încurajat să dezvoltăm TALE ca nutraceutic care conține AX ca componentă activă. Cu toate acestea, atunci când am încercat să producem TALE la scară industrială cu centrifuge de tip continuu, am întâmpinat dificultăți cu îndepărtarea amidonului gelatinizat, care este necesar pentru a menține un nivel ridicat de AX în TALE.

MATERIALE ȘI METODE

Pregătirea WBE

Tărâțele de grâu, un produs secundar de măcinare al unui soi de grâu intern, au fost achiziționate de la un cultivator din Coreea. Următoarea procedură a fost utilizată pentru a produce WBE utilizat în studiul curent (Fig. 2): (1) Tărâțele de grâu au fost cernute pentru a îndepărta particulele mici, care erau în mare parte compuse din amidon; (2) Tărâțele de grâu au fost agitate cu 5 părți (gr/gr) apă rece într-un extractor de 500 L (Best Korea, Daejon, Coreea) pentru a îndepărta granulele de amidon din tărâțele de grâu; (3) Extractul rece a fost cernut și spălat cu 5 părți (greutate/greutate) apă rece a doua oară pentru a separa filtratul de tărâțele de grâu rămase, filtratul a fost denumit „filtrat rece”; (4) Filtratul rece a fost centrifugat cu o centrifugă cu decantor (PTM 300, TOMOE Engineering Co., Ltd., Tokyo, Japonia) pentru a obține un supernatant; (5) Supernatantul a fost amestecat cu tărâțele de grâu rămase și agitat într-un extractor la aproximativ 95 ° C; (6) Extractul fierbinte obținut a fost cernut pentru a da „filtrat fierbinte”; (7) Filtratul fierbinte a fost concentrat cu un uscător sub vid (HyoSung, Incheon, Coreea) și uscat cu un uscător cu pulverizare (YooJin Tech., Pyeongtaek, Coreea) pentru a se obține produsul final, care a fost desemnat „extract de tărâțe de grâu” (WBE ). WBE a fost furnizat cu amabilitate de către DongA One Corp. (Seul, Coreea).

O diagramă schematică a preparatului extractului de tărâțe de grâu (WBE). Tărâțele de grâu au fost agitate într-un extractor cu apă rece pentru a separa granulele de amidon de tărâțele de grâu, obținându-se filtrat rece și tărâțele de grâu rămase. Fracția de filtrat rece a fost centrifugată cu un decantor pentru a separa supernatantul de granulele de amidon precipitate. Apoi, supernatantul și tărâțele de grâu rămase au fost combinate și extrase cu apă fierbinte pentru a produce filtre fierbinți. Filtratul fierbinte a fost concentrat și uscat cu un uscător prin pulverizare pentru a produce WBE.

Analiza compoziției chimice WBE

Analiza nutrienților WBE a fost efectuată în conformitate cu standardul coreean al alimentelor Codex (20). Umiditatea, grăsimile, proteinele și conținutul de cenușă (% în greutate) au fost măsurate prin metoda de uscare prin încălzire, metoda de extracție a esterilor, metoda Kjeldahl și, respectiv, metoda de testare a cenușii. Conținutul de carbohidrați (% în greutate) a fost calculat prin diferență. În plus, conținutul total, insolubil și solubil de fibre dietetice a fost măsurat prin metoda enzimatic-gravimetrică.

Analiza compoziției neutre de monozaharide a WBE

Compoziția neutră de monozaharidă a WBE a fost determinată așa cum s-a descris anterior (21). WBE (5

Animale

Șobolani masculi Sprague-Dawley (SD), în vârstă de opt săptămâni, cu o greutate corporală de aproximativ 300 g au fost achiziționați de la Samtako Inc. (Osan, Coreea). Experimentele au fost efectuate în conformitate cu Ghidul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator. Protocoalele au fost aprobate de Comitetul consultativ instituțional pentru îngrijirea și cercetarea animalelor de la Universitatea Catolică, Daegu, Coreea. Animalele au fost adăpostite cu dietă și apă disponibile ad libitum în condiții de iluminare diurne și într-un mediu controlat de temperatură până la începutul experimentului.

Administrarea dietei

Șobolanii au fost repartizați aleatoriu la unul dintre cele trei grupuri: (1) fals (n = 6), (2) control (n = 6) și (3) tratate cu WBE (400 mg WBE/kg/zi) (n = 6). Șobolanii din grupul tratat cu WBE au fost hrăniți cu 15 g de dietă WBE ​​pe zi timp de 5 zile înainte și timp de 4 săptămâni după ce au suferit leziuni BCCAO. Dieta WBE a fost preparată prin amestecarea a 8 g de WBE cu 992 g de dietă. Odată ce șobolanii au consumat toată dieta WBE, s-a oferit mai multă dietă ad libitum. Șobolanii din grupurile simulate și de control, șobolanii au fost hrăniți numai cu dieta. Masa corporală, consumul de dietă și consumul de apă al fiecărui șobolan au fost măsurate zilnic pe parcursul perioadei experimentale.

Generarea modelului BCCAO

BCCAO a fost utilizat așa cum s-a descris anterior (Fig. 1A) (17) pentru a induce o reducere moderată a fluxului sanguin cerebral către creierul anterior al șobolanilor din grupurile martor și WBE. Înainte de BCCAO, șobolanii din toate grupurile au fost anesteziați cu izofluran (Hana Pharmaceutical Inc., Seoul, Coreea) într-un amestec de oxigen/oxid azotat (20%/80%) în timpul procedurilor chirurgicale. În grupurile de control și tratate cu WBE, arterele carotide comune stânga și dreapta au fost expuse printr-o incizie a liniei medii și ligate cu o sutură de mătase 4-0. În grupul fals, procedurile experimentale au fost aceleași, cu excepția faptului că arterele carotide comune nu au fost ligate. În timpul intervenției chirurgicale, temperaturile rectale au fost menținute la 37 ± 0,5 ° C cu o placă de încălzire controlată termostatic (Harvard Apparatus, Holliston, MA, SUA). După 4 săptămâni de BCCAO, a fost evaluat reflexul pupilar al tuturor șobolanilor. Ulterior, șobolanii au fost eutanasiați și creierele au fost recoltate pentru studii ulterioare.

Evaluarea reflexului luminos pupilar (PLR)

PLR a fost evaluat ca un indicator al degenerării nervului optic utilizând o adaptare ușor modificată a unei metode descrise anterior (22). Reflexele pupilare ale fiecărui șobolan au fost examinate înainte de operație pentru a confirma funcționarea normală. Pe scurt, fiecare șobolan a fost adaptat la întuneric timp de cel puțin 5 minute. Apoi, un ochi a fost expus la un fascicul de lumină de la un otoscop și a fost evaluat răspunsul reflex. Șobolanului i s-a permis readaptarea la întuneric timp de aproximativ 1 min și răspunsul reflex al celuilalt ochi a fost evaluat în același mod ca primul. Pierderea PLR a fost definită ca eșecul constricției elevului după o expunere la lumină de 10 secunde (Fig. 3).

Reflexul luminos pupilar al ochiului unui șobolan. Când un șobolan are un reflex de lumină pupilar normal, pupila (A) se constrânge în prezența luminii și (B) se extinde în întuneric.

Colorare Luxol Fast Blue

Vătămarea regiunii creierului de substanță albă a fost evaluată prin colorarea Luxol Fast Blue așa cum s-a descris anterior (17). Pe scurt, creierul a fost excizat sub anestezie și tăiat în felii. Feliile au inclus corpul calos (cc), capsula internă (ic) și regiunile tractului optic (opt), care, conform atlasului Paxinos și Watson (23), sunt situate la -2,64 până la 3,14 mm de bregma (Fig. 1B). Feliile creierului au fost fixate în formalină, încorporate în parafină și tăiate în secțiuni de 5 μm. După deparafinare, trei secțiuni din fiecare creier de șobolan au fost selectate și colorate cu Luxol Fast Blue (24). Au fost identificate regiunile cc, ic și opt din fiecare secțiune (25) (Fig. 1B). Gravitatea leziunii în cele trei regiuni a fost evaluată de un examinator orbit de condițiile experimentale și clasificat ca normal (gradul 0), prezența fibrelor nervoase dezorganizate (gradul 1), formarea de vacuole marcate (gradul 2) sau absența mielinizării fibre (gradul 3) (26).

Colorarea imunohistochimică

Analize statistice

Valorile sunt exprimate ca medie ± SEM. O analiză statistică pentru comparații multiple a fost efectuată cu ANOVA unidirecțională, urmată de testul post-hoc Tukey. Software-ul SPSS (IBM SPSS Statistics versiunea 19, IBM, Armonk, NY, SUA) a fost utilizat pentru toate analizele statistice. P Fig. 2) (27). Aproximativ jumătate (46%) din solidele din filtratul rece au fost îndepărtate prin centrifugare cu decantor, ceea ce a crescut conținutul de ara al supernatantului de la 1,1% la 2,0%. Prin urmare, utilizarea centrifugării cu decantor pentru îndepărtarea granulelor de amidon din tărâțele de grâu a fost o metodă adecvată pentru creșterea concentrației AX de WBE.

Caracterizarea WBE

Analiza nutrienților a arătat că WBE ​​constă din 3,3% în greutate umiditate, 0,9% în greutate grăsimi, 15,2% în greutate proteine, 14,1% în greutate cenușă și 66,5% în greutate carbohidrați. Analiza fibrelor alimentare a arătat că WBE ​​conține și 11,8% în greutate fibre dietetice solubile în apă, ceea ce reprezintă 17,7% din valoarea% în greutate obținută pentru carbohidrați.

Următoarea secvență de etape a fost utilizată pentru a evalua compozițiile monozaharidelor neutre prezente în WBE: (1) TFA a fost utilizat pentru a hidroliza WBE la monozaharidele sale constitutive; (2) Aldozele monozaharide generate au fost reduse la alditolii lor corespunzători; (3) Alditolii au fost acetilați la acetații lor de alditol corespunzători; (4) Acetații de alditol rezultați au fost identificați și cuantificați prin cromatografie gazoasă, aloza a fost utilizată ca standard intern (21). Compoziția de monozaharide neutre a WBE este prezentată în Tabelul 1. Dintre monozaharidele detectate, arabinoza (2,42% în greutate), xiloză (3,78% în greutate) și manoză (0,42% în greutate) sunt derivate numai din polizaharidele peretelui celular. Galactoza și glucoza sunt derivate din substanțe nutritive și din polizaharide ale peretelui celular. Deoarece TFA a fost utilizat pentru hidrolizarea WBE, celuloza nu a fost hidrolizată; astfel, glucoza conținută în celuloză nu a fost inclusă în analiza monozaharidelor. În total, 56% din totalul fibrelor alimentare detectate în WBE a fost sub formă de arabinoză și xiloză, care sunt componente ale AX sau manoză. Restul de 44% din totalul fibrelor alimentare prezente în WBE este probabil compus din galactoză, care se găsește în arabinogalactan, și glucoză, care se găsește în β-glucan.