Abstract

Oligodeoxinucleotidele CpG imunostimulatoare (ODN) 2 sunt similare cu cele din ADN bacterian și stimulează răspunsul imun în favoarea producției de citokine de tip Th1 și proinflamatoare (1, 2, 3, 4). CpG ODN poate fi recunoscut de TLR9 al sistemului imunitar înnăscut, care declanșează o cascadă imunomodulatoare de imunitate adaptativă. S-a demonstrat că CpG ODN poate spori răspunsurile imune înnăscute (5) și rezistența împotriva bolilor infecțioase și poate servi drept adjuvant pentru îmbunătățirea răspunsurilor imune adaptive împotriva agenților patogeni (6).

celulelor

Deși eficacitatea CpG ODN ca adjuvanți de vaccin pentru vaccinurile ADN, proteine ​​și peptide este bine cunoscută (7, 8, 9, 10, 11), nu se știa dacă aceștia ar servi drept adjuvanți eficienți pentru vaccinurile cu vectori virali vii. Virușii poartă propriii lor liganzi TLR, cum ar fi ssRNA sau dsRNA, care se leagă de TLR7/8 sau respectiv TLR3. Astfel, nu se știe dacă CpG ODN, ca ligand TLR9, ar contribui în continuare la inducerea imunitară. În acest studiu, am abordat această întrebare în cazul vaccinului Ankara modificat (MVA) (12, 13, 14) ca vaccin împotriva provocării letale a vaccinului, un model pentru variolă. Cu toate acestea, rezultatele ar trebui să fie aplicabile altor vaccinuri vectoriale virale care exprimă vaccin recombinant Ags (15, 16, 17, 18).

Materiale și metode

Oligodeoxinucleotide

ODN au fost sintetizate la Centrul de Evaluare Biologică și Cercetare. Stimularea imunitară a fost obținută prin administrarea a două ODP CpG (GCTAGACGTTAGCGT și TCAACGTTGA). Motivele CpG au fost trecute la TpG sau GpC în control ODN (GCTAGATGTTAGGCT și TCAAGCTTGA). Nici endotoxina (măsurată prin analiza cromogenică a lizatului de amibocit Limulus) și nici proteina (măsurată prin trusa de testare a proteinelor acidului bicinchoninic; Pierce Chemicals) nu au fost detectabile în niciun preparat ODN. Am folosit 25-100 μg de ODP CpG sau ODN de control pe doză per animal.

Viruși

Tulpina WR a virusului Vaccinia a fost inițial obținută din colecția American Type Culture. Virusul Vaccinia Wyeth, tulpina New York City Board of Health, a fost obținută de la Wyeth Laboratories. Ambele au fost crescute în celule HeLa și titrate în celule BSC-1. Tulpina MVA a virusului Vaccinia, obținută de la A. Mayr (Universitatea din München, München, Germania) (12, 13), a fost propagată și titrată în celule de fibroblast de embrion de pui. Acest virus a fost un cadou de la Dr. B. Moss, P. Earl și L. Wyatt (Institutul Național de Alergii și Boli Infecțioase (NIAID), Bethesda, MD) (23).

Șoareci, imunizare și provocare

Șoarecii BALB/c de sex feminin au fost cumpărați de la Centrul de Cercetare a Cancerului Frederick. Șoarecele knockout Jh poartă o ștergere țintită a locusului JH, astfel încât șoarecii sunt homozigoti pentru absența tuturor celor patru segmente genetice JH, rezultând celule care nu pot produce o versiune completă, recombinată a regiunii variabile a lanțului H și sunt de aceea deficiente de celule B. Această tulpină a fost realizată pe fundalul BALB/c (Taconic Farms). Pentru studii de protecție, șoarecii BALB/c sau șoarecii cu deficit de celule B au fost imunizați cu diferite doze de MVA i.m. sau IN. La o lună după imunizare, șoarecii au fost provocați cu 10 6 PFU de WR, iar greutatea corporală individuală a fost măsurată zilnic. Șoarecii cu scădere în greutate> 25% au fost obligați să fie eutanasiați, necesitând în general încheierea experimentelor în jurul zilei a 8-a, când grupul de control a atins acest nivel. Experimente similare de protecție a duratei pentru vaccinia au fost utilizate anterior (20, 24). Epuizarea celulelor CD8 + sau CD4 + s-a făcut prin i.p. tratament cu mAb zilnic timp de 4 zile (clona 2,43, 0,5 mg/șoarece/zi pentru CD8 și GK 1,5, 1 mg/șoarece/zi pentru CD4) (40, 41). Epuizarea a fost verificată prin analiza FACScan a celulelor sanguine periferice pentru a fi> 98% epuizate.

Purificarea celulelor

Splinele au fost îndepărtate aseptic și suspensiile monocelulare au fost preparate prin trecerea ușoară a țesutului prin ecrane sterile. Eritrocitele au fost lizate cu clorură de amoniu tamponată cu Tris, iar celulele rămase au fost spălate extensiv în RPMI 1640 (BioWhittaker) conținând 2% FBS (Gemini Bio-Products) (42). Plămânii au fost excizați, evitând ganglionii limfatici paratraheali, și spălați de două ori în RPMI 1640. Suspensiile de celule mononucleare pulmonare intra-chimale au fost izolate prin digestie colagenază/DNază și centrifugare cu gradient Percoll așa cum s-a descris anterior (43).

IFN-γ ELISPOT

Plăcile ELISPOT (Millipore) au fost pre-acoperite peste noapte cu anti-IFN-y Ab (Mabtech). Celulele țintă (P815, un mastocitom DBA/2 care exprimă molecule de clasa I, dar nu de clasa II H-2 d) au fost infectate peste noapte cu virusul vaccin vSC8 (44), spălate de două ori și iradiate cu UV timp de 15 minute. Celulele efectoare splenice au fost amestecate cu celule țintă infectate și centrifugate împreună în tuburi conice timp de 3 minute la 200 × g. Celulele au fost cocultivate împreună timp de 1 oră la 37 ° C și apoi transferate pe placa ELISPOT într-un volum de 150 μl/godeu. După 24 de ore de cocultivare, celulele formatoare de pete IFN-γ au fost dezvoltate de anti-IFN-γ Ab secundar (Mabtech), un kit Vectasin ABC (Vector Laboratories) și un kit de substrat AEC (Vector Laboratories). Deoarece celulele noastre țintă (celule P815) exprimă doar molecule MHC clasa I, nu clasa II, (H-2K d, D d și L d), ne așteptăm ca majoritatea celulelor producătoare de IFN-γ să fie CD8 + clasa I Celule T cu restricție MHC.

Test de neutralizare a virusului Vaccinia pe baza FACS

Testul de neutralizare a virusului Vaccinia s-a făcut pe baza detecției citometrice în flux a GFP așa cum este descris de Earl și colab. (45).

metode statistice

Analiza statistică a fost efectuată folosind un test t asociat, comparând pierderea în greutate și supraviețuirea în grupuri de șoareci imunizați și neimunizați după provocarea virusului vaccinia (WR) (46).

Rezultate

Eficacitatea de protecție a imunizării cu MVA a fost îmbunătățită prin utilizarea CpG ODN ca adjuvant al mucoasei pentru imunizarea IN la șoarecii BALB/c. Grupuri de șoareci BALB/c (5/grup) au fost imunizați IN cu 0, 10 3, 10 4, 10 5, 10 6 și 10 7 PFU fără (A) sau cu (B) CpG ODN (25 μg/doză) . O lună mai târziu, șoarecii au fost provocați cu 10 6 PFU de vaccin WR. Pierderea individuală în greutate măsurată zilnic este prezentată ca un mijloc pentru fiecare grup. Aceste experimente au fost efectuate de două ori cu rezultate comparabile.

A, Eficacitatea de protecție a imunizării cu MVA nu poate fi îmbunătățită prin utilizarea controlului ODN ca adjuvant al mucoasei pentru imunizarea IN la șoarecii BALB/c. Grupuri de șoareci BALB/c (5/grup) au fost imunizate IN cu MVA 10 5 cu sau fără control ODN (25 μg/doză). Trei săptămâni mai târziu, șoarecii au fost provocați cu 10 6 PFU de vaccin WR. Pierderea individuală în greutate măsurată zilnic este prezentată ca un mijloc pentru fiecare grup. B, CpG ODN este mai eficient atunci când este aplicat înainte de inocularea MVA sau împreună cu MVA, dar nu după administrarea MVA. Grupuri de șoareci BALB/c au fost imunizați cu MVA (105 PFU) și CpG ODN. În grupul 1, CpG ODN a fost injectat IN 1 zi înainte de administrarea MVA; în grupul 2, CpG ODN a fost administrat IN împreună cu MVA; în grupa 3, CpG ODN a fost IN injectat la o zi după imunizarea cu MVA; în grupa 4, șoarecii au fost imunizați IN cu MVA (10 7) singuri; iar în grupul 5, șoarecii au fost neimunizați. La trei săptămâni după imunizări, animalele au fost provocate cu IN cu virus 1 × 106 PFU WR. Greutatea individuală a șoarecului măsurată zilnic este prezentată ca un mijloc pentru fiecare grup. Aceste experimente au fost efectuate de două ori cu rezultate comparabile.

Pentru a determina dacă CpG ODN a crescut numărul de celule T CD8 + producătoare de IFN-γ concomitent cu îmbunătățirea imunității protectoare, am folosit un test ELISPOT IFN-γ specific vaccinului. În aceste experimente, am folosit 10 6 PFU de MVA (ambele doze de MVA, 10 6 și 10 5, în combinație cu CpG ODN au indus o protecție completă împotriva provocării IN cu 10 6 PFU de WR). De asemenea, am studiat capacitatea CpG ODN de a induce celule producătoare de IFN-γ în plămâni și splină după imunizarea sistemică (i.m.) cu MVA și am comparat acest lucru cu efectul MVA + CpG ODN după imunizarea IN. La nouă zile după imunizare, CpG ODN administrat IN cu MVA a indus o creștere semnificativă a numărului total de celule T CD8 + producătoare de IFN-γ în vaccin specific în plămâni (p ⇓ A); cu toate acestea, nivelul de creștere a celulelor producătoare de IFN-γ specifice vaccinului în plămâni după CpG ODN cu MVA administrat i.m. a fost semnificativ mai scăzut în comparație cu CpG ODN cu MVA dat IN (Fig. 3 ⇓ A) (p 6 PFU) plus CpG ODN, crescând posibilitatea ca IN CpG ODN să modifice modelul de aderență al celulelor T (Fig. Modelul celulelor care formează IFN-γ ELISPOT specific vaccinului din splină a fost invers (Fig. 3 ⇓ B), cu cel mai mare număr de celule T CD8 + producătoare de IFN-γ specifice Ag observate după i.m. imunizare. CpG ODN a îmbunătățit în mod semnificativ celulele producătoare de IFN-y specifice vaccinului din splină (Fig. 3 ⇓ B). Controlul ODN nu a crescut semnificativ numărul de celule secretoare de IFN-γ în plămâni (datele nu sunt prezentate).

CpG ODN a crescut numărul celulelor producătoare de IFN-γ specifice Ag vaccin după IN sau i.m. imunizări. Zece șoareci BALB/c au fost imunizați cu MVA plus CpG ODN (5 șoareci) sau fără CpG ODN (5 șoareci), iar altor 10 șoareci BALB/c au primit MVA de i.m. traseu plus CpG ODN (5 șoareci) sau fără CpG ODN (5 șoareci). La nouă zile după imunizări, am caracterizat numărul de celule T producătoare de IFN-γ specifice vaccinului în plămâni (A) și splină (B) prin testul IFN-γ ELISPOT.

CpG ODN crește protecția (A) după provocarea cu WR patogen și numărul de celule T producătoare de IFN-γ specifice vaccinului în plămân (B) și în splină (C). D și E, Protecția împotriva bolii mediate de poxvirus corelată cu celule producătoare de IFN-γ în plămân (D), nu în splină (E). Șoarecii BALB/c au fost IN sau i.m. imunizat cu vaccin MVA cu CpG ODN (25 μg/doză) sau fără CpG ODN. La paisprezece zile după imunizare, șoarecii au fost provocați cu IN cu WR (2 × 106 PFU). A, Pierderea individuală în greutate măsurată zilnic este prezentată ca un mijloc pentru fiecare grup. La șase zile după provocare, celulele producătoare de IFN-γ specifice vaccinelor pe organ au fost cuantificate în plămân (B) și splină (C) prin testul IFN-γ ELISPOT la 100.000/godeu. Corelațiile au fost determinate între boala mediată de poxvirus (de la A) și celulele producătoare de IFN-γ în plămân (D) și splina (E) înainte de provocare (din Fig. 3 ⇑, A și B), comparând animale din toate cinci grupuri.

Spre deosebire de descoperirile noastre de celule producătoare de IFN-γ, imunizarea IN cu MVA plus CpG ODN nu a crescut semnificativ titrul de Abs neutralizant de virus în ser (în zilele 14 și 21 după imunizare) (Fig. 5 ⇓, A și B) (p> 0,05). Am provocat șoarecii BALB/c cu WR 3 săptămâni după imunizare și am studiat titrurile neutralizante ale Ab în ziua 3 după provocarea WR (datele nu sunt prezentate). Provocarea WR a șoarecilor imunizați cu MVA + CpG ODN nu a crescut în continuare titrurile neutralizante ale Ab (p> 0,05). Astfel, concluzionăm că există puțină sau deloc îmbunătățire a producției de Ab neutralizând vaccinul prin utilizarea CpG ODN ca adjuvant pentru MVA fie în răspunsul primar, fie în răspunsul de rechemare după provocare și, prin urmare, acest lucru nu pare să fie mecanismul de protecție îmbunătățită.

Imunizarea IN cu MVA plus CpG ODN nu a crescut semnificativ titrul Abs-ului neutralizant de virus în ser. Grupuri de șoareci BALB/c au fost imunizați cu MVA 106 PFU în prezența CpG ODN (▪) sau fără CpG ODN ((). La paisprezece zile (A) și 21 de zile (B) după imunizare, s-au colectat seruri individuale. Serul de șoarece a fost titrat (prin diluare de 2 ori). Zece diluții serice au fost incubate cu virus GFP (0,6 × 104 PFU) timp de 1 oră în RPMI 1640 cu BSA (fără FCS) în plăci cu 96 de godeuri. Virusul GFP a fost adăugat în 180 pl de RPMI 1640 plus 20 pl de BSA și incubat timp de 1 oră la 37 ° C. Un total de 105 celule HeLa au fost adăugate pe godeu în 50 pl de mediu și incubate timp de 16 ore la 37 ° C. Celulele HeLa infectate au fost centrifugate, fixate cu 0,5% formaldehidă și analizate prin FACS. Graficate sunt procentele de celule infectate față de diluția serică.

CpG ODN poate îmbunătăți protecția împotriva provocării WR patogene la șoarecii deficienți în celule B imunizați cu MVA. Grupuri de șoareci cu deficit de celule B au fost imunizate IN cu 10 7 MVA împreună cu CpG ODN sau fără CpG ODN; șoarecii de control BALB/c au fost neimunizați (cinci șoareci BALB/c). Un grup de șoareci deficienți de celule B imunizați cu 10 7 PFU de MVA plus CpG ODN a fost tratat cu anti-CD8 Ab (doză de 0,5 mg per i.p. de șoarece timp de 3 zile înainte de provocare). La trei săptămâni după imunizare, șoarecii au fost provocați cu virusul WR patogen. Greutatea individuală a șoarecului măsurată zilnic este prezentată ca un mijloc pentru fiecare grup. Aceste experimente au fost efectuate de două ori cu rezultate comparabile.

Mecanismul protecției augmentate cu CpG ODN împotriva provocării WR la șoarecii BALB/c a fost în mod similar dependent de celulele T CD8 +. Ne-am IN șoareci imunizați BALB/c cu 10 5 PFU MVA (două jurnale doză mai mică de MVA în comparație cu doza de imunizare pentru animale cu deficit de celule B) cu sau fără CpG ODN. Imunizarea IN cu 10 7 PFU MVA în acest caz a fost utilizată ca control pozitiv pentru experimentul nostru de protecție (Fig. 7 ⇓ A). Un grup de șoareci imunizați cu MVA-CpG a fost tratat cu anti-CD8 Ab (doză de 0,5 mg per i.p. de șoarece timp de 3 zile înainte de provocare). Tratamentul anti-CD8 a abrogat protecția sporită oferită de adjuvantul CpG (Fig. 7 ⇓ A) (p + CTL, nu Abs.

CD8 + CTL sunt importante pentru protecția augmentată cu CpG ODN împotriva provocării WR la șoarecii BALB/c (A), iar CpG ODN poate înlocui ajutorul CD4 și protecția îmbunătățită la șoarecii epuizați cu CD4 (B). A, Grupuri de șoareci BALB/c au fost imunizați IN cu 105 în prezența CpG ODN sau fără CpG ODN. Un grup de șoareci BALB/c imunizați cu 105 PFU de MVA plus CpG ODN a fost tratat cu anti-CD8 Ab (doză de 0,5 mg per i.p. de șoarece timp de 3 zile înainte de provocare). Șoarecii martor BALB/c au fost imunizați cu MVA singur (10 7 PFU) sau neimunizați (cinci șoareci BALB/c). Șoarecii B, BALB/c au fost tratați zilnic timp de 4 zile cu abs anti-CD4 (GK 1,5, 1 mg/șoarece/zi) înainte de imunizare. După epuizarea CD4, șoarecii au fost imunizați IN cu MVA (106 PFU) cu CpG ODN sau MVA singur (fără CpG ODN). La trei săptămâni după imunizare, șoarecii au fost provocați cu W patogen. Greutatea individuală a șoarecului măsurată zilnic este prezentată ca un mijloc pentru fiecare grup. Aceste experimente au fost efectuate de două ori cu rezultate comparabile.

A fost foarte important să se aplice CpG ODN împreună cu Ag pentru imunizarea mucoasei, deoarece aplicarea CpG ODN a doua zi după imunizare nu a fost eficientă. Interpretăm aceasta ca o cerință de a induce maturizarea celulei dendritice dependente de ligand TLR (DC) în prezența Ag, în timp ce activarea și maturarea DC mai târziu este mult mai puțin eficientă (57, 58, 59). Este important să recunoaștem că TLR9 nu este la fel de larg distribuit în celulele primatelor ca la șoareci (60). Sunt necesare studii suplimentare privind rezistența îmbunătățită indusă de imunizarea cu MVA plus CpG ODN într-un model de primate. De asemenea, un vaccin eficient ar trebui să genereze un răspuns de memorie pe termen lung împotriva variolei. Nu am abordat direct această întrebare în acest studiu, dar studiile noastre de provocare la șoareci de tip sălbatic (Fig. 2 ⇑ B) și șoareci cu deficit de celule B (Fig. 6 ⇑) 3 săptămâni după imunizarea cu MVA plus CpG ODN sugerează că această strategie de vaccin poate induce un răspuns de memorie împotriva poxvirusului patogen.

Studiile noastre anterioare (40, 61, 62) și studiile altor grupuri (63, 64) au indicat faptul că imunizarea mucoasă a indus un răspuns mai bun CD8 + CTL de memorie în locurile mucoasei locale și protecție în comparație cu imunizarea sistemică. Credem că un număr mai mare de celule producătoare de IFN-γ în plămâni după imunizarea IN (comparativ cu im) nu reflectă diferențele cinetice doar în inițierea răspunsurilor imune, ci va produce un număr mare de celule T cu memorie pe termen lung în locurile mucoasei locale.

În mod surprinzător, imunizarea cu CpG ODN plus MVA a fost capabilă să inducă imunitatea protectoare CD8 + CTL printr-un mecanism independent de celule Th. Epuizarea celulelor CD4 înainte de imunizarea CpG-MVA nu a abrogat protecția împotriva provocării WR. Acest efect al CpG ODN poate avea aplicații pentru imunizarea împotriva variolei la pacienții cu SIDA și alte cazuri de imunodeficiență. Un studiu anterior realizat de Cho et al. (65) au demonstrat că un conjugat de secvență ADN proteină-imunostimulatoare a fost mai puternic decât alte vaccinuri pe bază de secvențe ADN imunostimulatoare, deoarece a indus activarea independentă a Th a CTL și a facilitat prezentarea exogenă a Ag pe MHC clasa I. împreună cu vaccinul viu atenuat pentru imunizarea mucoasei au demonstrat un mecanism similar independent de CD4 pentru generarea imunității de protecție împotriva unui virus vaccin patogen.

Prezentul studiu a indicat că CpG ODN ar putea îmbunătăți legătura dintre imunitatea antivirală înnăscută și adaptivă și protecția împotriva provocării patogene cu WR. Tratamentul cu ligand TLR9 singur (fără Ag specific) a protejat șoareci pentru o scurtă perioadă împotriva provocării letale cu WR patogen, deși nu împotriva bolii. Acest fenomen ar putea fi explicat printr-un profil de citokine favorabil produs de DC în țesutul local stimulat de CpG ODN, ducând la un răspuns imun adaptativ puternic (în primul rând CD8 + CTL în plămâni) după provocarea cu WR patogen. Un efect similar al CpG ODN asupra protecției înnăscute împotriva unei infecții letale cu ortopoxvirus a fost descris de Rees și colab. (66). Acest studiu a demonstrat că chemokinele CC RANTES și MIP-1β au fost crescute în spălarea bronhoalveolară de la șoareci neimunizați tratați IN cu CpG ODN și este posibil ca aceste chemokine să joace un rol în protecția înnăscută împotriva unei provocări letale de ortopoxvirus (66).

Mulțumiri

Mulțumim lui Bernard Moss, Patricia Earl și Linda Wyatt (NIAID, Bethesda, MD) pentru darul MVA. Mulțumim lui Barney Graham (NIAID) și Gene Shearer (Institutul Național al Cancerului, Bethesda, MD) pentru lectura critică a manuscrisului și pentru sugestii utile.

Dezvăluiri

Autorii nu au niciun conflict financiar de interese.