A contribuit în mod egal la această lucrare cu: Hongzhou Huang, Ying Ding

hidrogelare

Departamentul de afiliere pentru știința și industria cerealelor, Universitatea de Stat din Kansas, Manhattan, Kansas, Statele Unite ale Americii

A contribuit în mod egal la această lucrare cu: Hongzhou Huang, Ying Ding

Departamentul de Biochimie pentru Afiliere, Universitatea de Stat din Kansas, Manhattan, Kansas, Statele Unite ale Americii

Departamentul de afiliere pentru știința și industria cerealelor, Universitatea de Stat din Kansas, Manhattan, Kansas, Statele Unite ale Americii

Departamentul de afiliere pentru medicină diagnostic/patobiologie, Universitatea de Stat din Kansas, Manhattan, Kansas, Statele Unite ale Americii

  • Hongzhou Huang,
  • Ying Ding,
  • Xiuzhi S. Sun.,
  • Joi A. Nguyen

Cifre

Abstract

Citare: Huang H, Ding Y, Sun XS, Nguyen TA (2013) Hidrogelare peptidică și încapsulare celulară pentru cultura 3D a celulelor de cancer mamar MCF-7. PLOS ONE 8 (3): e59482. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0059482

Editor: Adam J. Engler, Universitatea din California, San Diego, Statele Unite ale Americii

Primit: 17 septembrie 2012; Admis: 14 februarie 2013; Publicat: 20 martie 2013

Finanțarea: Acest proiect a fost parțial finanțat de Programul de excelență țintit KSU și Programul de burse KSU Research Foundation, precum și contribuția (nr. 12-181-J) de la stația de experimentare agricolă din Kansas. Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Substraturile bidimensionale (2D), cum ar fi cultura țesutului de polistiren și suprafața analogilor tisulari, aduc o contribuție enormă la studiile moderne de celule in vitro; cu toate acestea, platformele 2D tradiționale nu pot imita cu precizie arhitectura 3D complexă a matricei extracelulare (ECM) în care locuiesc celulele native [1] - [4]. În cultura 2D, celulele monostrat experimentează o concentrație omogenă de substanțe nutritive și factori de creștere care induc medii celulare nenaturale și interacțiuni celulă-celulă, producând o morfologie plană și întinsă [5]. Studii recente au arătat că diferențele morfologice ale celulelor cultivate în 2D și 3D pot prezenta mai multe diferențe izbitoare în procesele celulare subtile, cum ar fi proliferarea, apoptoza, diferențierea, expresia genelor, migrația și sensibilitățile la medicamente [6] - [9]. Pe de altă parte, sistemele 3D biologice in vivo, cum ar fi modelele animale, sunt costisitoare și consumă mult timp. Prin urmare, sunt necesare sisteme avansate de model 3D in vitro pentru a umple golul dintre sistemele 2D inexacte și modelele animale, imitând complexitatea ECM și relevanța fiziologică a unui sistem biologic in vivo.

În acest studiu, o soluție de peptidă nou identificată numită h9e a fost preparată la pH neutru și amestecată cu mediu esențial minim (MEM, cu 10% FBS) la temperatura camerei. După amestecare, peptidele h9e se auto-asamblează într-o matrice de hidrogel cu o concentrație finală de peptidă de până la 1 mM (0,17%). Fără introducerea unui tampon suplimentar de formare a gelului sau ajustarea pH-ului sau temperaturii mediului, peptida oferă un proces convenabil și ușor de formare a hidrogelului și permite celulelor să fie înconjurate de mediul lor de cultură în timpul încapsulării celulare (Tabelul S1). Mai interesant, rezistența mecanică a acestei matrice de hidrogel prezintă o deformabilitate specială și o capacitate de reasamblare, care permit transformarea solubilă în gel prin pipetare repetată. O linie celulară de cancer de sân, MCF-7, a fost selectată ca model pentru a crește în cultura 3D a hidrogelurilor h9e-MEM. Studiile de morfologie, viabilitate și proliferare celulară au arătat că celulele au prezentat cito-arhitectură 3D în matricea hidrogel și au păstrat bioactivități ridicate pentru studii ulterioare după izolare. Cisplatina, un medicament anti-cancer, a fost utilizat pentru a-și examina eficacitatea asupra celulelor MCF-7 într-o matrice de hidrogel. În general, rezultatele arată un puternic sprijin că peptida h9e este un material promițător de cultură celulară 3D pentru testarea medicamentelor.

Materiale și metode

Materiale

N, N-Dimetilformamidă (DMF), Acid trifluoroacetic (TFA), piperidină, N, N-Diizopropiletilamină (DIEA), Triisopropilsilan (TIS), paraformaldehidă, glutaraldehidă, cis-Diamminediclor-platină, 0,4% au fost achiziționați din anticorpi anti-actinici Sigma-Aldrich (Milwaukee, WI). N-metilpirolidinonă (NMP), eter anhidru, diclorometan (DCM) și bicarbonat de sodiu au fost achiziționate de la Fisher Scientific (Pittsburgh, PA). Rink Amide MBHA Resin, 2- (1H-Benzotriazol-1-il) -1,1,3,3-tetrametiluroniu Hexafluorofosfat (HBTU) și toți aminoacizii protejați au fost cumpărați de la EMD Biosciences (San Diego, CA). N-hidroxibenzotriazolul (HOBT) a fost cumpărat de la CEM (Matthews, NC). Piruvat de sodiu, aminoacizi neesențiali, MEM cu săruri Eagle, soluție trypsină TrypLE Express, 4 ′, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) și vopsea fluorescentă Hoechst 33342 (10 mg/ml) au fost cumpărate de la Invitrogen (Carlsbad), CA). Serul bovin fetal (FBS) a fost achiziționat de la Atlanta Biologicals (Lawrenceville, CA). Anticorpii anti-supraviețuire, anti-Ki67 și anti-caspază-3 au fost obținuți de la Santa Cruz Biotechnologies (Santa Cruz, CA). Anticorpii anti-iepure/șoareci legați de HRP-caspase-3 și HRP au fost achiziționați de la Cell Signaling Technology (Danvers, MA).

Cultură de celule

Linia celulară de cancer mamar uman MCF-7 a fost achiziționată de la American Type Cell Culture (ATCC) (Manassas, MA). Celulele au fost crescute în mediu MEM cu 10% (v/v) FBS, 1 mM piruvat de sodiu, 17,9 mM bicarbonat de sodiu, 0,01 mg/mL insulină și 1% (v/v) aminoacid neesențial. Celulele au fost menținute în baloane de cultură tisulară T-75 cm2 (Greiner Bio-one, Begium) la 37 ° C cu 5% (v/v) CO2. Celulele au fost transmise în mod obișnuit cu tripsină, iar mediul a fost schimbat în fiecare zi.

Sinteza peptidelor și hidrogelarea

Peptida h9e a fost sintetizată conform unui protocol publicat anterior [36]. Pe scurt, peptidele au fost sintetizate pe un sintetizator automat de peptide cu microunde CEM Liberty (CEM Corporation, Matthews, NC) în conformitate cu strategia de bază-labilă 9-fluorenilmetoxicarbonil (Fmoc) cu rășină amidă Rink și aminoacizi protejați cu Fmoc. După deprotejarea finală a grupului Fmoc N-terminal, peptidele legate de rășină au fost deprotejate de lanțul lateral și clivate folosind TFA/TIS/apă (95/2,5/2,5 v/v). Peptidele au fost precipitate și spălate de trei ori cu eter anhidru, dizolvate în acetonitril și apă deionizată (50/50 v/v), apoi liofilizate. Greutatea moleculară și puritatea peptidelor sintetizate au fost confirmate prin spectroscopie de masă în timp de zbor cu desorbție/ionizare cu matrice asistată și cromatografie lichidă de înaltă performanță.

Peptida liofilizată a fost adăugată la 100 mM bicarbonat de sodiu și complet dizolvată prin agitare magnetică timp de 3 ore cu o concentrație finală de peptidă de 10 mM. Pentru hidrogelare, soluția peptidică a fost adăugată în MEM cu 10% FBS și amestecul a fost agitat manual timp de aproximativ 10 secunde. Hidrogelul peptidic s-a format în 15 minute la temperatura camerei cu o concentrație finală de peptidă de 1, 2 și 3 mM.

Teste reologice

Cultivarea celulelor în hidrogel h9e

Soluția h9e a fost sterilizată prin iradiere UV (254 nm) timp de 30 de minute înainte de încapsularea celulei. Celulele MCF-7 au fost desprinse din balon folosind tripsină și granulate prin centrifugare la 2.000 rpm timp de 5 minute. Supernatantul a fost îndepărtat și celulele peletizate au fost resuspendate în MEM. Numărul de celule a fost numărat utilizând un celometru Auto 2000 (Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA). Celulele MCF-7 care conțin MEM au fost bine amestecate cu soluție de peptidă h9e și amestecul a fost însămânțat în fiecare godeu al unei plăci de cultură cu 12 godeuri (Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ). Placa de cultură a fost plasată într-un incubator la 37 ° C (Thermo Scientific, Asheville, NC) timp de aproximativ 30 de minute. După hidrogelare completă, 1 ml de MEM a fost adăugat cu atenție la vârful hidrogelului pentru a preveni uscarea în timpul incubației pe termen lung. Mediul de pe vârful hidrogelului a fost schimbat la fiecare 2 zile.

Izolarea celulelor de la H9e Hidrogel

Pentru a izola celulele de matricea de hidrogel, s-au adăugat 2 ml de MEM la fiecare cultură de celule de hidrogel în placa cu 12 godeuri. Hidrogelul cu celule încorporate a fost bine amestecat cu MEM folosind o pipetă și transferat într-un tub de centrifugă. S-au adăugat încă 4 ml de MEM pentru a spăla bine cultura celulară și s-au colectat în tubul de centrifugă. S-a adăugat în godeu un ml de soluție de tripsină, care a permis celulelor să se detașeze de godeu. Placa a fost incubată la 37 ° C timp de 5 minute și soluția a fost colectată din nou în tubul de centrifugă. Tubul de centrifugă a fost plasat pe gheață. S-au adăugat încă 6 ml MEM la tubul centrifugii pentru un volum final de 15 ml. Soluția a fost bine amestecată și celulele au fost peletizate prin centrifugare la 2.000 rpm timp de 5 minute la 4 ° C. Supernatantul a fost îndepărtat și celula de pelete a fost colectată.

Analiza distribuției celulare

Celulele MCF-7 (1 × 106 celule/godeu) au fost cultivate în hidrogel 3 mM h9e/MEM timp de 5 zile. Clusterele de celule au fost izolate din matricea de gel și resuspendate în 2 mL MEM. S-au adăugat zece pl (10 mg/ml) colorant fluorescent Hoechst 33342 pentru a colora nucleii celulelor. Soluția celulară a fost incubată la 37 ° C timp de 30 de minute. Celulele marcate au fost spălate de 3 ori cu mediu MEM și recapsulate în matricea de 3 mM h9e/MEM hidrogel. Construcțiile de celule/gel au fost observate pe un microscop confocal LSM 700 (Zeiss, Jena, Germania).

Microscopie electronică de scanare (SEM)

Rețeaua de nanofibre a schelelor de hidrogel, precum și caracterele de suprafață ale celulelor cultivate 3D au fost observate sub SEM. Probele de hidrogel au fost deshidratate cu concentrații crescânde de etanol de la 50% (v/v) la 100% (v/v) la 5% pe etapă și 15 minute pentru fiecare etapă. Etanolul a fost apoi îndepărtat de un uscător cu punct critic (Samdri-790B, Tousimis Research Corp., Rockville, MD). Probele de hidrogel cu celule au fost fixate într-un amestec de paraformaldehidă 2% și glutaraldehidă 2% timp de 30 de minute înainte de deshidratare și uscare punct critic. Probele au fost apoi acoperite cu pulverizare (Desk II Sputter/etch Unit, Denton Vaccum, Moorestown, NJ) de 3 ori (12 secunde de fiecare dată) cu 100% Pt. Observarea SEM a fost efectuată cu un FEI, Nova NanoSEM 430 (Hillsboro, ON) la 5 kV și printr-un detector de lentile.

Morfologie celulară

Celulele MCF-7 (2,8 × 105 celule/godeu) au fost cultivate în monostraturi 2D sau hidrogeluri 3D (1, 2 și 3 mM h9e/MEM hidrogel) timp de 1, 3, 5 și 7 zile. Caracterele morfologice ale celulelor au fost determinate folosind un microscop cu lumină inversată (Nikon Eclipse TE2000-u, Kanagawa, Japonia) în zilele 1, 3, 5 și 7.

Viabilitatea celulară și proliferarea celulară

Celulele MCF-7 (2,8 × 105 celule/godeu) au fost cultivate în monostraturi 2D sau hidrogeluri 3D (1, 2 și 3 mM h9e/hidrogel MEM). Celulele din cultura 2D au fost recoltate și celulele din cultura 3D au fost izolate în zilele 1, 3, 5 și 7. O suspensie celulară a fost amestecată cu 0,4% colorant albastru tripan la raportul 1∶1 (v/v). Viabilitatea celulei și numărul de celule viabile au fost examinate de Cellometer Auto 2000 (Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA).

Tratarea celulelor cu medicamente

Celulele MCF-7 (0,5 × 106 celule/godeu) au fost cultivate în hidrogel 3 mM h9e/MEM timp de 5 zile. După 5 zile de incubație, sferoidele celulare au fost izolate și tratate cu 40 uM cisplatină prin trei metode: suprafață superioară, transwell superior-inferior și pre-amestecate cu mediu și peptidă. Pentru metoda suprafeței superioare, sferoidele celulare izolate au fost recapsulate în matricea de 3 mM h9e/MEM hidrogel și cultivate în plăci cu 12 godeuri. Un ml de mediu MEM conținând 40 uM cisplatină a fost plasat deasupra hidrogelului în fiecare godeu. Pentru metoda transwell, grupurile de celule izolate au fost recapsulate în matricea de hidrogel 3 mM h9e/MEM și cultivate pe un insert transwell. Mediul MEM conținând 40 uM cisplatină a fost plasat pe camerele de sus și de jos. Pentru metoda pre-amestecată, grupurile de celule izolate au fost resuspendate în mediu MEM conținând 3 mM peptidă h9e și 40 uM cisplatină. Amestecul a fost adăugat în plăci cu 12 godeuri (1 ml de amestec/godeu) pentru hidrogelare. Un ml de MEM a fost adăugat cu atenție la vârful hidrogelului pentru a preveni uscarea în timpul incubației pe termen lung. Mediul a fost schimbat la fiecare 2 zile în toate metodele. Viabilitatea celulară a fost examinată în zilele 0, 1, 3, 5 și 10 utilizând metoda de excizie în albastru tripan.

Imunofluorescență și microscopie confocală

Analiza Western Blot

Celulele MCF-7, cultivate în monostrat 2D și hidrogel 3D, au fost tratate cu cisplatină. Celulele crescute în 2D au fost tripsinizate și granulate prin centrifugare la 2.000 rpm timp de 5 minute. Celulele crescute în hidrogeluri 3D au fost izolate așa cum s-a descris mai sus. După spălare cu PBS, celulele au fost incubate în tampon de liză (Cell Signaling Technology, Danver, MA) timp de 5 minute. Lizatele celulare au fost sonicate cu ajutorul unui sonicator Vibra-Cell (Sonics & Materials Inc, Danbury, CT) și apoi centrifugate la 13.000 rpm timp de 30 de minute la 4 ° C. După centrifugare, supernatanții au fost colectați ca extracte de celule întregi. 30 de ug de probe au fost separate cu gradient de 4-20% SDS-PAGE timp de 35 de minute la 200 V și transferate în membrane de nitroceluloză (Midwest Scientific, Saint Louis, MO). Membranele au fost blocate cu lapte 5% timp de 30 de minute și imunoblotate împotriva proteinelor de interes. Imunoreacțiile care utilizează chemiluminiscență au fost vizualizate de FluorChem E Imaging Instrument (ProteinSimple, Santa Clara, CA). Intensitățile benzilor au fost digitalizate utilizând software-ul Un-Scan-It.

Analize statistice

Testul t cu două eșantioane a fost utilizat pentru a analiza diferența dintre diferitele tratamente. O valoare P mai mică de 0,05 a fost considerată semnificativă statistic.

Rezultate si discutii

Hidrogelare peptidică în MEM

Pentru a iniția formarea gelului, s-au adăugat 100 pl de soluție peptidică 10 mM h9e (pH 7-8) la 900 µL mediu MEM pentru a forma 1 ml amestec cu 1 mM (0,17% g/v) concentrație peptidică (Figura 1A). Morfologia la scară nanomatică a matricei de hidrogel este prezentată de imaginea SEM (Figura 1A). Hidrogelarea peptidică indusă direct prin amestecarea soluției de peptidă cu pH neutru cu MEM nu numai că evită procesele complexe de reticulare cu gel chimic, dar folosește și un mediu utilizat în mod obișnuit în cercetarea biologică și medicală, oferind o stare fiziologică încapsulării celulare.

A. Mecanismul propus de hidrogelare auto-asamblare a peptidei h9e induse de MEM (imaginea SEM care arată schela nanofibre a matricei de hidrogel). B. Modulul de stocare G 'de 1, 2 și 3 mM hidrogel peptidic în timpul hidrogelării la 37 ° C. C. Imagine SEM a hidrogelului peptidic 1 mM. D. Imagine SEM a hidrogelului peptidic 3 mM.

Încărcarea directă a medicamentelor, proteinelor sau celulelor în timpul formării gelului este una dintre cele mai convenabile și eficiente modalități de încapsulare [33], [34]. Pentru a asigura distribuția omogenă a moleculelor încorporate, peptidele ar trebui să se asambleze ca o rețea de nanofibre într-o perioadă relativ scurtă, cu o rezistență rezonabilă, ținând moleculele suspendate înainte de precipitarea lor. Pentru a determina rata de formare a gelului peptidic, hidrogelurile au fost preparate cu trei concentrații, 1 mM (0,17% g/v), 2 mM (0,34% g/v) și 3 mM (0,51% g/v) și MEM. Modulul de stocare a soluției a fost măsurat la 37 ° C imediat după amestecarea amănunțită. Figura 1B prezintă formațiunile de hidrogel peptidic h9e cu module de stocare stabile în jur de 100, 400 și, respectiv, 700 Pa. Viteza de formare a gelului crește odată cu concentrațiile de peptide (inserția din Figura 1B) și toți cei trei hidrogeli au atins o rezistență de susținere (aproape sau peste 100 Pa) în decurs de 15 minute. Imaginile SEM (Figura 1C, D) indică faptul că arhitectura hidrogelului este construită prin încurcarea nanofibrelor cu lățimea de 20 nm; cu toate acestea, hidrogelul cu concentrație mai mică (1 mM, Figura 1C) prezintă o structură matricială relativ mai slabă în comparație cu structura compactă a hidrogelului cu concentrație mai mare (3 mM Figura 1D). Aceste dovezi vizuale susțin în continuare diferențele de forță ale diferitelor concentrații de hidrogeli.

Studiu reologic dinamic al hidrogelului h9e

Deformabilitatea și capacitatea de reasamblare a hidrogelului h9e indus de MEM au fost evaluate printr-un test reologic dinamic. Hidrogelurile peptidice cu 1-3 mM au fost depozitate la temperatura camerei peste noapte, apoi transferate într-un sistem de măsurare și stabilizate timp de 10 minute. Prin subțierea la forfecare la o tulpină de 500% timp de 1 minut, toți cei trei hidrogeli au fost transformați în stare lichidă, prezentând un G ′ mai mic de 0,2 Pa (Figura 2A). După oprirea subțierii prin forfecare, parametrii instrumentului au fost resetați după 1 minut de așteptare și recuperarea hidrogelului a fost monitorizată folosind 1% forță de forfecare timp de 1 oră. Datele din Figura 2A G 'de recuperare a hidrogelului în timpul acestui test de 1 oră.

A. Modulul de depozitare G 'al testului de subțire prin forfecare și recuperare a 1, 2 și 3 mM hidrogel peptidic. B. Test de măturare a amplitudinii de patru ori cu forță de forfecare de la 1% la 500% și pauze de 1-5 și 10 minute. C. Livrarea de mai multe ori a hidrogelului peptidic prin pipetă; hidrogelul a fost subțiat prin forfecare, dar s-a reasamblat rapid, fără a distruge definitiv arhitectura hidrogelului. D. Testul profilului de temperatură al hidrogelului peptidic 1, 2 și 3 mM între 4 ° C și 50 ° C.

Pentru studiul biologic, temperaturile cuprinse între 4 ° C și 37 ° C sunt aplicate în mod obișnuit pentru multe proceduri operaționale standard in vitro; prin urmare, răspunsul materialelor hidrogel la variațiile de temperatură are un impact mare asupra aplicațiilor lor practice. Testul profilului temperaturii reologice a fost efectuat pentru a aborda această provocare. Temperatura a fost ajustată de la 4 ° C la 50 ° C pentru două cercuri de testare. Figura 2D prezintă faptul că G ′ al hidrogelurilor se mișcă odată cu temperatura și are o performanță de 2-3 ori mai mare la 50 ° C decât la 4 ° C. Acest răspuns termic este reversibil în funcție de cercurile de încălzire și răcire ale hidrogelului (Figura 2D). Rezultatele oferă dovezi pentru utilizarea hidrogelului peptidic h9e ca cultură de celule 3D. Matricea de hidrogel este rigidizată pentru încapsularea celulelor atunci când rămâne la 37 ° C, dar este slăbită la 4 ° C pentru izolarea celulei utilizând metoda standard de centrifugare.

Distribuția celulară și cultura celulelor 3D în hidrogel h9e