Date asociate

Toate seturile de date generate pentru acest studiu sunt incluse în articol/material suplimentar.

reuteri

Abstract

Microbiota intestinală este necesară pentru garantarea barierei mucoasei intestinale. Cu toate acestea, efectul detaliat al probioticelor asupra dezvoltării intestinale a porcinelor, în special la începutul vieții, este încă neclar. În acest studiu, am tratat purceii nou-născuți în vârstă de 3 zile cu Lactobacillus reuteri (L. reuteri) D8 și am observat efectul său benefic asupra purceilor. Greutatea corpului, înălțimea vilozității și adâncimea criptelor jejunului au fost toate semnificativ crescute după tratamentul cu L. reuteri la purcei. L. reuteri a crescut, de asemenea, semnificativ indicele de proliferare a celulelor PCNA + din criptă, precum și expresiile c-Myc și Tcf4. Mai mult, L. reuteri a îmbunătățit, de asemenea, bariera mucoasei intestinale cu creșterea celulelor calicice și a expresiilor peptidelor antimicrobiene (AMP) ale Muc2, Lyz1 și pBD1. Dezvoltarea bine a patch-urilor Peyer și numărul crescut de celule T CD3 +, combinate cu expresia crescută a IL-4 și IFN-γ, au demonstrat, de asemenea, efectul de stimulare imună a L. reuteri D8. Acest studiu a demonstrat că L. reuteri promovează dezvoltarea sistemului mucoasei intestinale și menține bariera mucoasei intestinale la purceii nou-născuți.

Introducere

Diareea purceilor cu inflamație intestinală și leziuni epiteliale este o problemă comună și contribuie astfel la morbiditate și mortalitate în rândul purceilor, în special în sistemele de creștere intensivă (1). Dezvoltarea tractului gastro-intestinal la purceii nou-născuți este un proces foarte sofisticat, care începe în timpul vieții prenatale și continuă după naștere. Dezvoltarea intestinală a purceilor nou-născuți nu este perfectă și vulnerabilă la invazia diferiților agenți patogeni (2). Numeroase studii au arătat morbiditate ridicată a diareei și a inflamației intestinale la purcei, ducând la moartea purceilor și provocând în mod direct mari pierderi economice (3, 4). Adăugarea de antibiotice la hrana animalelor și a păsărilor poate îmbunătăți semnificativ rata de conversie a hranei, rata de creștere și reduce rata mortalității (5-7). Cu toate acestea, acest fenomen va provoca rezistență la medicamente bacteriene, va distruge serios mecanismul imunitar al corpului și va slăbi capacitatea antivirusului și antiinfecției. Mai mult, antibioticele se acumulează în organism, pun în pericol sănătatea umană și mediul ecologic (8, 9).

Intestinul nu este doar un organ digestiv și absorbant major pentru nutrienți, ci și o barieră eficientă împotriva diferiților agenți infecțioși. Bariera mucoasei intestinale conține în principal straturi de mucus, celule epiteliale și sistemul imunitar al mucoasei (10). Epiteliul intestinal se leagă strâns pentru a forma un perete de protecție dens, separând conținutul intestinal de țesuturile intestinale și menținând sănătatea tractului intestinal (11). Odată ce bariera mucoasei intestinale este distrusă sau echilibrul microflorei intestinale este rupt, aceasta va duce la o creștere a permeabilității epiteliale intestinale, la distrugerea structurii intestinale și la deplasarea agenților patogeni care se transformă în alte organe, cum ar fi ficatul, astfel provocând un răspuns patologic sistemic (12, 13).

Probioticele sunt suplimente alimentare microbiene vii sau componente ale bacteriilor cărora li s-au arătat efecte benefice asupra sănătății (14). În prezent, probioticele devin înlocuitoare pentru antibiotice, cum ar fi Lactobacillus, Bifidobacterium și Bacillus. Într-un studiu anterior, s-a constatat că Lactobacillus poate reduce mediul alcalin din tractul intestinal, crește secreția de mucus și întări conexiunea strânsă, astfel încât să mențină homeostazia mediului intern (15-17). Cu toate acestea, mecanismul Lactobacillus asupra dezvoltării intestinale și a barierei mucoasei la purceii nou-născuți nu este clar. Lactobacillus reuteri (L. reuteri) este una dintre speciile dominante în GIT de porci (18). În acest studiu, am emis ipoteza dacă L. reuteri poate afecta celulele stem intestinale și răspunsurile imune ale mucoasei purceilor, care pot oferi o bază puternică pentru aplicarea L. reuteri în creșterea porcilor.

Materiale și metode

Animale și tulpini de bacterii

Doisprezece purcei în vârstă de 3 zile au fost cumpărați de la ferma de reproducere originală Porc Meishan din provincia Jiangsu. Purceii au fost hrăniți cu scroafe în camera de animale de laborator a Universității Agricole din Nanjing. Greutatea inițială și starea de sănătate a purceilor au fost egale, iar purceii au fost de sex masculin. L. reuteri D8 a fost izolat din duodenul porcilor din laboratorul nostru și confirmat în continuare ca tulpină L. reuteri prin secvențierea ARN 16s (GenBank:> MF850249), care sunt rezistente la tetraciclină. L. reuteri D8 au fost crescute în mediu MRS ager la 37 ° C (19). Porcii au fost crescuți în camera animalelor de laborator de la Nanjing Agricultural University și împărțiți în grupul de control (6 purcei) și grupul de tratament L. reuteri (6 purcei). Purceii au fost tratați cu 2 ml PBS aseptic sau L. reuteri D8 (10 9 CFU) suspendat în 2 ml PBS prin gavaj timp de 5 zile și apoi sacrificați (20-22). Greutățile corporale ale porcilor au fost înregistrate zilnic. Țesuturile recoltate de jejun și ileon au fost fixate cu 4% paraformaldehidă. Procedura pe animale a fost efectuată în conformitate cu Comitetul de Studii pe animale al Universității Agricole de Medicină din Nanjing, care a aprobat protocoalele.

Analiza histologică

Probele de țesut din intestinul subțire au fost fixate în paraformaldehidă 4% timp de 48 de ore la temperatura camerei. După fixare, probele au fost secționate pentru a se potrivi lamelor de sticlă și apoi deshidratate într-o serie de alcool gradat. Apoi blocul de țesut este transparent în xilen, înmuiat în parafină timp de 2 ore și încorporat în parafină. Secțiunile au fost feliate în serie în secțiuni de 5 μm grosime și montate pe lamele. Secțiunile au fost uscate orizontal pe o tavă de încălzire peste noapte la 37 ° C și colorate cu hematoxilin-eozină (HE) pentru examinare prin microscopie cu lumină. Înălțimea vilozității și adâncimea criptelor jejunului au fost măsurate (un orb) de către un observator folosind morfometrie asistată de computer. A fost măsurată și suprafața plasturilor Peyer (PP) din ileon.

Imunohistochimie

Secțiunile de parafină au fost depilate în xilen și rehidratate în concentrații scăzute de etanol. Secțiunile au fost permeabilizate cu 0,5% Triton X-100 timp de 15 minute, urmate de spălare de trei ori cu HBSS, apoi scufundate în H2O2 (3%) pentru a îndepărta catalaza. Pentru colorarea PCNA, secțiunile au fost incubate cu anticorp PCNA anti-porcin (1: 100 Abcam) peste noapte la 4 ° C într-o cutie umidificată. Pentru colorarea cu celule T CD3 pozitive, secțiunile au fost incubate cu CD3 anti-porc (1: 200 Abcam) peste noapte la 4 ° C. PBS a fost utilizat în locul anticorpului pentru control. Secțiunile au fost apoi incubate capră împotriva iepurelui (1: 200 Boster) timp de 1 oră la 37 ° C și spălate. Dezvoltarea culorii DAB timp de 5-10 min. În acest studiu, au fost observate aproape 50 de secțiuni pe grup. Au fost măsurate celulele PCNA pozitive și celulele T CD3 pozitive ale per criptă în jejun.

Colorare periodică cu acid-Schiff (PAS)

Secțiunile de Jejunum au fost depilate în xilen și rehidratate în concentrații scăzute de etanol. Secțiunile deparafinizate și rehidratate au fost tratate cu acid periodic timp de 5 minute la temperatura camerei. Lamele au fost spălate în apă distilată apoi colorate cu reactiv Schiff timp de 15 min la temperatura camerei, urmate de o spălare de 10 minute în apă curentă de la robinet. Secțiunile au fost apoi contracolorate cu hematoxilină timp de 2 minute și soluție de diferențiere acidă timp de 3 secunde. Secțiunile au fost spălate în apă curentă de la robinet timp de 15 min, urmate de deshidratare (75, 85, 95, 100%, EtOH) și acoperite. Numărul de celule din cupe a fost numărat în jejun.

ELISA

Sângele colectat a fost centrifugat la 8.000 rpm timp de 10 minute. Supernatanții au fost depozitați la -20 ° C până la utilizare. LPS porcine (SBJ-z255, Sbjbio) și IgG (SBJ-z124, Sbjbio) în ser au fost măsurate cu kituri ELISA conform instrucțiunilor producătorului.

Cuantificare PCR în timp real

tabelul 1

Exemple de secvențe utilizate pentru RT-qPCR.

Gene țintăPrimer sense (5 ′ -3 ′ )Antisens primar (5 ′ -3 ′ )
Lyz-1AACTGCTTTGGGTGTCTTGCGGTCTATGATCGGTGCGAGT
Muc2CTCAGCCGGGATCCAATCTCGAAAGCCCCGGTGTAACCAT
c-MycCTCGGACTCTCTGCTCTCCTTTGTTCTTCCTCAGAGTCGCT
Lgr5GCTGGCTGCCGTGGATGCAGCAGGGCGCAGAGGACAAG
Tcf4TAATGGAGCAAAGGGTCGTCCCTGGTTTGGGACAAGAGAA
IL-4,GCCGGGCCTCGACTGTTCCGCTCAGGAGGCTCTTC
IFN-γTGGTAGCTCTGGGAAACTGAATGTGGCTTTGCGCTGGATCT
GAPDHAGGTCGGAGTGAACGGATGGGTGGAATCATACTGG

Analize statistice

Toate datele sunt exprimate ca mijloace ± SD. Datele au fost analizate prin One-Way ANOVA și Student's t-test cu SPSS17.0 Software. Nivelurile de semnificație sunt indicate ca * P ** P Figura 1A). L. reuteri D8 nu a afectat nivelurile de LPS în ser în comparație cu grupul martor (Figura 1B). Lungimea vilozității și adâncimea criptelor jejunului din grupul de tratament L. reuteri au fost, de asemenea, mai lungi decât cele din grupul martor (Figurile 1C - E). Aceste rezultate au demonstrat că tratamentul cu L. reuteri D8 a crescut greutatea corporală a purceilor și a favorizat creșterea epiteliului intestinal pentru a menține bariera mucoasei intestinale.