Alejandro Rico-Guevara

Departamentul de Biologie Integrativă, Universitatea din California, Berkeley, CA, Statele Unite ale Americii

Date asociate

Următoarele informații au fost furnizate cu privire la disponibilitatea datelor:

Datele brute sunt incluse în cifre și în fișierele suplimentare.

Abstract

Introducere

Scopurile acestei lucrări sunt (1) de a oferi o descriere a cuplării componentelor aparatului de hrănire la colibri - și anume potrivirea tridimensională a limbii de factură, (2) de a descrie arhitectura țesutului și suprafețele vârfului limbii, (3) să caracterizeze și să contextualizeze morfologia brută și detaliată a aparatului de hrănire a colibriului atât într-un cadru comparativ (între păsări), cât și relevant din punct de vedere ecologic (biomecanică) și (4) să efectueze experimente pentru a releva măsura în care structurile de hrănire se poate transforma pasiv pentru a contribui la procesul de colectare a nectarului (adică, experimente post-mortem). Am folosit histologie, transmisie și microscopie electronică de scanare și tomografie computerizată cu raze X de înaltă rezoluție (microCT) pentru a descrie trăsături anatomice mai mari și dispunerea tridimensională a limbii în interiorul facturii (Fig. 1, Video S1). Au existat puține studii, precum cea prezentată aici, care au fuzionat microscopie microCT, lumină și electronică pentru a examina trăsăturile morfologice prin legarea lor între scări spațiale disparate (Handschuh și colab., 2013; Jung și colab., 2016).

aparatului

(A) Fotografie a unei colibri Anna care planează (Calypte anna, prin amabilitatea lui Robert McQuade), cu o reconstrucție 3D suprapusă a microCT a facturii sale. (B) Secțiunea de tăiere coronală scanată MicroCT care prezintă atât factura, cât și limba. (C) Reconstrucția scanării MicroCT care prezintă o secțiune a limbii. (D) Fotografie cu microscopie luminoasă care prezintă o secțiune a limbii cu tija de susținere în partea de sus. (E) Fotografie de microscopie electronică care prezintă o secțiune a țesutului peretelui limbii pentru a-i arăta arhitectura.

Materiale și metode

Tomografie computerizată cu raze X de înaltă rezoluție (microCT)

Preparate histologice

Am disecat două colibri cu gură de rubin pentru a-și extrage limba, care au fost tăiate în secțiuni lungi de 3 mm și fixate cu 1,5% (greutate/vol) glutaraldehidă - 1,5% (greutate/vol) paraformaldehidă în tampon standard (0,1 M HEPES, 80 mM NaCI, 3 mM MgCl2, pH 7,4 ajustat cu NaOH) pentru un total de 9 ore la 4 ° C cu o schimbare în fixativ proaspăt după o oră. Secțiunile au fost apoi fixate într-o soluție de 1% OsO4 - 0,8% fericianură de potasiu - 0,1 M cacodilat de sodiu - 0,375 M NaCI timp de 2 ore la 4 ° C și apoi spălate în apă distilată. Secțiunile au fost deshidratate într-o serie gradată de soluții de etanol și încorporate în rășină epoxidică (un amestec de Embed812, Araldite 502 și DDSA, blocuri polimerizate la 60 ° C timp de 48 de ore). Am obținut secțiuni transversale semi-subțiri (1 µm) care au fost colorate cu albastru de metilen/azur II (1: 1) urmate de contracolorare cu fucsină pentru microscopie ușoară. Fotomicrografiile au fost capturate folosind o cameră digitală CCTV de înaltă rezoluție JVC pe un microscop compus Olympus BX51 la măriri diferite (până la 1.000x). Am folosit software-ul Auto-Montage (Syncroscopy Inc.) pentru a compila imagini de mai multe planuri optice, obținând astfel câmpuri de vedere pseudo-plane cu vizualizare îmbunătățită a structurilor țesuturilor.

Microscopie electronică cu transmisie (TEM)

Am folosit un colibri cu guler rubiniu pentru TEM. Folosind unele dintre secțiunile fixe și încorporate (rășină epoxidică prelucrată într-un procesor de țesuturi cu microunde, Pelco Biowave Pro) ale limbii din preparatele histologice, am obținut secțiuni transversale subțiri (80 nm) folosind un cuțit diamantat pe un ultracrotom Leica Ultracut UCT . Secțiunile au fost plasate pe filme de suport Formvar pentru TEM și colorate fie cu acetat de uranil 2% (UA) și citrat de plumb (LC, Reynolds, 1963), vapori UA LC și RuO4 sau numai vapori RuO4 (Xue, Trent și Osseo-Asare, 1989). Aceste secțiuni au fost apoi realizate la laboratorul de microscopie electronică Bioscience de la Universitatea din Connecticut, cu un microscop electronic cu transmisie FEI Tecnai G2 Spirit BioTWIN la o tensiune de accelerare de 80 kV și la măriri directe de până la 120.000 ×.

Microscopie electronică cu scanare (SEM)

După CPD, am îmbrăcat (Polaron E5100) limbile cu aur și paladiu și le-am atașat la butuci SEM din aluminiu folosind bandă de carbon pe două fețe, am acoperit capetele caudale ale limbilor cu vopsea argintie și le-am conectat la butoanele de aluminiu în pentru a reduce efectele de încărcare. Mi-am imaginat limbile la laboratorul de microscopie electronică Bioscience de la Universitatea din Connecticut, cu un microscop electronic cu scanare cu emisie de câmp Zeiss DSM982, operat la o tensiune de accelerare de 2 kV și la măriri directe de până la 50.000 ×.

Experimente ex-vivo

Activitățile au fost revizuite și autorizate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea din Connecticut; Numărul de scutire E13-001.

Rezultate

Tomografie computerizată cu raze X de înaltă rezoluție (microCT)

Vă prezint prima serie completă de secțiuni transversale a unui aparat de hrănire a colibriilor. Am început cu cea mai caudală secțiune a operculului nazal (Fig. 2, secțiunea transversală [XS] 1) unde limba este aplatizată dorso-ventral, iar corpul limbii (corpus linguae) a început să se împartă medial datorită unei creșteri ( sulcus linguae) ale epiteliilor dorsale și ventrale (Fig. 2, XS 1; cf. XS 11 în Weymouth, Lasiewski & Berger, 1964). Corpul limbii la colibri cuprinde limba de la o bază distinctă, la articulația dintre bazihial și paraglossum, până la canelurile rostrale. Nu prezint o descriere a structurii corpului lingual în această lucrare, având în vedere că acest lucru a fost detaliat anterior (Weymouth, Lasiewski & Berger, 1964). La XS 2 există un strat întunecat de țesut cornificat care înconjoară aproape complet corpul lingual. Astfel de straturi devin mai groase la regiunea de creștere și se conectează în cele din urmă, atunci când se deplasează rostral prin secțiuni transversale (Fig. 2, XS 2-5), împărțind efectiv corpul limbii (cf. XS 13 în Weymouth, Lasiewski & Berger, 1964) și oferind se ridică la o limbă bifidă. La XS 3 configurația semicilindrică caracteristică canelurilor limbii este deja vizibilă (cf. XS 14 în Weymouth, Lasiewski și Berger, 1964).

Structura neagră din mijlocul figurii este o vedere laterală a facturii din scanarea reconstituită, iar liniile portocalii punctate care o traversează corespund secțiunilor transversale numerotate. Băncile superioare și inferioare (rinoteca și gnatoteca sunt învelișurile keratinoase ale oaselor maxilare și respectiv ale mandibulare) de pe fiecare secțiune apar separate, dar într-un colibru viu pot fi cuplate complet când becul este închis, lăsând practic niciun spațiu în afara canelurilor limbii în regiunea rostrală. Structurile relevante pentru înțelegerea funcționării aparatului de alimentare sunt etichetate (a se vedea textul).

Histologie și microscopie electronică

(A) Secțiunea limbii încorporată în rășină; vedere dorsală orientată cu capătul caudal al secțiunii în partea de sus. (B) Secțiune transversală corespunzătoare (microscop cu lumină) care arată configurația semicilindrică a canelurilor. Tija cornificată a vârfului lingual și peretele canelului exterior (lateral) sunt etichetate pentru referință. Bare de scară neetichetate = 250 µm. (C) Detalii histologice ale peretelui canelat care prezintă stratul cornos (Sc), stratul puternic cornificat (Cl). (D) Detaliile histologice ale tijei cornificate și straturile aparent germinative rămân.

Am găsit corpuscule întunecate eliptice-circulare distribuite uniform în țesutul limbii (capul săgeții negre, Fig. 4A). Limitele celulare sunt linii continue de corneo-desmosomi (de exemplu, săgeata neagră, Fig. 4B). Am găsit structuri cu diametrul de ∼35 Å, care sunt posibil microfibrile (de exemplu, săgeata albă, Fig. 4C). În ceea ce privește diferitele metode de colorare, am constatat că colorarea cu acetat de uranil și citrat de plumb a oferit cea mai bună imagistică a corpusculilor întunecați eliptici și a celor mai externe straturi de keratină, în special în suprafața dorsală a canelurilor (Fig. S2). Cu toate acestea, colorarea cu vapori cu RuO4 a oferit cea mai bună vizualizare a corneo-desmosomilor necesari studierii arhitecturii celulare (Fig. S2).

(A) Micrografie electronică de transmisie care arată diferența în compoziția stratului (mai dens împachetată lângă suprafața dorsală) și granulele potențiale de melanină (cap de săgeată neagră). Colorat cu vapori cu RuO4. (B) Contururile celulare sunt corneo-desmosomi conectați (săgeată neagră). Colorat cu acetat de uranil (UA), citrat de plumb (LC) și RuO4 (vapori). (C) Matricea keratinoasă care prezintă microfibrilele (săgeata albă). Colorat cu UA, LC și RuO4.

În jumătatea canelată (rostrală) a limbii, se pot distinge două straturi ale stratului cornos: unul mai gros care stă la baza suprafeței ventrale (convexe) a canelurilor, la care mă refer ca „strat cornificat” și unul mai subțire. suprafața dorsală (concavă) a canelurilor (Fig. 3B). Stratul cornificat este format din celule mai mari, este mai puțin dens ambalat și conține mai puține granule decât stratul mai aproape de suprafața dorsală (Fig. 4A). Acest ultim strat poate conține unele celule aplatizate granulare-cornificate, dar nu mă refer la acesta ca strat granulosum, deoarece acest nume se aplică în principal țesuturilor mamiferelor (Baumel și colab., 1993). Este plauzibil ca unele dintre straturile germinative ale acestui epiteliu scuamos stratificat keratinizat să poată fi găsite la porțiunile bazale ale tijelor dorsale (Fig. 3B), dar cea mai mare parte este limitată la jumătatea caudală a limbii (Weymouth, Lasiewski & Berger, 1964).

Probabil legat de diferențele menționate mai sus în țesutul subiacent, am găsit diferențe calitative între suprafețele dorsale și ventrale ale canelurilor limbii (Fig. 5). Aceste suprafețe au fost curățate în același mod (vezi Metode: SEM), prin urmare acumularea diferențială de nectar sau reziduuri de murdărie nu pare a fi un factor de confuzie. În plus, având în vedere că tensiunea de accelerare poate modifica nivelul detaliilor suprafeței vizualizate, am păstrat constant 2 kV pentru toate comparațiile. În timp ce captam imaginile EM, am încercat să compar punctele corespunzătoare de pe suprafața dorsală și ventrală, dar nu am perceput diferențe vizibile pe suprafețele limbii în funcție de poziția relativă pe peretele canelurii (de exemplu, distanța relativă la tija cornificată sau la porțiunile lancinate, Fig. 5A și și 5B). 5B). La scara 10-scalem, suprafața canelurii limbii ventrale (Fig. 5C) pare să aibă mai multe regiuni granulate în comparație cu partea dorsală care pare mai netedă (Fig. 5D). Mai mult, la scara de 500 nm, suprafața ventrală (Fig. 5E) prezintă un aspect mai aspru decât suprafața dorsală (Fig. 5F).

(A) Prezentare generală a întregii limbi, deși observațiile mele s-au concentrat pe jumătatea rostrală (caneluri). (B) Închiderea unei secțiuni răsucite longitudinal a unei caneluri a limbii, indicând tija cornificată a vârfului lingual și lacerațiile peretelui canelurii. (C) Micrografie cu mărire medie (3.000 ×) a suprafeței ventrale a limbii. (D) Micrografie cu mărire medie (3.000 ×) a suprafeței dorsale a limbii. (E) Micrografie cu mărire mare (50.000 ×) a suprafeței ventrale a limbii. (F) Micrografie cu mărire mare (50.000 ×) a suprafeței dorsale a limbii. Rețineți că atunci când canelurile adoptă configurația lor semi-cilindrică naturală, suprafața ventrală corespunde părții exterioare (convexe) a pereților canelurilor, iar suprafața dorsală corespunde părții interioare (concavă) a pereților canelurilor.

Experimente ex-vivo

Am înregistrat umplutură expansivă (sensu Rico-Guevara, Fan & Rubega, 2015) în experimentele post-mortem (Fig. S1, Video S2). Această observație indică faptul că forțele fizice (structurale), mai degrabă decât musculare, sunt responsabile pentru expansiunea și umplerea limbii. Am aplatizat canelurile închizând vârfurile facturii și lăsând doar o mică deschidere pentru a extruda limba (vezi metodele), reproducând observațiile anterioare la păsările libere (Rico-Guevara și Rubega, 2011; Rico-Guevara, Fan și Rubega, 2015) și a înregistrat că canelurile aplatizate s-au extins spontan la contactul cu nectarul în limbile exemplarelor decedate (Video S3). În plus, am observat că separarea vârfurilor și relaxarea regiunilor franjurate au avut loc în experimentele post-mortem (Video S4). În consecință, captarea nectarului (sensu Rico-Guevara & Rubega, 2011) ar fi primul pas al sistemului de colectare a fluidelor și este imediat urmată de umplere expansivă. Presupun că forța principală care conduce procesul expansiv și, prin urmare, umplerea limbii cu nectar este energia elastică care poate fi stocată în pereții canelului cornificat.

(A) Fotografie dorsală a vârfului limbii Woodstar (Myrmia micrura) cu coadă scurtă imediat după contactarea suprafeței nectarului. Având în vedere configurația aplatizată a porțiunilor canelurilor din afara nectarului, ar exista energie elastică stocată care induce fluxul interior. (B) Secțiune transversală (fotografie cu microscopul luminos) a unei limbi de colibri în configurația sa „relaxată” din interiorul nectarului. (C) Secțiune transversală hipotetică care arată fluxul indus de elasticitate (Ef în albastru), tensiunea superficială (γ în negru) și energia potențială elastică (e în roșu). (D) Secțiune hipotetică pentru o porțiune a limbii care nu este încă afectată de fluxul expansiv. O aderență puternică a peretelui nectar menține canelura într-o configurație aplatizată, iar tensiunea superficială de-a lungul fantei canelurii previne infiltrarea cu bule. Energia potențială elastică este mai mare atunci când îndoirea peretelui este mai pronunțată; producând un diferențial de presiune care pompează nectarul în fiecare canelură.

Note privind morfologia grosieră a limbii relevante pentru hrănirea la colibri

Limbile colibriului pot arăta ca o linie de pescuit datorită subțirii lor extreme, dar sunt structuri cu adevărat complexe, bine adaptate sarcinilor specifice. Colibri își pot extinde limba dincolo de vârfurile facturii până la aproximativ două ori lungimea facturii (de exemplu, Fig. 7A), având în vedere că majoritatea limbilor colibri sunt doar puțin mai lungi decât facturile lor (Fig. 2, Rico-Guevara, 2014), baza limbii poate fi extinsă pentru a trece de tipul facturii (tranziția vizibilă în Fig. 7A). Această remarcabilă protejare linguală poate fi realizată prin deplasarea rostrală a aparatului hioid alungit (de exemplu, Video S5), iar colibri își pot ieși limba cu facturile închise din cauza prezenței unui înveliș elastic între laringe și baza limbii (de ex., Fig. 7B), care permite protejarea linguală fără a trage traheea în interiorul facturii. Proeminența linguală servește la creșterea gamei vârfurilor limbii și, de asemenea, la atingerea vârfurilor facturii cu baza limbii, ceea ce este important pentru transportul intraoral al alimentelor. La baza limbii, colibri prezintă două clapete orientate spre caudal fără papile conice (de exemplu, Fig. 7C), care pot ajuta în timpul transportului intraoral. Nu am găsit papile nici prin observații macroscopice ale întregii limbi, nici prin observații microscopice la regiunile rostrale.

(A) Fotografie a unui strălucitor cu pene de cerb (Heliodoxa rubinoides) care își întinde aparatul de limbă (prin amabilitatea lui Jim DeWitt –Frozen Feather Images). (B) Fotografie cu microscop de disecție a regiunii gâtului într-un specimen disecat al unui giacobin cu gât alb (Florisuga mellivora) care prezintă structura asemănătoare acordeonului sau tuba elastica în poziția recuperată. Tubul elastic poate conține oasele bazihial și ceratobranșiale permițându-le să se deplaseze independent de țesutul înconjurător și permițând o proeminență extremă a limbii. (C) Fotografie macro a facturii și a bazei limbii unei falci cu vârf alb (Eutoxeres aquila). Rețineți alae linguae de la baza limbii (săgeata neagră), care sunt mărite în comparație cu alte colibri.

Discuţie

Morfologia brută a limbilor colibri

Caracteristicile ultrastructurale ale limbilor colibri

(A) Fotografie care prezintă proeminența limbii, bifurcația acesteia și morfologia relaxată a canelurilor din interiorul nectarului (prin amabilitatea lui Don Carroll). (B) Secțiune transversală (microscop cu lumină) care arată reducerea diametrului tijei cornificate și subțierea în stratul cornos care compune șanțurile (care în acest moment este compusă doar din stratul cornificat). (C) Apropierea tipului de limbă care arată aspectul membranos al canelurilor și prezența tăieturilor diagonale în țesut (pereții canelurilor lancinate). (D) Micrografie electronică care arată structura stratului cornificat, observați reducerea numărului de straturi celulare și absența unor limite delimitate în suprafața dorsală (deasupra).