Toxina țintită DARPin-LoPE și citotoxicitatea sa împotriva modelelor carcinomului uman 2D și 3D in vitro. (A) Construcție genetică care codifică DARPin-LoPE. DARPin (verde închis), DARPin specific HER29.29; LoPE (purpuriu), Pseudomonas exotoxină trunchiată A lipsită de domeniile Ia, Ib, majoritatea epitopilor celulelor B umane din domeniul II și umane; His6 (verde deschis), marcaj hexahistidină C-terminal; K (portocaliu), secvența KDEL. Gena de fuziune se află sub controlul promotorului T7; (B) Viabilitatea relativă a celulelor adenocarcinomului ovarian uman HER2-pozitiv SKOV3.ip1 în cultura monostrat 2D (test MTT) după un tratament de 72 de ore cu concentrații diferite de DARPin-PE40 (cercuri negre) sau DARPin-LoPE (triunghiuri transparente); (C) Volumul relativ de sferoide 3D ale celulelor adenocarcinomului ovarian uman HER2-pozitiv SKOV-kat după un tratament de 96 ore cu concentrații diferite de DARPin-LoPE. Datele sunt reprezentate ca medie ± SEM. „*” Indică o valoare care diferă semnificativ de valoarea de control respectivă la p n = 6).

Schema studiului toxicității generale și imunogenității DARPin-LoPE și DARPin-PE40. „0” denotă analiza parametrilor studiați la animale înainte de începerea cursului de tratament. Ziua primei injecții a toxinelor vizate a fost stabilită ca ziua 1. Tratamentul cu toxinele vizate a fost efectuat în două cure de patru injecții la fiecare două zile, cu o pauză de o lună între cursuri, adică în zilele 1, 3, 5, 7 (primul curs) și 40, 42, 44 și 46 (al doilea curs). Leucocitele au fost analizate prin citometrie în flux în zilele 8 și 17 după începerea fiecărui curs (adică în zilele 8, 17, 47 și 56, marcate cu roșu). Activitatea alaninei aminotransferazei (ALT) și a aspartatului aminotransferazei (AST) în ser a fost măsurată în zilele 6 și 18 după începerea fiecărui curs (adică în zilele 6, 18, 45 și 57, marcate cu albastru). Testul de titrare a anticorpilor a fost efectuat la două și trei săptămâni după terminarea primului tratament și la două și cinci săptămâni după încheierea celui de-al doilea tratament (adică în zilele 20, 27, 60 și 80, marcate cu verde). Animalele au fost eutanasiate în ziua 90, iar organele au fost luate pentru studiu histologic (marcate cu negru).

Greutatea medie a șoarecilor în diferite grupuri. Zilele injecțiilor cu toxine vizate sunt indicate cu săgeți (4 injecții pe curs, 2 cursuri). PBS, șoareci tratați cu soluție salină tamponată cu fosfat (grup martor); DARPin-LoPE 4 × 10 µg, șoareci tratați cu 10 µg DARPin-LoPE pentru 4 doze la fiecare două zile (40 (g pe curs, 80 µg total); DARPin-LoPE 4 × 20 pg, șoareci tratați cu 20 pg DARPin-LoPE pentru 4 doze la fiecare două zile (80 (g pe curs, 160 pg total); DARPin-PE40 4 × 10 pg, șoareci tratați cu 10 pg DARPin-PE40 pentru 4 doze la fiecare două zile (40 (g pe curs, 80 pg total). Datele sunt reprezentate ca medie ± SEM. „*” Indică o valoare care diferă semnificativ de valoarea de control respectivă la p n = 5).

Colorarea hematoxilinei și a eozinei a secțiunilor de organe ale șoarecilor în diferite grupuri. Leziunile degenerative ale țesutului la tratamentul cu toxinele vizate sunt indicate cu săgeți. La șoarecii tratați cu 4 × 10 μg DARPin-PE40 porțiunea pulpei albe a splinei este crescută într-o zonă de învelișuri periarteriolare. La șoarecii tratați cu 4 × 10 μg DARPin-PE40 sau 4 × 20 μg DARPin-LoPE, spațiul peribronchovascular este dilatat în plămâni, precum și locurile de hemoragie și necroză sunt observate la rinichi. Pentru imagini de splină bara de scală este de 200 µm, mărire × 100; pentru scara pulmonară, renală, cardiacă și hepatică este de 100 µm, mărire × 200.

Dinamica titrurilor de anticorpi specifici toxinelor vizate. Ziua primei injecții a toxinelor vizate a fost stabilită în ziua 1. 0 este pentru măsurarea titrurilor de anticorpi în serul șoarecilor înainte de începerea primului curs de tratament. PBS, șoareci tratați cu soluție salină tamponată cu fosfat (grup martor); DARPin-LoPE 4 × 10 µg, șoareci tratați cu 10 µg DARPin-LoPE pentru 4 doze la fiecare două zile (40 (g pe curs, 80 µg total); DARPin-LoPE 4 × 20 pg, șoareci tratați cu 20 pg DARPin-LoPE pentru 4 doze la fiecare două zile (80 pg pe curs, 160 pg total); DARPin-PE40 4 × 10 µg, șoareci tratați cu 10 µg DARPin-PE40 pentru 4 doze la fiecare două zile (40 µg pe curs, 80 µg total). „*” Indică o valoare care diferă semnificativ de valoarea respectivă de control (PBS) la ppn = 5). Datele sunt reprezentate ca medie ± SEM.

Celulele fluorescente ale carcinomului ovarian uman SKOVip-kat și răspunsul lor la tratamentul DARPin-LoPE in vitro. (A) Vizualizarea celulelor SKOVip-kat care exprimă proteina Katushka (roșie) în lumina transmisă (în partea de sus) și prin microscopie confocală (în partea de jos). Dimensiunea imaginii 135 × 135 µm; (B) Analiza conținutului de suprafață al proteinei HER2 pe celule SKOVip-kat colorate cu anticorp anti-HER2 marcat FITC (umplutură roșie) sau cu control izotipic marcat FITC (umplutură albastră) și analizat prin citometrie în flux; (C) Viabilitatea relativă a celulelor SKOVip-kat în cultura monostrat 2D (test MTT) după un tratament de 72 ore cu concentrații diferite de DARPin-LoPE. Datele sunt reprezentate ca medie ± SEM.

Studiu in vivo al DARPin-LoPE împotriva xenogrefelor tumorale fluorescente SKOVip-kat la șoareci atimici. (A) Schema experimentului. Ziua i.p. inocularea a 4 × 106 celule SKOVip-kat la animale a fost stabilită ca în ziua 1; (B) Imagini secvențiale de fluorescență in vivo ale peritoneului șoarecilor martor (injecție de PBS) și șoareci tratați cu 5 × 10 µg DARPin-LoPE. Imaginile de fluorescență 2D in vivo au fost achiziționate folosind configurarea imagistică a fluorescenței pe tot corpul cu geometrie plană de epi-iluminare. Dimensiunea imaginii 3 × 5 cm; (C) Progresia tumorii măsurată prin imagistica fluorescentă in vivo a întregului corp la animale tratate cu PBS (martor, curbă neagră), 5 × 5 µg DARPin-LoPE (curbă albastră) sau 5 × 10 µg DARPin-LoPE (curbă roșie). Zilele injecțiilor cu toxină vizate sunt indicate cu săgeți; (D) Coeficientul ratei de creștere a tumorii (k) la diferite grupuri de animale; (E) Timpul de dublare a tumorii la diferite grupuri de animale. Datele sunt reprezentate ca medie ± SEM. „*” Indică o valoare care diferă semnificativ de valoarea de control respectivă la p n = 5-8).

Abstract

ijms

Toxina țintită DARPin-LoPE și citotoxicitatea sa împotriva modelelor carcinomului uman 2D și 3D in vitro. (A) Construcție genetică care codifică DARPin-LoPE. DARPin (verde închis), DARPin specific HER29.29; LoPE (purpuriu), Pseudomonas exotoxină trunchiată A lipsită de domeniile Ia, Ib, majoritatea epitopilor celulelor B umane din domeniul II și umane; His6 (verde deschis), marcaj hexahistidină C-terminal; K (portocaliu), secvența KDEL. Gena de fuziune se află sub controlul promotorului T7; (B) Viabilitatea relativă a celulelor adenocarcinomului ovarian uman HER2-pozitiv SKOV3.ip1 în cultura monostrat 2D (test MTT) după un tratament de 72 de ore cu concentrații diferite de DARPin-PE40 (cercuri negre) sau DARPin-LoPE (triunghiuri transparente); (C) Volumul relativ de sferoide 3D ale celulelor adenocarcinomului ovarian uman HER2-pozitiv SKOV-kat după un tratament de 96 ore cu concentrații diferite de DARPin-LoPE. Datele sunt reprezentate ca medie ± SEM. „*” Indică o valoare care diferă semnificativ de valoarea de control respectivă la p n = 6).

Schema studiului toxicității generale și imunogenității DARPin-LoPE și DARPin-PE40. „0” denotă analiza parametrilor studiați la animale înainte de începerea cursului de tratament. Ziua primei injecții a toxinelor vizate a fost stabilită ca ziua 1. Tratamentul cu toxinele vizate a fost efectuat în două cure de patru injecții la fiecare două zile, cu o pauză de o lună între cursuri, adică în zilele 1, 3, 5, 7 (primul curs) și 40, 42, 44 și 46 (al doilea curs). Leucocitele au fost analizate prin citometrie în flux în zilele 8 și 17 după începerea fiecărui curs (adică în zilele 8, 17, 47 și 56, marcate cu roșu). Activitatea alaninei aminotransferazei (ALT) și a aspartatului aminotransferazei (AST) în ser a fost măsurată în zilele 6 și 18 după începerea fiecărui curs (adică în zilele 6, 18, 45 și 57, marcate cu albastru). Testul de titrare a anticorpilor a fost efectuat la două și trei săptămâni după terminarea primului tratament și la două și cinci săptămâni după încheierea celui de-al doilea tratament (adică în zilele 20, 27, 60 și 80, marcate cu verde). Animalele au fost eutanasiate în ziua 90, iar organele au fost luate pentru studiu histologic (marcate cu negru).

Greutatea medie a șoarecilor în diferite grupuri. Zilele injecțiilor cu toxine vizate sunt indicate cu săgeți (4 injecții pe curs, 2 cursuri). PBS, șoareci tratați cu soluție salină tamponată cu fosfat (grup martor); DARPin-LoPE 4 × 10 µg, șoareci tratați cu 10 µg DARPin-LoPE pentru 4 doze la fiecare două zile (40 (g pe curs, 80 µg total); DARPin-LoPE 4 × 20 pg, șoareci tratați cu 20 pg DARPin-LoPE pentru 4 doze la fiecare două zile (80 (g pe curs, 160 pg total); DARPin-PE40 4 × 10 pg, șoareci tratați cu 10 pg DARPin-PE40 pentru 4 doze la fiecare două zile (40 (g pe curs, 80 pg total). Datele sunt reprezentate ca medie ± SEM. „*” Indică o valoare care diferă semnificativ de valoarea de control respectivă la p n = 5).

Colorarea hematoxilinei și a eozinei a secțiunilor de organe ale șoarecilor în diferite grupuri. Leziunile degenerative ale țesutului la tratamentul cu toxinele vizate sunt indicate cu săgeți. La șoarecii tratați cu 4 × 10 μg DARPin-PE40 porțiunea pulpei albe a splinei este crescută într-o zonă de învelișuri periarteriolare. La șoarecii tratați cu 4 × 10 μg DARPin-PE40 sau 4 × 20 μg DARPin-LoPE, spațiul peribronchovascular este dilatat în plămâni, precum și locurile de hemoragie și necroză sunt observate la rinichi. Pentru imagini de splină bara de scală este de 200 µm, mărire × 100; pentru scara pulmonară, renală, cardiacă și hepatică este de 100 µm, mărire × 200.

Dinamica titrurilor de anticorpi specifici toxinelor vizate. Ziua primei injecții a toxinelor vizate a fost stabilită în ziua 1. 0 este pentru măsurarea titrurilor de anticorpi în serul șoarecilor înainte de începerea primului curs de tratament. PBS, șoareci tratați cu soluție salină tamponată cu fosfat (grup martor); DARPin-LoPE 4 × 10 µg, șoareci tratați cu 10 µg DARPin-LoPE pentru 4 doze la fiecare două zile (40 (g pe curs, 80 µg total); DARPin-LoPE 4 × 20 pg, șoareci tratați cu 20 pg DARPin-LoPE pentru 4 doze la fiecare două zile (80 (g pe curs, 160 pg total); DARPin-PE40 4 × 10 µg, șoareci tratați cu 10 µg DARPin-PE40 pentru 4 doze la fiecare două zile (40 µg pe curs, 80 µg total). „*” Indică o valoare care diferă semnificativ de valoarea respectivă de control (PBS) la ppn = 5). Datele sunt reprezentate ca medie ± SEM.

Celulele fluorescente ale carcinomului ovarian uman SKOVip-kat și răspunsul lor la tratamentul DARPin-LoPE in vitro. (A) Vizualizarea celulelor SKOVip-kat care exprimă proteina Katushka (roșie) în lumina transmisă (în partea de sus) și prin microscopie confocală (în partea de jos). Dimensiunea imaginii 135 × 135 µm; (B) Analiza conținutului de suprafață al proteinei HER2 pe celule SKOVip-kat colorate cu anticorp anti-HER2 marcat FITC (umplutură roșie) sau cu control izotipic marcat FITC (umplutură albastră) și analizat prin citometrie în flux; (C) Viabilitatea relativă a celulelor SKOVip-kat în cultura monostrat 2D (test MTT) după un tratament de 72 ore cu concentrații diferite de DARPin-LoPE. Datele sunt reprezentate ca medie ± SEM.