Ingineria bioproceselor

Acest articol face parte din subiectul de cercetare

Biofabricare continuă în sisteme microbiene Vizualizați toate cele 8 articole

Editat de
Miguel C. Teixeira

Universitatea din Lisabona, Portugalia

Revizuite de
Georg A. Sprenger

Universitatea din Stuttgart, Germania

Cecília Calado

Institutul Superior de Inginerie Lisabona (ISEL), Portugalia

Afilierile editorului și ale recenzenților sunt cele mai recente oferite în profilurile lor de cercetare Loop și este posibil să nu reflecte situația lor în momentul examinării.

escherichia

  • Descărcați articolul
    • Descărcați PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Suplimentar
      Material
  • Citarea exportului
    • Notă finală
    • Manager de referință
    • Fișier TEXT simplu
    • BibTex
DISTRIBUIE PE

Cercetare originală ARTICOL

  • 1 Divizia de cercetare Inginerie biochimică, Grupul de cercetare Dezvoltare integrată a bioproceselor, Institutul de Inginerie Chimică, de Mediu și Biosștiință, Universitatea de Tehnologie din Viena, Viena, Austria
  • 2 Christian Doppler Laboratory for Mechanistic and Physiological Methods for Improved Bioprocesses, Institute of Chemical, Environmental and Bioscience Engineering, TU Viena, Viena, Austria
  • 3 Centrul de predare și cercetare TERRA, Procese și interacțiuni microbiene (MiPI), Gembloux Agro-Bio Tech - Universitatea din Liège, Gembloux, Belgia

Introducere

Cele mai multe procese de astăzi se bazează pe modul batch alimentat, care sunt de ultimă generație în industrie. Ele pot fi puternic afectate de diferiți parametri ai procesului, cum ar fi pH-ul și T, hrănirea fiziologică (adaptarea ratei specifice de absorbție a substratului) și schimbarea agentului de inducție. Cu toate acestea, dependența de timp de calitatea produsului este încă un dezavantaj major cu ajutorul acestei tehnici de cultivare. Acest lucru face ca determinarea punctului de timp corect de recoltare să fie adesea dificilă, deoarece stresul intracelular duce adesea la liza foarte rapidă a celulelor și la degradarea produsului. Acest lucru are ca rezultat variații ale procesului de purificare din aval. Se consideră că biofabricarea continuă crește calitatea produsului și, prin urmare, facilitează procesul din aval. Cu toate acestea, până în prezent, pentru un singur proces stabil de chimostat industrial microbian a fost stabilit Saccharomyces cerevisiae în anii 90 pentru producția de insulină (Diers și colab., 1991). O scădere a productivității după un anumit timp de proces și un randament spațial mai mic împiedică continuarea în amonte a utilizării gazdelor microbiene de la aplicarea în industrie (Peebo și Neubauer, 2018; Kopp și colab., 2019b).

În această contribuție, prezentăm rezultatele culturilor de chemostat folosind sisteme de furaje mixte aplicate mai întâi de Wurm și colab. (2016, 2018). Scopul a fost realizarea unui proces continuu, cu o productivitate stabilă care depășește lotul alimentat frecvent. Am testat furaje mixte cu glucoză/lactoză și glicerol/lactoză în chemostat pentru trei proteine ​​model și am comparat performanța cu loturile hrănite de ultimă generație induse cu IPTG. Spre deosebire de culturile care utilizează BL21 (DE3) cu glucoză/lactoză, culturile pe bază de glicerol/lactoză au arătat o recuperare a productivității la un timp de inducție ridicat. Modificările privind alegerea sursei de carbon ar putea fi, așadar, un factor cheie pentru a permite o productivitate stabilă pe termen lung. Pe măsură ce se recuperează o productivitate deja pierdută, am adnotat această înviere a productivității cu termenul creștin „Lazăr” și „efectul Lazăr” corespunzător.

Materiale și metode

Tulpini

Cultivările au fost efectuate cu tulpina E coli Bl21 (DE3) folosind trei proteine ​​model diferite. Toate cele trei secvențe de proteine ​​au fost donate într-un vector pET, folosind pET21a + pentru proteina fluorescentă verde (GFP) și pET28a pentru proteina mCherry (mCherry) și Blitzenblue (BBlue). mCherry și BBlue au fost primite din fericire de la Prof. Maurer la FH Campus Wien. Toate culturile au fost menținute la -80 ° C în stocuri criogenice de glicerol 25%. PET21a + extrasă care codifică plasmida pentru GFP a fost extrasă și electroporată într-o tulpină HMS174 (DE3) (Novagen, Merck, Darmstadt, Germania).

Moduri de cultivare și proces

Cultivările au fost executate într-un sistem de bioreactoare Minifors 2 (volum maxim de lucru: 1 L; Infors HT, Bottmingen, Elveția). Toate culturile au fost efectuate folosind un mediu minim definit, referit la DeLisa și colab. (1999). Mediile au aceeași compoziție cu cantități diferite de glicerol și glucoză. Detalii despre precultura, lotul, lotul hrănit și cultivarea chimiostatului sunt date în Tabelul 1. Inducția a fost efectuată în conformitate cu Tabelul 1. Raportul glicerol-lactoză a fost calculat pe baza lucrărilor recente din lotul hrănit cu privire la absorbția maximă de lactoză comparativ cu q, C (Wurm și colab., 2016). Lotul alimentat a fost întotdeauna cultivat pentru a avea un standard pentru producția de proteine ​​cu o rată de creștere specifică similară cu cea aplicată în chimiostat. Debitul de gaze de cultivare a fost analizat online folosind senzori de gaz - IR pentru CO2 și ZrO2 pe bază de oxigen (BlueSens Gas analytics, Herten, Germania). Controlul procesului și alimentarea au fost stabilite utilizând sistemul de control al procesului PIMS Lucullus (Securecell, Urdorf, Elveția).

tabelul 1. Sursă C și inducție pentru diferitele culturi.

Am folosit glucoză sau glicerol ca sursă de carbon și 0,5 mM IPTG pentru inducție. Pe parcursul tuturor fazelor de inducție, pH-ul este menținut constant la 6,7 ​​și temperatura la 30 ° C. pH-ul a fost controlat numai cu bază (12,5% NH4OH), în timp ce acidul (10% H3PO4) a fost adăugat manual, dacă este necesar. PH-ul a fost monitorizat folosind un senzor de pH EasyFerm Plus (Hamilton, Reno, NV, Statele Unite). Aerarea a fost efectuată folosind un amestec de aer sub presiune și oxigen pur la aproximativ 2 vvm pentru a menține oxigenul dizolvat (dO2) întotdeauna mai mare de 30%. Oxigenul dizolvat a fost monitorizat utilizând un electrod de fluorescență oxigen dizolvat Visiferm DO (Hamilton, Reno, NV, Statele Unite).

Pentru loturile hrănite, s-au efectuat controale qs în avans static în timpul fazei de inducție. Hrana exponențială a fost stabilită conform ecuației. 1, pentru a menține qs, C constant (Slouka și colab., 2016; Wurm și colab., 2016):

Cu F fiind viteza de avans [g/h], qs, C rata specifică de absorbție a glicerolului [g/g/h], X (t) biomasa absolută [g], ρF densitatea de alimentare [g/L] și cF concentrația de alimentare [g/L], respectiv. Pentru strategiile de control aplicate, adaptarea qs, C în timpul inducției a fost efectuată pe baza ecuației. 1. Cultivările chimostatice au fost setate manual la o rată de diluare de D = 0,1 h –1 pentru toate rulările efectuate.

Analize proces

Pentru lotul alimentat, probele au fost prelevate întotdeauna după inoculare, la sfârșitul fazei lotului și după terminarea lotului alimentat neindus. În timpul perioadei de inducție, probele au fost prelevate la maximum 120 de minute și analizate ulterior. Detalii despre analiza procesului pot fi găsite în altă parte (Kopp și colab., 2018; Slouka și colab., 2018). Pentru culturile de chemostat, probele au fost colectate după lot și apoi o dată sau, dacă este necesar, de două ori pe zi.

Analize de produs

Pregătirea

O probă de 5 ml de bulion de fermentație a fost centrifugată la 4800 rpm la 4 ° C timp de 10 min. Supernatantul a fost aruncat și peleta a fost resuspendată la un DCW de aproximativ 4 g/L în tampon de liză (100 mM Tris, 10 mM EDTA la pH = 7,4). Ulterior proba a fost omogenizată utilizând un omogenizator Gea PandaPlus (Gea, AG, Germania) la 1500 bari pentru 10 pasaje. După centrifugare la 10.000 rpm și 4 ° C timp de 10 min s-au păstrat 10 ml de supernatant pentru analiza proteinei solubile. Proteina solubilă a fost depozitată la 4 ° C. Peleta IB rezultată a fost spălată de două ori cu apă ultrapură. Alicotate de pelete în 2 ml bulion au fost centrifugate din nou (14000 rpm, 10 min 4 ° C) și în final depozitate la -20 ° C.

Titlul corpului de includere

Rezultate

Cultivările discontinue alimentate induse cu IPTG sunt standardul de aur pentru RPP cu E coli. Pentru a putea concura cu loturile hrănite, productivitatea specifică în culturile de chimostat trebuie să fie maximizată și durata fazei productive să fie prelungită, astfel încât randamentele de spațiu în timp să fie semnificativ crescute. Am testat două sisteme mixte de alimentare, glucoză/lactoză și glicerol/lactoză, pentru a găsi condiții pentru exprimarea stabilă a proteinelor în E coli chimostate.

Fed-Batch și chemostate utilizând Bl21 (DE3) exprimând GFP ca model de proteină

În primul rând, am comparat trei moduri diferite de cultivare folosind GFP ca model proteic. Deoarece IPTG este adesea denumit ca fiind toxic pentru celule după un anumit timp de inducție, am folosit lactoza ca inductor ușor în prima perioadă (Dvorak și colab., 2015). Pentru prima chimiostat a fost utilizată o hrană mixtă formată din glucoză și lactoză (Tabelul 1) (Figura 1). Pentru a ușura comparabilitatea între cultivarea lotului hrănit și chimiostatul, am urmărit rate de absorbție a substratului specifice similare - qs, C, care au dus la o rată de diluare a chimiostaticelor de 0,1 h -1. Parametrii respectivi ai procesului sunt prezentați în Tabelul 2.

figura 1. Comparație între (A) lot alimentat, (B) chimiostat alimentat cu glucoză/lactoză și (C) chimiostat glicerol/lactoză pentru producerea GFP recombinant utilizând Bl21 (DE3).