Departamentul de Medicină, Endocrinologie și Diabet, Universitatea Leipzig, Leipzig, Germania;

Institutul de Biochimie, Universitatea Leipzig, Leipzig, Germania;

IFB AdiposityDiseases, Junior Research Group 2 „Modele animale de obezitate”, Universitatea Leipzig, Leipzig, Germania; și

Departamentul de Medicină, Endocrinologie și Diabet, Universitatea Leipzig, Leipzig, Germania;

Departamentul de Medicină, Endocrinologie și Diabet, Universitatea Leipzig, Leipzig, Germania;

IFB AdiposityDiseases, Universitatea Leipzig, Leipzig, Germania

Departamentul de Medicină, Endocrinologie și Diabet, Universitatea Leipzig, Leipzig, Germania;

Departamentul de Medicină, Endocrinologie și Diabet, Universitatea Leipzig, Leipzig, Germania;

Departamentul de Medicină, Endocrinologie și Diabet, Universitatea Leipzig, Leipzig, Germania;

IFB AdiposityDiseases, Universitatea Leipzig, Leipzig, Germania

IFB AdiposityDiseases, Universitatea Leipzig, Leipzig, Germania

Departamentul de Medicină, Endocrinologie și Diabet, Universitatea Leipzig, Leipzig, Germania;

IFB AdiposityDiseases, Universitatea Leipzig, Leipzig, Germania

Departamentul de Medicină, Endocrinologie și Diabet, Universitatea Leipzig, Leipzig, Germania;

IFB AdiposityDiseases, Junior Research Group 2 „Modele animale de obezitate”, Universitatea Leipzig, Leipzig, Germania; și

Adresa pentru cereri de reimprimare și alte corespondențe: N. Klöting, Dept. de Medicină, Endocrinologie și Diabet, Universitatea Leipzig, Leipzig, Germania (e-mail: [email protected]).

Abstract

O diferență genetică studiată pe scară largă între șoarecii C57BL/6J și C57BL/6N a fost găsită în nucleotida transhidrogenază a nicotinamidei (Nnt) genă pe cromozomul 13. În tulpina C57BL/6J, o mutație missense (metionină la treonină), în combinație cu mutația de deleție a exonului în cadrul 5 (eliminarea a patru elici transmembranare putative), are ca rezultat o variantă Nnt trunchiată și semnificativ mai mică Expresia proteinei Nnt în ficat și insule (14, 46). Activitatea Nnt a fost legată de alterarea metabolismului glucozei și secreția de insulină (13, 46).

Genotiparea recentă a polimorfismelor cu nucleotide unice (SNPs) a identificat diferențe genetice suplimentare între substanțele C57BL/6J și C57BL/6N la 11 loci (24, 31, 51). Un SNP a fost găsit între substrenele C57BL/6J, în timp ce nu s-au detectat diferențe genetice între substrenele C57BL/6N (31, 51). Cinci din cele 11 loci map în cadrul genelor cunoscute. Genotipul factorului de creștere a fibroblastelor 14 (Fgf14), LIM și domenii asemănătoare antigenului celulelor senescente 1 (Lims1), proteina 2 asemănătoare unui precursor amiloid (Aplp2) și proteina solubilă de atașament a factorului n-etilmaleimidă 29 (Snap29) diferă între tulpinile C57BL/6N și C57BL/6J și un SNP asociat cu dipeptidază acidă asemănătoare 2 cu N-acetilată cu dipeptidază acidă (Naaladl2) între anumite substrene C57BL/6J.

Studiile asupra obezității induse de dietă bogată în grăsimi (HFD) au relevat diferențe între substrainele de bază C57BL/6NTac și C57BL/6JRj în ceea ce privește răspunsul lor la un HFD și dezvoltarea DIO (36). Recent, am raportat diferențe fenotipice în condiții HFD între substanțele C57BL/6NTac și C57BL/6JRj și am constatat că tulpina C57BL/6JRj este protejată împotriva DIO independent de activitatea fizică și de aportul alimentar (24).

Pentru a defini diferențele genetice cauzale care pot sta la baza și explica variabilitatea reacției HFD și a manifestării DIO la șoarecii C57BL/6J și C57BL/6N, am caracterizat genetic și fenotipic primii hibrizi backcross (BC1) ai șoarecilor C57BL/6NTac și C57BL/6JRj [( C57BL/6NTac × C57BL/6JRj) F1 × C57BL/6NTac]. În plus, pentru a evalua dacă polimorfismele SNP ar putea afecta nivelurile de ARNm, am efectuat analize de exprimare a genei în timp real pe probe de ficat murin și țesut adipos subcutanat uman.

Animale și fenotipare.

Toate experimentele au fost conforme cu Ghid pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator publicate de Institutele Naționale de Sănătate ale SUA (publicația nr. 85-23, revizuită în 1996) și au fost aprobate de autoritățile locale (Regierungspräsidium Leipzig) din statul Saxonia, Germania, după cum recomandă comitetul local de evaluare a eticii animalelor.

Genotiparea SNP.

ADN-ul a fost extras din vârfurile cozii cu kitul DNeasy (Qiagen, Hilden, Germania). Genotiparea SNP a fost făcută folosind testul TaqMan SNP Genotyping conform protocolului producătorului (Applied Biosystems, Foster City, CA). Pentru a evalua reproductibilitatea genotipării, am regenotipiat o selecție aleatorie de 5% a eșantionului pentru toate SNP-urile; toate genotipurile s-au potrivit cu genotipurile inițiale desemnate. Mai mult, ADN-ul genomic de la hibrizii F1 și tulpinile parentale au servit drept martori. Ratele de apel pentru toate SNP-urile au variat de la 98 la 100%.

Analiza expresiei.

ARN-ul total a fost izolat din ficat congelat rapid (n = 7 per genotip) și țesut adipos subcutanatn = 6 pe genotip) eșantioane folosind kitul RNeasyMini (Qiagen). RT-PCR a fost efectuat cu sistemul TaqMan 7500 (ABI, Darmstadt, Germania). 36B4 a fost folosit ca referință internă. S-au folosit următoarele grunduri: Snap29 5′-AGGCTACAGGATGCAGAACTAGACT-3 ′ (înainte) și 5′-TGTCATCCTGTTCCTCAATTTCT-3 ′ (invers), Aplp2 5′-CCGAATGGACAGGGTAAAGA-3 ′ (înainte) și 5′-CACAAGCTGCTGCTTCTCAC-3 ′ (invers), Lims1 5′-GGAGCTGAAAGGGGAGCTAT-3 ′ (înainte) și 5′-TGCCCAAGAAATGGTTTTTC-3 ′ (invers), Snca 5′-CAGAGGCAGCTGGAAAGACA-3 ′ (înainte) și 5′-CACCACTGCTCCTCCAACAT-3 ′ (invers). Expresia genetică relativă a fost calculată prin metoda curbei standard.

Subiecți umani.

Țesutul adipos subcutanat a fost obținut de la 234 bărbați caucazieni (n = 84) și femein = 150) care au fost supuși unei intervenții chirurgicale abdominale deschise pentru colecistectomie, apendectomie, intervenție chirurgicală de reducere a greutății, leziuni abdominale sau laparotomie explorativă (Tabelul 1). Vârsta a variat de la 18 la 89 de ani și indicele de masă corporală (IMC) de la 14,1 la 71,0 kg/m 2. Șaizeci și nouă de subiecți au avut diabet de tip 2. Toți subiecții au avut o greutate stabilă, fără fluctuații de> 3% din greutatea corporală timp de cel puțin 3 luni înainte de operație. Pacienții cu afecțiuni severe, inclusiv inflamație generalizată sau boli maligne în stadiu final, au fost excluși din studiu. Probele de țesut adipos visceral și subcutanat au fost imediat congelate în azot lichid după explicație. Studiul a fost aprobat de Comitetul de Etică al Universității din Leipzig (Germania). Toți subiecții au dat consimțământul scris în scris înainte de a lua parte la studiu.

Tabelul 1. Caracteristicile antropometrice și metabolice ale grupurilor de studiu

Datele sunt mijloace ± SD; n = 234.

SC, subcutanat; CT, tomografie computerizată; IMC, indicele de masă corporală; WHR, raport talie-șold; FPG, glucoză plasmatică în post; FPI, insulină plasmatică de post; OGGT, test oral de toleranță la glucoză.

Diferențe semnificative statistic între sexe la P valoare

* † ‡

identificarea

FIG. 1.Manifestarea obezității induse de dietă bogată în grăsimi în substrenele parentale, hibrizii F1 și BC1. Creșterea în greutate corporală a C57BL/6JRj și C57BL/6NTac parentale în comparație cu șoarecii F1 (femele, 6 săptămâni HFD) (A) sau în comparație cu alele benefice sau de risc care poartă hibrizi BC1 (șoareci masculi, 8 săptămâni HFD)B). Greutatea corporală a părinților masculini C57BL/6JRj și C57BL/6NTac, precum și a purtătorilor BC1 de alele benefice și de risc după 8 săptămâni sub HFD (C). Combinație de alele benefice: (C/C) de rs13480122Aplp2) și (C/T) din rs13481014; combinație de alele de risc: (C/T) de rs13480122Aplp2) și (C/C) din rs13481014. Datele sunt prezentate ca mijloace ± SD. P valori la * 0,05, ** 0,01 niveluri. BC1, primul backcross; HFD, dietă bogată în grăsimi.

Tabelul 2. Creșterea în greutate corporală indusă de dietă bogată în grăsimi la hibrizii încrucișați și la tulpinile de control parental

Datele reprezintă mijloace ± SD. Asociere sugestivă între variantele de genotip (necorectată P valori la * 0,05, † 0,01 niveluri).

‡ Asociere semnificativă între variantele de genotip (P valori

Tabelul 3. Masele de organe specifice și concentrațiile serice de post în hibrizi BC1 și tulpini de control parental

Datele reprezintă mijloace ± SD. Asociere sugestivă între variantele de genotip (necorectată P valori la * 0,05, † 0,01 nivel).

BC1, primul backcross; Epi, epigonadal.

Combinație de alele benefice: șoareci masculi, (C/C) din rs13480122 și (C/T) din rs13481014; șoareci femele, (G/G) pentru rs13478783 și (C/C) pentru rs4165065. Combinație de alele de risc: șoareci masculi, (C/T) pentru rs13480122 și (C/C) pentru rs13481014; șoareci femele, (G/A) pentru rs13478783 și (C/T) pentru rs4165065. Boldface evidențiază asociații sugestive și semnificative.

Pentru șoareci femele BC1, purtătorii homozigoti ai SNP-urilor rs13478783 (G/G), precum și rs4165065 (C/C) au câștigat mai puțină greutate după 8 săptămâni de HFD (Tabelul 2), dar au prezentat doar o masă de grăsime epigonadală nesemnificativ mai mică comparativ cu colegii heterozigoți ( Tabelul 3).

Pentru ambele sexe, am găsit asociații sugestive/nominale între rs13478783 (G/G), rs13481014 (C/T) și niveluri mai mici de leptină serică (Tabelul 3). În plus și numai la bărbați, rs13478783 (G/G) a fost asociat cu concentrații mai mici de insulină serică P valoarea 30 kg/m 2 a relevat subcutanat semnificativ mai scăzut SNAP29 Expresia ARNm în subgrupul obez (Fig. 2C). Analiza de corelație univariată a întregii populații studiate (n = 234) au identificat corelații semnificative între subcutanat SNAP29 expresia genei și IMC (r = -0.267, P

FIG. 2.Analiza relativă a expresiei genelor în ficatul șoarecelui (A) și țesutul adipos subcutanat (B) de Snap29, Snca, Aplp2 în diferite genotipuri și SNAP29 nivelurile de ARNm în țesutul adipos subcutanat uman (C). Rezultatele prezente înseamnă ± SE din n = 6 probe de ficat și țesut adipos subcutanat pe genotip. Rezultatele prezente înseamnă ± SE de la subiecții slabi (n = 44) vs. subiecți obezi (n = 190). *P

Tabelul 4. Corelații univariate între expresia mARN-ului SNAP29 uman și parametrii obezității, distribuției grăsimilor, metabolismului glucozei și lipidelor și adipokinelor

În plus, SNP rs4165065 prezintă un efect specific femeilor pe hărțile DIO din cadrul Snap29 genă, care a fost legată de disgenezie cerebrală, neuropatie, ihtioză și sindromul cheratodermie (CEDNIK) și schizofrenie (15, 39, 42). SNAP29 este un membru al familiei de proteine ​​ale receptorului SNAP (SNARE), care sunt necesare pentru traficul de vezicule și, prin urmare, sunt esențiale în numeroase procese fiziologice (7, 49). Proteinele SNARE par a fi în principal responsabile de medierea fuziunii dintre vezicule și membrana țintă a acestora (11). Două mutații de pierdere a funcției în Snap29 gena duce la sindromul neurocutanat CEDNIK la om (15, 42). La nivel molecular, pierderea SNAP29 a dus la reciclarea afectată a transferinei și a β1-integrinei, demonstrând importanța fuziunii membranei mediate de SNAP29 în reciclarea endocitică și, în consecință, a motilității celulare (37). S-a raportat că SNAP29 este prezent la sinapse și inhibă dezasamblarea complexului SNARE și pare să moduleze transmisia sinaptică și reciclarea post-fuziune a componentelor SNARE (44).

SNP rs13478783 este situat la 150 kb în amonte de α-sinucleină (Snca) gena. SNCA este cunoscut în primul rând pentru rolul său proeminent ca semn distinctiv molecular al mai multor afecțiuni neurodegenerative, cum ar fi boala Parkinson, denumită acum sinucleinopatii (41). Există dovezi puternice cu privire la rolul SNCA în reglarea eliberării sinaptice-veziculare, indicând un efect stabilizator asupra complexelor de proteine ​​din familia SNARE (9, 26, 34). În acest context, SNCA s-a dovedit a fi un ligand citoplasmatic al granulei secretoare de insulină și că interacționează cu canalele KATP și, în consecință, a prezentat o acțiune inhibitoare asupra secreției de insulină (16). Expresia exogenă a SNCA a inhibat secreția de insulină în celulele INS1-832/13, în timp ce pierderea expresiei SCNA a potențat secreția de insulină în insulele ASKO cu deficit de SNCA (16). În plus, studii recente au demonstrat stimuli inflamatorii induși de expresia SNCA în macrofage și o capacitate inerentă SNCA de activare a macrofagelor în funcție de domeniile NH2-terminale și COOH-terminale ale proteinei (27, 45). Un posibil rol de reglementare al SCNA în procesele inflamatorii ar putea prezenta o legătură între SCNA și țesutul adipos și obezitate, deoarece obezitatea este bine stabilită ca stare de inflamație sistemică și cronică, de grad scăzut.

Pentru a evalua dacă diferențele SNP ar putea afecta Snap29, Aplp2, și Snca, am investigat expresia genei în timp real de la șoareci C57BL/6JRj, C57BL/6NTac și heterozigoți din probe de ficat. Aici am constatat că Snap29 ARNm este semnificativ suprareglat în ficat și țesutul adipos al șoarecilor C57BL/JRj, indicând asocierea între genotip și nivelul ARNm. Deoarece Snap29 pare să aibă cele mai puternice efecte la șoareci, am efectuat analize ale expresiei genelor și în țesutul adipos uman subcutanat. In comparatie cu SNAP29 Expresia ARNm în subgrupuri de IMC 30 kg/m 2 a evidențiat SC semnificativ mai scăzut SNAP29 Expresia ARNm în subgrupul obez (Fig. 2B), indicând o asociere între SNAP29 Nivelul ARNm și măsurile obezității. Analizele de corelație univariate ale întregii populații studiate au identificat corelații semnificative legate în primul rând de parametrii obezității și distribuției grăsimilor. Aceste corelații nu au rămas semnificative după vârstă, sex și IMC au fost ajustate și corectate pentru teste multiple. Aceste date de expresie sugerează un rol potențial al SNAP29 în manifestarea obezității și sau a DIO.

Concluzie

În rezumat, am identificat SNP-uri specifice sexului între substrainele C57BL/6NTac și C57BL/6JRj care sunt asociate cu creșterea în greutate corporală și masa relativă a depozitului de grăsime sub HFD la hibrizii BC1 ai șoarecilor C57BL/6NTac și C57BL/6JRj [(C57BL/6NTac × C57BL/6JRj) F1 × C57BL/6NTac]. Pentru maparea SNP în cadrul genelor cunoscute sau în apropiere, Aplp2, Snap29, și Snca sunt toți implicați în boli sau sindroame neurodegenerative severe sau neurocutanate. Analiza expresiei genelor la șoareci și țesut uman identificat Snap29 ca cel mai puternic candidat pentru parametrii legați de obezitate și distribuția grăsimilor. Și, deși cunoașterea și înțelegerea funcțiilor moleculare ale acestor gene sunt, în general, limitate, genele legate de SNP raportate în acest studiu ca asociate cu manifestarea DIO au toate un teren funcțional comun ca fiind implicate în eliberarea veziculelor sinaptice și stabilitatea complexului SNARE.

Datele noastre demonstrează că capacitatea de reacție DIO este asociată cu disparitatea genetică între substrainele C57BL/6NTac și C57BL/6JRj și sugerează că genele sistemului de eliberare a veziculelor sinaptice sunt implicate în reglarea DIO cu conținut ridicat de grăsimi.

Această lucrare a fost susținută de granturile Deutsche Forschungsgemeinschaft, SFB1052 „Mecanisme de obezitate” (B1 M. Blüher, B4 N. Klöting, C7 J. T. Heiker) și Ministerul Federal al Educației și Cercetării, Germania, FKZ: 01EO1001 (N. Klöting).