Roman V. Kondratov

1 Departamentul de Biologie al Cancerului, Institutul de Cercetare Lerner, Cleveland Clinic Foundation, Cleveland, Ohio 44195, SUA;

Anna A. Kondratova

2 Departamentul de genetică moleculară, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic Foundation, Cleveland, Ohio 44195, SUA

Victoria Y. Gorbacheva

1 Departamentul de Biologie al Cancerului, Institutul de Cercetare Lerner, Cleveland Clinic Foundation, Cleveland, Ohio 44195, SUA;

Olena V. Vykhovanets

1 Departamentul de Biologie al Cancerului, Institutul de Cercetare Lerner, Cleveland Clinic Foundation, Cleveland, Ohio 44195, SUA;

Marina P. Antoch

1 Departamentul de Biologie al Cancerului, Institutul de Cercetare Lerner, Cleveland Clinic Foundation, Cleveland, Ohio 44195, SUA;

Abstract

Șoarecii deficienți în factorul de transcripție circadian BMAL1 (proteină asemănătoare creierului și mușchilor ARNT) au afectat comportamentul circadian și demonstrează pierderea ritmicității în expresia genelor țintă. Aici raportăm că șoarecii Bmal1 -/- au o durată de viață redusă și prezintă diferite simptome ale îmbătrânirii premature, inclusiv sarcopenie, cataractă, grăsime mai puțin subcutanată, contracție a organelor și altele. Fenotipul de îmbătrânire timpurie se corelează cu niveluri crescute de specii reactive de oxigen în unele țesuturi ale animalelor Bmal1 -/-. Aceste constatări, împreună cu datele privind controlul dependent de Ceas/BMAL1 al răspunsurilor la stres, pot oferi o explicație mecanicistă pentru debutul precoce al patologiilor legate de vârstă în absența BMAL1.

Rezultate si discutii

Deoarece fundalul genetic influențează semnificativ fenotipul unei mutații date de o singură genă la șoareci, pentru a aborda rolul BMAL1 în fiziologia normală, am transferat mai întâi mutația la tulpina de șoarece C56BL/6J (12 generații backcross). Datorită infertilității mutanților, colonia Bmal1 -/- a fost menținută prin reproducerea animalelor heterozigote, care a produs descendența tuturor celor trei genotipuri cu raportul așteptat. Animalele KO și colegii lor de tip sălbatic au fost monitorizați pe durata vieții lor pentru dezvoltarea tuturor tipurilor de modificări patologice.

Durata de viață a animalelor KO a fost semnificativ redusă în comparație cu colegii lor de tip sălbatic (Fig. (Fig. 1A). 1A). Majoritatea mutanților au murit între 26 și 52 săptămâni (durata medie de viață 37,0 ± 12,1 săptămâni), în timp ce niciunul dintre șoarecii de tip sălbatic sau heterozigoți nu a murit în perioada studiului (52 săptămâni). Durata medie de viață a animalelor C57BL/6J depășește 2 ani (Nadon 2006); mai mult de două ori mai lung decât cel observat la animalele KO. Cel mai longeviv mutant a murit la vârsta de 72 săptămâni, ceea ce este aproximativ de două ori mai scurt decât durata maximă de viață a acestei tulpini. Nu au fost observate diferențe de mortalitate dependente de sex.

legate

Îmbătrânire prematură și moarte timpurie la șoareci Bmal1 KO. (A) Curba de supraviețuire Kaplan-Meyer. (Cercuri închise) Șoareci de tip sălbatic (WT); (cercuri deschise) șoareci KO. Animalele de tip sălbatic mai vechi de 1 an au fost sacrificate. (B) Modificări ale greutății corporale dependente de vârstă la bărbații de tip sălbatic (WT) și KO. (Cercuri închise) Șoareci de tip sălbatic; (cercuri deschise) șoareci KO. (C) Aspect gros de șoareci masculi de tip sălbatic (WT) de 1 an (dreapta) și KO (stânga). (D) Greutatea organelor majore de la șoareci de 40 de săptămâni. (Bare negre) tip sălbatic (WT); (bare gri) KO. Toate organele de la animale KO, cu excepția ficatului, sunt semnificativ mai mici decât animalele de tip sălbatic (p -/-. Colorarea hematoxilinei și eozinei (H&E) a secțiunilor transversale ale cvadricepsului femural de la animalele de 10 și 40 săptămâni ambele genotipuri. (F) Diferențiale WBC la animalele de tip sălbatic (WT) și KO în vârstă (10-wk-old) și în vârstă (40-wk). Fiecare stivă din bară reprezintă procentul tipului de celulă. (Limfocite (limfatice); monocite (mono); (eos) eozinofile; (baso) bazofile; (LUC) celule mari nepătate.

La naștere, animalele KO nu prezintă defecte vizibile și nu se disting de colegii lor de tip sălbatic. Cu toate acestea, la vârsta de 16-18 săptămâni (pentru bărbați și, respectiv, pentru femele), șoarecii Bmal1 -/- încep să prezinte o întârziere a creșterii, dovadă fiind greutatea corporală redusă. În timp ce greutatea animalelor de tip sălbatic a crescut constant pe parcursul celor 52 de săptămâni ale studiului, greutatea mutanților a încetat să crească la vârsta de 16-26 săptămâni și apoi a început să scadă (Fig. (Fig. 1B; 1B; Fig. Suplimentară). 1). Ca rezultat, șoarecii KO în vârstă de 52 de săptămâni au aproximativ jumătate din mărimea șoarecilor de tip sălbatic (Fig. (Fig. 1C 1C).

Pentru a investiga cauza pierderii în greutate corporală observată la animalele KO, am măsurat masa principalelor organe și țesuturi de la animale vechi de 10, 30 și 40 săptămâni din ambele genotipuri. La vârsta de 10 săptămâni, toate organele majore de la șoareci de tip sălbatic și KO aveau dimensiuni echivalente, cu excepția veziculelor seminale, care erau mai mici la animalele Bmal1 -/-. Această reducere, care devine mai accentuată odată cu vârsta, reflectă probabil maturizarea sexuală defectă la șoarecii KO, ducând la infertilitate masculină.

Diferențele în greutatea corporală totală a animalelor de tip sălbatic și KO în vârstă de 40 de săptămâni s-au dovedit în primul rând datorate scăderii masei adipoase și a țesutului muscular la șoarecii KO (Fig. (Fig. 1D). 1D). Masa medie a țesutului adipos intraabdominal a fost de 1,5 g la bărbații de tip sălbatic în vârstă de 40 de săptămâni, dar de numai 70 mg în KO-uri potrivite pentru vârstă și sex. Stratul de grăsime subcutanat a fost, de asemenea, redus semnificativ la mutanți (Fig. (Fig.2). 2). Acest fenotip este în contrast izbitor cu predispoziția la obezitate observată la șoarecii mutanți Clock/Clock (Turek și colab. 2005). Există mai multe explicații posibile pentru aceste fenotipuri contrastante. Complexul transcripțional CLOCK/BMAL1 nu poate fi format în celulele cu deficit de Bmal1, în timp ce în celulele Clock/Clock, proteina CLOCK mutantă păstrează capacitatea de a se dimeriza cu BMAL1. După cum s-a raportat recent, complexul CLOCK/BMAL1 afișează activitate funcțională dublă, funcționând atât ca activator transcripțional, cât și ca represor transcripțional, în funcție de interacțiunea sa cu CRY. În consecință, ambele funcții ale complexului se pierd în celulele cu deficit de Bmal1, în timp ce în celulele mutante de ceas doar transactivarea este afectată (Kondratov și colab. 2006b). Alternativ, diferențele fenotipice observate între șoarecii Bmal1 -/- și Clock/Clock ar putea fi explicați prin interacțiunea CLOCK și BMAL1 cu diferiți parteneri funcționali.

Patologii legate de vârstă ale pielii la șoareci KO. (A) Creșterea părului dorsal la 1 lună după ras a fost observată la șoareci de tip sălbatic (WT) (stânga), dar nu și la șoareci KO (dreapta). (B) Colorarea H&E a secțiunilor transversale ale pielii de la șoareci de tip sălbatic (WT) și KO de 10 săptămâni nu relevă diferențe morfologice între genotipuri. (SAT) Țesut adipos subcutanat. (C) Colorarea H&E a secțiunilor transversale ale pielii arată o reducere dramatică a SAT la șoarecii KO în vârstă de 40 de săptămâni.

Animalele Bmal1 -/- în vârstă de 40 de săptămâni demonstrează, de asemenea, o reducere a masei musculare și osoase dependente de vârstă (Fig. (Fig. 1D). 1D). Ambele fenomene (sarcopenia îmbătrânirii și osteoporoza) sunt semnele distinctive ale îmbătrânirii mamiferelor (Weiss și colab. 1991; Karakelides și Sreekumaran Nair 2005). Examenul histologic al secțiunilor transversale ale mușchiului cvadriceps femural a arătat că masa musculară redusă la animalele KO a fost asociată cu o scădere a numărului de fibre musculare și a diametrului acestora. Acest defect este dependent de vârstă, deoarece animalele în vârstă de 10 săptămâni nu prezintă diferențe în structura fibrelor musculare între genotipuri (Fig. (Fig. 1E 1E).

În plus față de grăsime, mușchi și os, masa mai multor organe majore (splină, rinichi, testicul, inimă și plămâni) a fost semnificativ redusă la animalele KO în vârstă de 40 de săptămâni (Fig. (Fig. 1D). 1D) . În același timp, nu au existat diferențe în mărimea stomacului, ficatului sau intestinului între genotipuri. La vârsta de 30 de săptămâni, numai splina a fost semnificativ mai mică în KO în comparație cu animalele de tip sălbatic (Fig. Suplimentar 2). Toate celelalte organe se aflau la limita inferioară a greutății lor normale. Examenul histologic al splinei și rinichilor KO nu a evidențiat nicio leziune degenerativă (datele nu sunt prezentate), sugerând că dimensiunea lor mai mică nu se datorează unui proces degenerativ acut, ci este mai degrabă o consecință a reducerii sistematice. Scăderea splinei, rinichilor și testiculului asociată vârstei a fost observată în timpul îmbătrânirii naturale, precum și în modelele animale de îmbătrânire accelerată (Arking 1998; Tyner și colab. 2002).

Șoarecii Bmal1 -/- demonstrează, de asemenea, modificări legate de vârstă ale compoziției sângelui periferic. Numărul total de celule sanguine la tineri (10-wk-vechi) și în vârstă/adulți (40-wk-vechi) KO și șoareci de tip sălbatic nu prezintă diferențe în numărul de globule roșii sau trombocite. Numărul de celule albe din sânge (WBC) a fost identic la animalele tinere de ambele genotipuri și a scăzut odată cu vârsta într-un mod similar așa cum era de așteptat (Razzaque et al. 2006); cu toate acestea, acest declin a fost ușor mai pronunțat la șoarecii KO (Fig. suplimentară 3). S-au observat modificări mai proeminente dependente de BMAL1 în diferențialele WBC. Numărul total și procentul de neutrofile și monocite la șoareci Bmal1 -/- în vârstă de 40 de săptămâni au fost aproape de două ori mai mari decât la controalele potrivite pentru vârstă, în timp ce numărul și procentul de limfocite au scăzut (Fig. (Fig. 1F 1F).

Un alt semn distinctiv al îmbătrânirii mamiferelor, scăderea creșterii părului, a fost observat și la șoarecii Bmal1 -/- (Harrison și Archer 1988; Tyner și colab. 2002). Când s-au ras segmente dorsale ale pielii pe animale în vârstă de 30 de săptămâni, toți cei patru șoareci de tip sălbatic testați au arătat o creștere completă într-o lună. În schimb, doar unul din cele cinci KO a demonstrat o creștere parțială după 3 luni (Fig. (Fig. 2A). 2A). Similar cu celelalte fenotipuri descrise, acesta este în mod clar un defect legat de vârstă, deoarece șoarecii KO în vârstă de 10 săptămâni au prezentat o regenerare robustă a părului după ras (datele nu sunt prezentate).

O reducere a țesutului adipos subcutanat (SAT) este principalul marker al pielii în vârstă la multe mamifere, inclusiv șoareci și oameni (Chuttani și Gilchrest 1995). Examenul histologic al secțiunilor transversale ale pielii dorsale de la șoareci de tip sălbatic și KO de 10 săptămâni nu au prezentat diferențe semnificative în structura pielii (Fig. (Fig. 2B). 2B). În schimb, pielea șoarecilor KO în vârstă de 40 de săptămâni a prezentat o reducere izbitoare a SAT (Fig. (Fig. 2C). 2C). Deși acest fenotip ar putea fi explicat printr-un rol pentru BMAL1 în diferențierea adipocitelor în cultura celulară, așa cum a fost raportat recent (Shimba și colab. 2005), este mai probabil ca acesta să reflecte un proces dependent de vârstă, deoarece nu există nicio diferență în SAT în animale tinere. În plus, cantități normale de țesut adipos au fost prezente la alte locuri, inclusiv gura de ochi, tampon și măduva osoasă la animalele KO de toate vârstele (datele nu sunt prezentate).

Patologii oculare legate de vârstă la șoareci Bmal1 -/-. Colorarea H&E a secțiunilor transversale ale ochilor de la șoareci de 30 de săptămâni de tip sălbatic (WT) și KO. (Co) Cornea; (Ir) iris; (Le) lentilă; (Re) retină. (A) Modificări patologice ale corneei și ale cristalinului șoarecilor KO. (B) Mărirea zonei posterioare a lentilei (dreptunghi albastru în A). Vârfurile săgeții indică nucleele celulelor epiteliale care se infiltrează în zona posterioară a cristalinului KO. (C) Mărirea zonei indicate a corneei (dreptunghi roșu în A). Inflamația acută a corneei la șoarecii KO se caracterizează prin neovascularizare (vârfuri de săgeți galbene), infiltrare de celule limfoide (vârfuri de săgeată albastre) și ulcer (vârf de săgeată roșie).

Luat împreună, spectrul de fenotipuri observat la șoarecii Bmal1 -/- pe măsură ce îmbătrânesc sugerează că BMAL1 joacă un rol important în menținerea homeostaziei tisulare. În plus față de întreruperea funcției circadiene, deficitul de Bmal1 are ca rezultat un fenotip asemănător cu progeria, care leagă direct acest factor de transcripție pentru a controla procesul de îmbătrânire.

Au fost expuse zeci de teorii care implică dereglarea diferitelor căi ca fiind cauza principală a îmbătrânirii. În ciuda diferențelor lor, majoritatea teoriilor actuale consideră stresul oxidativ un factor crucial asociat cu procesele degenerative care apar în timpul îmbătrânirii (Balaban și colab. 2005). Speciile reactive de oxigen și azot (ROS și, respectiv, RNS) sunt regulatori importanți ai metabolismului celular, expresiei genice și alte răspunsuri moleculare, jucând roluri cheie în controlul diferitelor procese fiziologice. În același timp, concentrațiile mari de radicali liberi și specii reactive derivate din radicali, cum ar fi ROS și RNS, au efecte dăunătoare asupra tuturor macromoleculelor biologice majore. Daunele oxidative pot accelera sau chiar provoca îmbătrânirea, contribuind la boli degenerative legate de vârstă. Într-adevăr, s-a demonstrat că îmbătrânirea este asociată cu niveluri crescute de ROS și produse oxidate în diferite țesuturi (Balaban și colab. 2005).

BMAL1 este implicat în reglarea nivelurilor ROS. (A) Nivelurile ROS indicate de fluorescența relativă DCF în extractele de țesut de la șoareci de 30 de săptămâni de tip sălbatic (WT) și KO. (B, C) Creșterea dependentă de vârstă a nivelului de ROS la rinichi (B) și splină (C) la șoareci KO. Au fost utilizate cel puțin patru animale din fiecare grupă de vârstă și genotip. (*) p (Fig. 4D). 4D). Așa cum era de așteptat, nivelurile reduse de BMAL1 au dus la expresia scăzută a țintelor transcripționale cunoscute BMAL1, cum ar fi Period1, care a arătat o expresie de cinci ori mai scăzută în 1686 celule decât în ​​celulele parentale L929 (Fig. (Fig. 4E). 4E). Important, inhibarea mediată de siRNA a BMAL1 a determinat reglarea în sus a nivelurilor ROS (Fig. (Fig. 4F). 4F). Împreună cu datele publicate anterior care implică sistemul circadian în controlul redox (Hardeland și colab. 2003), rezultatele noastre sugerează că sistemul circadian este probabil un sistem important de control al ROS care funcționează atât în ​​condiții fiziologice normale, cât și în stres oxidativ. Într-adevăr, nivelurile de oxidanți externi (generați de alimente) și interni (generați de metabolism/activitate) se schimbă în timpul zilei ca urmare a fluctuațiilor consumului și comportamentului alimentelor. Prin urmare, controlul homeostaziei ROS/RNS de către sistemul circadian, care este intrinsec legat de activitatea zilnică a unui organism, ar oferi cea mai eficientă protecție împotriva efectelor dăunătoare ale oxidanților la orice moment dat al zilei. În același timp, un dezechilibru între sistemul circadian și sistemul de generare/metabolizare ROS/RNS ar putea crește daunele cauzate de stresul oxidativ, contribuind astfel și/sau complicând patogeneza și îmbătrânirea.

Întrebarea esențială ridicată de datele noastre este cum rezultă deficiența de Bmal1 în dezvoltarea patologiilor legate de vârstă. Controlul BMAL1 al homeostaziei ROS, așa cum sa raportat aici, este probabil doar una dintre căile responsabile. Alte mecanisme potențiale pot implica controlul dependent de BMAL1 al răspunsului la stres sau dezechilibre în sistemele endocrine și/sau metabolice care sunt probabil sub control circadian. Aceste mecanisme, la rândul lor, pot afecta nivelurile ROS. În plus, rolul recent raportat al BMAL1 în homeostazia glucozei și afectarea toleranței la glucoză și a sensibilității la insulină la animalele Bmal1 -/- (Rudic și colab. 2004) sugerează o posibilă legătură între sistemul circadian și factorul de creștere insulină/insulină (IGF) căi, despre care se știe că sunt implicate în controlul duratei de viață în diferite organisme (Bordone și Guarente 2005; Katic și Kahn 2005).

Îmbătrânirea este un proces complex care este influențat atât de factorii genetici, cât și de factorii de mediu. Fenotipurile de îmbătrânire prematură au fost descrise la șoareci cu întreruperea țintită a genelor implicate în controlul ratei mutațiilor, reglarea stabilității cromozomilor și telomerilor, homeostaziei ROS, apoptoza, răspunsurile la stres și calea insulină/IGF (Tyner și colab. 2002; Mounkes et. 2003; Chang și colab. 2004; Trifunovic și colab. 2004; Kujoth și colab. 2005; Kurosu și colab. 2005). Modelul mouse-ului cu deficiență BMAL1 extinde această listă într-o direcție deosebit de interesantă. BMAL1 este o componentă cheie a sistemului circadian, care este implicat în interacțiunea organismului cu mediul său; prin urmare, oferă un exemplu unic în care perturbarea genetică a interacțiunii organismului normal cu mediul accelerează îmbătrânirea. Răspunsul eficient al unui organism la stimuli externi și interni (inclusiv stresul genotoxic) depinde de activitatea/expresia sincronizată a mai multor gene. Ca factor de transcripție, BMAL1 poate orchestra multe procese controlând componentele care limitează rata de diferite căi. În același timp, BMAL1 are potențialul de a acționa prin mecanisme independente de transcripție. După cum am raportat recent, BMAL1 este un regulator important al modificării și degradării post-translaționale a Ceasului, NPAS2 și probabil a altor proteine ​​(Kondratov și colab. 2003, 2006a).

Pe scurt, raportăm aici mai multe modificări fenotipice și patologii la șoareci Bmal1 -/- care sunt caracteristici îmbătrânirii premature. Studiile viitoare vor clarifica rolul BMAL1 și al altor componente ale sistemului circadian în îmbătrânirea naturală la șoareci și oameni. Înțelegerea îmbunătățită a interconectării dintre îmbătrânire și sistemul de ceas circadian, precum și identificarea țintelor transcripționale BMAL1 implicate în mod specific în îmbătrânire poate duce în cele din urmă la dezvoltarea de strategii de prevenire și/sau tratare a patologiilor legate de vârstă.

Materiale și metode

Animale

Șoarecii Bmal1 -/- au fost obținuți de la C. Bradfield (Universitatea din Wisconsin) și încrucișați la tulpina C57BL/6J timp de 12 generații. Heterozigoții au fost apoi încrucișați pentru a obține animale din toate cele trei genotipuri. Șoarecii au fost genotipați prin PCR așa cum s-a descris anterior (Bunger și colab. 2000). În toate experimentele, tovarășii de tip sălbatic au fost folosiți ca martori. Toate animalele au fost întreținute pe un ciclu de lumină: întuneric de 12 h: 12 h. Pentru a monitoriza creșterea/pierderea în greutate corporală, animalele au fost cântărite o dată pe săptămână. Șoarecii au fost observați zilnic pentru a marca mortalitatea. Pentru a caracteriza creșterea părului, spatele șoarecilor a fost ras și animalele au fost monitorizate pentru creșterea părului timp de 3 luni. Toate studiile pe animale au fost efectuate în conformitate cu reglementările Comitetului pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de la Cleveland Clinic Foundation.

Analiza totală a celulelor sanguine

Analiza totală a celulelor sanguine a fost efectuată pe probe obținute prin sângerări retro-orbitale așa cum s-a descris anterior (Gorbacheva și colab. 2005).

Colectarea și histologia țesuturilor

Colectarea țesuturilor și analiza histologică au fost efectuate folosind tehnici standard (vezi Material suplimentar).

Cultură celulară, Western blotting și siRNA constructe

Celulele L929 au fost menținute în mediul Eagle modificat (DMEM) al Dulbecco suplimentat cu 10% ser fetal bovin. Pentru o expresie stabilă a siRNA-urilor care vizează Bmal1, am folosit lentivirus recombinant care conține o casetă de expresie siRNA în regiunea U3 a LTR-ului drept. Detaliile despre generarea lentivirusului sunt incluse în Materialul suplimentar.

Măsurarea nivelurilor ROS

Nivelurile ROS au fost determinate în extracte de țesut folosind diclorodihidrofluoresceină (DCF) colorant fluorescent sensibil la ROS așa cum s-a descris anterior (Radak și colab. 2004). Detaliile testului sunt incluse în Materialul suplimentar.