Sfântul V. Mhatre

1 Departamentul de Biotehnologie Medicală, Școala de Științe Biomedice MGM, Institutul de Științe ale Sănătății MGM, Sector 1, Kamothe 410209, Navi Mumbai, Maharashtra, India

pancreatice

2 MGMIHS OMICS Research Center, MGM Central Research Laboratory, MGM Medical College and Hospital, MGM Institute of Health Sciences, Sector 1, Kamothe 410209, Navi Mumbai, Maharashtra, India

Amita A. Bhagit

1 Departamentul de Biotehnologie Medicală, Școala de Științe Biomedice MGM, Institutul de Științe ale Sănătății MGM, Sector 1, Kamothe 410209, Navi Mumbai, Maharashtra, India

2 MGMIHS OMICS Research Center, MGM Central Research Laboratory, MGM Medical College and Hospital, MGM Institute of Health Sciences, Sector 1, Kamothe 410209, Navi Mumbai, Maharashtra, India

Raman P. Yadav

2 MGMIHS OMICS Research Center, MGM Central Research Laboratory, MGM Medical College and Hospital, MGM Institute of Health Sciences, Sector 1, Kamothe 410209, Navi Mumbai, Maharashtra, India

REZUMAT

INTRODUCERE

MATERIALE ȘI METODE

Izolarea proteinelor din semințele Litchi chinensis

Determinarea concentrației de proteine

Protocolul modificat pentru micro-testul Bradford (21) a fost efectuat pentru a estima concentrația de proteine ​​izolată din semințele Litchi chinensis. În testare s-au adăugat 10 pl de proteină pe placa cu 96 de godeuri (Tarsons Products Pvt. Ltd, Kolkata, India) și s-au adăugat 200 pl de reactiv 1 × Bradford (SERVA Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germania). Placa a fost incubată la temperatura camerei (25 ° C) timp de 5 min și absorbanța (A) a fost măsurată la 630 nm folosind un cititor de plăci ELISA (model Readwell TOUCH ™; Robonik, Ambernath, India). Curba standard a albuminei serice bovine (BSA; Sigma-Aldrich, Merck, St. Louis, MO, SUA) (1 mg/ml) a fost reprezentată grafic folosind valorile de absorbanță obținute la diferite diluții cuprinse între 0 și 0,35 mg/ml. Concentrația totală a proteinei izolate din semințele Litchi chinensis a fost calculată din curba standard BSA utilizând următoarea ecuație:

unde A este absorbanța la 630 nm și γ este concentrația de proteine ​​în mg/ml.

Testarea activității lipazei utilizând substrat sintetic

Testul lipazei a fost realizat prin metoda descrisă de Winkler și Stuckmann (22) cu ușoare modificări. Testul a fost efectuat în trei exemplare, utilizând o placă de microtitrare cu 96 de godeuri (Tarsons Products Pvt. Ltd). Soluția de enzimă lipazică pancreatică (5 mg/ml) din pancreasul porcin (Sigma-Aldrich, Merck) a fost preparată în tampon fosfat de sodiu 0,1 M (pH = 8,0) și depozitat la 2-8 ° C până la utilizare. Substratul utilizat în acest test a fost de 4,5 mg de palmitat de p-nitrofenil (Sigma-Aldrich, Merck) dizolvat în 200 μL de N, N-dimetil formamidă (SD Fine-Chem Ltd) și volumul a fost ridicat până la 10 ml prin adăugare Tampon fosfat de sodiu 0,1 M (pH = 8,0). Amestecul de reacție (10 μL de lipază pancreatică, 40 μL de tampon fosfat de sodiu 0,1 M (pH = 8,0) și 150 μL de soluție de p-nitrofenil palmitat) a fost incubat la 37 ° C timp de 30 de minute și absorbanta (A) a fost măsurată la 405 nm la 0 și 30 min. O unitate de activitate lipazică este definită ca cantitatea care eliberează 1 nmol/min de fenol liber din substrat (p-nitrofenil palmitat) în tampon fosfat de sodiu 0,1 M (pH = 8,0) la 37 ° C.

Testul activității lipazei utilizând substrat natural

Testul lipazei a fost efectuat utilizând o metodă titrimetrică ușor modificată (23) cu ulei de măsline (Research-Lab Fine Chem Industries, Mumbai, India) și lipază pancreatică porcină (tip II). Soluția de lipază pancreatică porcină (2 mg/ml) a fost preparată în tampon Tris-HCI (Sigma-Aldrich, Merck) 200 mM (pH = 7,7). Pentru a determina activitatea lipazei, apa distilată autoclavată (2,5 ml), tamponul Tris-HCl (1 ml), uleiul de măsline (3 ml) și enzima lipazică pancreatică (0,5 ml) au fost amestecate bine și incubate într-un incubator cu un ventilator de putere orbital agitator (Neolab Instruments, Mumbai, India) în poziție fixă ​​timp de 30 de minute la 37 ° C. Reacția a fost oprită prin adăugarea a 3 ml de etanol 95% (Labindia, Navi Mumbai, India) urmată de adăugarea a patru picături de indicator de timolftaleină 0,9% (S D Fine-Chem Ltd) preparat în 95%

etanol și apoi activitatea lipazei pancreatice a fost testată. Titrarea a fost efectuată cu soluție de hidroxid de sodiu 50 mM (EMPARTA®, Merck KGaA, Darmstadt, Germania) pentru a obține o culoare albastru deschis. O unitate de enzimă hidrolizată 1 μmol/min de acid gras dintr-un triglicerid la pH = 7,7 și 37 ° C.

Măsurarea activității inhibitoare a lipazei

Pentru a determina activitatea inhibitoare a lipazei pancreatice, proteina semințelor la concentrația finală de 100 µg/ml a fost preincubată atât în ​​substraturi sintetice cât și naturale și după finalizarea reacției in vitro, procentul de inhibare a fost calculat prin determinarea activității enzimatice (U) utilizând absorbanță palmitat de p-nitrofenil) și valoare titrimetrică (ulei de măsline). Procentul de inhibiție a fost calculat pe baza valorilor activității enzimatice (EA) ale testului și ale inhibitorului utilizând următoarea ecuație:

Activitatea enzimatică fără prezența inhibitorului a fost de 1 și, respectiv, 50 U/ml pe substrat sintetic și natural.

Efectul tripsinizării asupra activității inhibitoare a lipazei pancreatice

Proteina de sămânță a Litchi chinensis a fost tratată cu 0,05% tripsină (Genetix Biotech Asia Pvt. Ltd., New Delhi, India) pentru a studia efectul tripsinei asupra activității inhibitorului lipazei pancreatice. Soluția de proteină (500 µg/ml) și tripsină în raport de 1: 1 a fost incubată la 37 ° C timp de 2 ore, urmată de estimarea activității inhibitoare a lipazei pancreatice a proteinei Litchi chinensis exprimată ca procent de inhibare.

Determinarea valorii IC50

Valoarea IC50 a proteinei semințelor Litchi chinensis a fost măsurată folosind regresia liniară la concentrații de 25, 50, 75 și 100 µg/mL. Activitatea lipazei pancreatice a fost testată conform protocolului menționat mai sus și procentul de inhibare a fost reprezentat grafic în funcție de concentrație. Concentrația la 50% inhibare a fost determinată și exprimată în μg/ml.

Efectul pH-ului asupra activității inhibitoare a lipazei pancreatice a proteinei semințelor Litchi chinensis

Stabilitatea proteinei semințelor inhibitoare Litchi chinensis la o concentrație finală de 100 μg/ml a fost studiată la diferite valori ale pH-ului (3, 5, 7, 8 și 9). Soluții cu pH diferit au fost preparate prin ajustarea pH-ului apei distilate în autoclavă utilizând soluții de 6 M HCI și 6 M NaOH soluții. Apoi, fiecare dintre aceste soluții (500 uL) și proteina din semințe inhibitoare (500 uL) au fost amestecate în raport 1: 1 și preincubate la 37 ° C timp de 30 min. Testul de inhibare a lipazei a fost realizat folosind substratul sintetic descris anterior. Un volum de 40 uL din acest amestec de reacție a fost adăugat la 10 uL de enzimă urmat de 150 uL de substrat conform protocolului pentru testul lipazei. Fiecare reacție a fost efectuată în triplicat. Amestecul de reacție a fost incubat la 37 ° C timp de 30 de minute și apoi absorbanța (A) a fost măsurată la 405 nm. Inhibarea enzimei a fost exprimată în procente folosind ec. 2.

Electroforeză pe gel de poliacrilamidă cu dodecil sulfat de sodiu a proteinelor izolate din semințe de Litchi chinensis

SDS-PAGE nereducătoare a fost efectuată utilizând un protocol ușor modificat de Laemmli (24), iar electroforeza a fost efectuată folosind un aparat de electroforeză cu celule Tetra mini-PROTEAN (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, SUA). S-a folosit un gel discontinuu discontinuu standard cu 10% gel de rezolvare și 4% gel de stivuire. Volumul de încărcare a probei a fost standardizat la 25 pl și tensiunea a fost menținută la 120 V. Gelul a fost colorat prin metoda modificată de colorare Coomassie albastru strălucitor (25), care a constat în colorarea gelului cu soluție 1% de Coomassie albastru strălucitor R250 (Kemphasol, Thane, India), 50% metanol (Ablychem Laboratories Pvt. Ltd), 10% acid acetic glacial (SD Fine-Chem Ltd) și 39% apă distilată timp de 4-5 ore, urmată de colorarea gelului cu o soluție de 40 % metanol, 10% acid acetic și 50% apă distilată până când benzile au fost vizibile. Colorarea a fost apoi oprită și gelul a fost depozitat în acid acetic 5% pentru analiză ulterioară. Banda de proteine ​​de (61 ± 2) kDa a fost izolată din gel prin tăierea părții definite a gelului urmată de centrifugare la 806 × g (modelul R-8C; Instrumentele de laborator REMI). Activitatea inhibitoare a lipazei pancreatice (folosind substrat sintetic) a proteinei izolate din bandă a fost verificată prin metoda descrisă mai sus.

Cristalizarea proteinei semințe pure Litchi chinensis

Pentru a evalua omogenitatea proteinei izolate, cristalizarea a fost efectuată prin trusă comercială (Protein Crystallization Starter Kit, Jena Bioscience, Jena, Germania) folosind metoda discontinuă pentru cristalizare, care are o strategie de pipetare similară cu cea a metodei picăturii suspendate (26). Aproximativ 4 µL din soluția de precipitare discontinuă premixată (conținând 30% (m/V) PEG 5000-MME, 1 M NaCl și 50 mM acetat de sodiu; pH = 4,4) au fost pipetate pe microscopul cu lumină (model MLM; Magnus Analytics, New Delhi, India) slide. Apoi, 2 µL (1,2 µg) de soluție de proteine ​​din semințe de Litchi chinensis au fost adăugate la picătura de soluție precipitantă și s-a observat formarea cristalelor la microscop la o mărire de 40 ×.

REZULTATE SI DISCUTII

Activitatea inhibitoare a lipazei proteinei semințelor Litchi chinensis