De la Centrul Medical al Departamentului Veteranilor (IS, JHR, KRF) și al Departamentelor de Chirurgie (IS, JHR, X.-MP), Medicină (KRF) și Institutul de Cercetări Cardiovasculare (JHR, DAH), Universitatea din California, San Francisco.

accelerează

De la Centrul Medical al Departamentului Veteranilor (IS, JHR, KRF) și al Departamentelor de Chirurgie (IS, JHR, X.-MP), Medicină (KRF) și Institutul de Cercetări Cardiovasculare (JHR, DAH), Universitatea din California, San Francisco.

De la Centrul Medical al Departamentului Veteranilor (IS, JHR, KRF) și al Departamentelor de Chirurgie (IS, JHR, X.-MP), Medicină (KRF) și Institutul de Cercetări Cardiovasculare (JHR, DAH), Universitatea din California, San Francisco.

De la Centrul Medical al Departamentului Veteranilor (IS, JHR, KRF) și al Departamentelor de Chirurgie (IS, JHR, X.-MP), Medicină (KRF) și Institutul de Cercetări Cardiovasculare (JHR, DAH), Universitatea din California, San Francisco.

De la Centrul Medical al Departamentului Veteranilor (IS, JHR, KRF) și al Departamentelor de Chirurgie (IS, JHR, X.-MP), Medicină (KRF) și Institutul de Cercetări Cardiovasculare (JHR, DAH), Universitatea din California, San Francisco.

Abstract

Abstract Studiile au indicat faptul că lipoproteinele oxidate pot juca un rol în ateroscleroză. Am demonstrat recent că nivelurile de lipoproteine ​​oxidate din circulație pot fi corelate direct cu cantitatea de lipide oxidate din dietă. Prezentul studiu a testat ipoteza că lipidele oxidate din dietă accelerează dezvoltarea aterosclerozei. Timp de 12 până la 14 săptămâni, 36 de iepuri albi bărbați din Noua Zeelandă au fost hrăniți cu o dietă cu conținut scăzut de colesterol (0,25%) conținând fie 5% ulei de porumb neoxidat (dietă de control), fie 5% ulei de porumb oxidat (dietă oxidată-lipidică). Nivelurile colesterolului seric au crescut într-o măsură similară în ambele grupuri, majoritatea colesterolului din fracțiunea lipoproteinei cu densitate foarte mică (β-VLDL) care migrează β. β-VLDL de la animalele martor conținea 3,86 ± 0,57 față de 9,07 ± 2,14 nmol diene conjugate per μmol colesterol (P Creșterea cu 100% a colesterolului total din artera pulmonară, care sa datorat în primul rând creșterii colesteril esterului. Lipidele oxidate sunt frecvent prezente în dieta tipică din SUA, iar rezultatele noastre sugerează că consumul acestor alimente poate fi un factor de risc important pentru ateroscleroză.

Studii recente din laboratorul nostru au sugerat că lipidele oxidate din dietă pot juca un rol semnificativ în oxidarea lipoproteinelor in vivo. La șobolani, nivelurile de lipide oxidate din chilomicroni care au fost izolate din limfa mezenterică și din fracția serică VLDL + LDL pot fi corelate direct cu cantitatea de lipide oxidate din dietă. 13 14 În mod similar la om, consumul de diete bogate în lipide oxidate are ca rezultat creșteri ale lipidelor oxidate în fracția serică postprandială de chilomicron. 15 16 Aceste rezultate sugerează că lipidele oxidate din dietă pot contribui major la nivelul lipidelor oxidate în lipoproteinele derivate intestinal și în particulele de lipoproteine ​​endogene, cum ar fi VLDL și LDL.

Având în vedere importanța evidentă a reglării dietetice a concentrațiilor de lipoproteine ​​oxidate în circulație și rolul lipoproteinelor oxidate în ateroscleroză, am postulat că lipidele oxidate din dietă pot fi aterogene. Prezentul studiu testează ipoteza că lipidele oxidate din dietă accelerează dezvoltarea aterosclerozei.

Metode

Model animal

Treizeci și șase de iepuri albi masculi din Noua Zeelandă (10 până la 11 săptămâni; 2 kg greutate inițială) au fost împărțiți în două grupe egale. În timpul perioadei experimentale de 12 până la 14 săptămâni, 6 iepuri au murit pentru că și-au refuzat hrana și 2 nu au dezvoltat hipercolesterolemie în perioada de hrănire a colesterolului. Iepurii au fost adăpostiți individual în cuști din oțel inoxidabil la instalația de locuințe pentru animale din San Francisco Veterans Affairs, care este acreditată de Asociația Americană pentru Acreditarea Animalelor de Laborator. Toate procedurile au fost revizuite și aprobate de către subcomitetul instituțional pentru îngrijirea animalelor.

Dietele și protocolul experimental

Pentru a acomoda iepurii la dieta sintetică, în prima săptămână 30% (greutate/greutate) din iepure de laborator obișnuit (nr. 5326, Purina) s-au adăugat la dieta sintetică. În a doua săptămână, concentrația de chow a fost redusă la 15%. În timpul celei de-a treia săptămâni și a următoarelor, iepurii au fost hrăniți numai cu dieta sintetică. Cantitățile dietelor menționate anterior au fost ajustate astfel încât toate animalele să-și consume toată cantitatea zilnică de hrană (80 g/zi) și, prin urmare, să aibă un aport constant de alimente. Greutatea iepurelui a fost monitorizată pe durata experimentului și atât grupul de control, cât și grupul cu dietă oxidată au avut o creștere similară în greutate în timpul experimentului. Am măsurat nivelul colesterolului seric la fiecare 2 săptămâni după ce animalele au postit peste noapte pentru a determina expunerea la colesterol pentru fiecare iepure. Deoarece severitatea leziunilor arteriale grase depinde de concentrația serică a colesterolului, expunerea la colesterol 9 10 a fost calculată ca ASC (software MacDraft și Cricket Graph) a concentrației serice de colesterol - grafic versus timp (12 până la 14 săptămâni), așa cum este descris 9 10 și este dat în milimoli pe litru ori zile. Nivelurile serice de TG la iepuri au fost măsurate la începutul și la sfârșitul experimentului.

Ser pentru analiza lipidelor

La 12-14 săptămâni, iepurii au fost eutanasiați (200 mg/kg pentobarbital IV) în perechi (un iepure martor pentru fiecare iepure care fusese alimentat cu dieta lipidică oxidată) după un post peste noapte și sângele lor colectat. Lipoproteinele au fost izolate prin ultracentrifugare secvențială 24 în intervalul de densitate 1.006 până la 1.019 (β-VLDL), 1.019 până la 1.063 (LDL) și 1.063 până la 1.225 (HDL) g/ml. Toate probele de ser și lipoproteine ​​au inclus 1 μmol/L EDTA și 100 μg/mL sulfat de gentamicină. Concentrațiile EDTA au fost scăzute pentru a avea o interferență minimă asupra măsurătorilor dienei conjugate. Cu toate acestea, într-un experiment de studiu în care concentrațiile EDTA de 1 μmol/L și 50 μmol/L au fost comparate, nu a existat nicio diferență în nivelul de oxidare în fracțiile lipoproteice. Colesterolul a fost măsurat în fracțiuni serice și lipoproteice pentru a determina distribuția colesterolului între lipoproteine.

Evaluarea oxidării

Examinarea morfologică a leziunilor aterosclerotice

La sfârșitul experimentului, iepurii au fost anesteziați cu ketamină și xilazină (35 și respectiv 10 mg/kg greutate corporală). Pieptele au fost deschise, iar iepurii au fost sângerați prin puncție cardiacă și apoi uciși cu o supradoză de pentobarbital (200 mg/kg greutate corporală). După laparotomie, aortele și arterele pulmonare au fost îndepărtate. Aorta a fost disecată de la valva aortică la bifurcația iliacă și a fost îndepărtată cât mai multă aventură posibilă pentru a preveni erorile în timpul colorării Sudan IV a vasului. Aorta a fost deschisă longitudinal și fixată pe o suprafață din polistiren. După fixarea peste noapte în formalină 10% (tamponată cu Formalde-Fresh, Fisher Scientific Co), aorta a fost clătită în etanol 70% timp de 10 minute și apoi colorată cu 0,5% Sudan IV în etanol 35% - 50% acetonă timp de 20 minute. Decolorarea a fost efectuată timp de 20 de minute în etanol 80%. Depunerea lipidelor în aortă a fost determinată de evaluarea morfologică a procentului de aortă acoperită de leziune, așa cum este vizualizat prin colorarea Sudan IV a regiunii dintre rădăcina aortică și bifurcație. Leziunile cu dungi grase pe fotografii mărite au fost urmărite pe o tabletă digitală (Kurta IS/ADB, Inmac Inc), iar zonele leziunilor au fost măsurate utilizând software-ul MacDraft de pe un computer Macintosh.

Analiza biochimică a peretelui arterei

Deoarece toate aortele au fost fixate și colorate pentru determinarea leziunii dungi grase, nu au fost adecvate pentru analize chimice; prin urmare, arterele pulmonare au fost utilizate pentru analize de colesterol, CE și colesterol oxidat pentru a determina efectul grăsimilor dietetice oxidate asupra depunerii de lipide arteriale. S-a demonstrat că leziunile cu dungi grase din artera pulmonară se dezvoltă similar cu cele din aortă. 30 de artere pulmonare au fost spălate în soluție salină rece ca gheața, șterse între coli de hârtie de filtru și cântărite. Conținutul de colesterol și CE din artere au fost măsurate după ce au fost omogenizate în tampon fosfat și lipida a fost extrasă din omogenate așa cum este descris de Folch și colab 31; cromatografia cantitativă gaz-lichid a fost efectuată așa cum a fost descris de Rapp și colab. 28 Probele au fost analizate pentru colesterol liber înainte și după saponificare, iar diferența calculată reprezintă concentrația esterului de colesteril. Colesterolul și 7β-hidroxicolesterolul (Steraloids Inc) au fost folosite ca standarde pentru determinarea colesterolului liber și oxidat. Colesterolul oxidat a fost eluat din coloană la 17 minute și colesterolul liber la 14 minute.

Metode de analiză

Rezultate

Nivelurile colesterolului seric și TG

Așa cum era de așteptat, nivelul colesterolului seric a crescut în ambele grupuri de dietă (dietele de control și dietele cu lipide oxidate). După inițierea oricărei diete, ambele conținând 0,25% colesterol, concentrațiile serice de colesterol au fost semnificativ crescute la 2 săptămâni și au atins nivelurile maxime la 4 săptămâni. La sfârșitul experimentului (12 până la 14 săptămâni), nivelul colesterolului seric mediu a fost de 22,22 ± 4,12 mmol/L pentru grupul martor și de 19,55 ± 2,58 mmol/L pentru grupul cu diete oxidate (NS). Fig. 1 arată distribuția colesterolului printre particulele de lipoproteine ​​și, așa cum este descris în studiile anterioare, 34> 50% din colesterolul seric se afla în fracția β-VLDL (d 25 β-VLDL de la iepuri care au fost hrăniți cu dieta martor conțineau 3,86 ± 0,57 față de 9,07 ± 2,14 nmol diene conjugate per micromol colesterol la iepurii care au fost hrăniți cu dieta oxidată (P 29 nu am găsit nicio diferență în timpul de întârziere a oxidării lipoproteinelor care au fost izolate de la iepurii martori față de cei hrăniți cu dieta oxidată (165 față de 156 minute). De asemenea, nu a existat nicio diferență semnificativă în sensibilitatea fracțiunilor LDL la oxidarea cuprului între cele din grupul martor și cele din grupul cu dietă oxidată (38 versus 43 minute). (Valorile de timp reprezintă o medie de două determinări separate.) Astfel, creșterea lipidelor oxidate în fracția β-VLDL nu a modificat susceptibilitatea acestor lipoproteine ​​la oxidarea suplimentară a cuprului.

Efectul grăsimilor dietetice oxidate asupra formării de striuri grase

Analiza chimică a arterelor pulmonare

Pentru a evalua în continuare amploarea aterosclerozei, arterele pulmonare din ambele grupuri dietetice au fost analizate pentru depunerea TC și CE (Fig. 4). Conținutul de colesteril ester a fost de 4,2 ori mai mare în grupul experimental decât la iepurii cărora li s-a administrat dieta de control, dar nivelurile de TC au crescut cu doar ~ 100%. Conținutul de colesterol liber în artera pulmonară a crescut doar modest în grupul cu diete lipidice oxidate (creștere cu 55%; P= .056). Când conținutul de TC în artera pulmonară a fost ajustat pentru expunerea serică la colesterol, conținutul mediu de colesterol în arterele martor a fost de 5,30 ± 0,85 nmol colesterol pe gram de țesut pe unitate de expunere la colesterol (mmol colesterol/L × zile), în timp ce în arterele din animalele hrănite cu dietă oxidată, depunerea colesterolului a fost de 12,65 ± 2,39 nmol colesterol pe gram de țesut pe unitate de expunere la colesterol (P 1 2 S-a emis ipoteza că lipoproteinele sunt oxidate în peretele vasului, dar este, de asemenea, posibil ca lipoproteinele oxidate să poată fi transportate în leziuni din circulație. Studiile anterioare din laboratorul nostru 13 14 15 și altele 16 36 au demonstrat că o sursă de astfel de lipide oxidate în circulație este lipida dietetică oxidată. Având în vedere dovezile că lipoproteinele oxidate sunt aterogene și că lipidele dietetice oxidate influențează concentrația lipoproteinelor oxidate în circulație, în acest studiu am testat ipoteza că grăsimile oxidate din dietă ar accelera progresia aterosclerozei la iepurii cărora li s-a administrat o dietă cu conținut scăzut de colesterol.

Așa cum era de așteptat, am găsit o porțiune substanțială a colesterolului seric în fracțiunea β-VLDL. Numeroase studii au arătat că β-VLDL poate induce formarea de celule de spumă. 37 38 39 Mai mult, consumul dietei lipidice oxidate a dus la o creștere mică, dar semnificativă, a cantității de lipide oxidate în β-VLDL seric. β-VLDL de la iepuri care au fost hrăniți cu dieta martor conțineau 3,86 ± 0,57 nmol diene conjugate per micromol de colesterol, în timp ce β-VLDL de la iepuri care au fost hrăniți cu dietă lipidică oxidată conținea 9,07 ± 2,14 nmol diene conjugate per micromol de colesterol (P 15 Cantitatea de lipide oxidate preexistente necesare pentru creșterea susceptibilității β-VLDL la oxidarea cuprului nu a fost stabilită și, prin urmare, este posibil ca la iepuri creșterea nivelului de oxidare în β-VLDL să nu fi fost suficient de mare pentru a spori susceptibilitatea la oxidare. . În studiile efectuate la om, am constatat că nivelurile de oxidare din fracțiunea de micromicron au crescut de la 10,99 ± 1,05 la 52,63 ± 6,40 nmol diene conjugate pe micromol de TG după consumul unei diete lipidice oxidate. 15 De asemenea, este posibil ca în β-VLDL, peroxizii preexistenți să nu mărească susceptibilitatea la oxidarea cuprului.

În prezent nu avem nicio explicație pentru originea lipidelor oxidate în serurile de iepuri care au fost hrăniți cu dieta de control, deși această constatare este similară cu observația noastră anterioară în serurile de șobolan 13 care conțineau lipide oxidate în fracția LDL + VLDL după șobolani. a fost hrănit cu o dietă zaharoză fără grăsimi timp de 2 săptămâni. Această constatare sugerează cu tărie că are loc oxidarea endogenă și, prin urmare, lipidele dietetice oxidate nu sunt singura sursă de lipoproteine ​​serice oxidate.

Constatarea majoră a prezentului studiu este că consumul unei diete bogate în lipide oxidate are ca rezultat o creștere a leziunilor cu dungi grase în aortă și o creștere> 100% a TC în artera pulmonară, în principal datorită unei creșteri a CE. Mai mult, cantități mici de colesterol oxidat au fost găsite în arterele pulmonare la sfârșitul perioadei de dietă lipidică oxidată. Deoarece dieta sintetică conținea urme de 7β-hidroxicolesterol, ar fi putut proveni din dietă și a fost detectată în arterele iepurilor care au fost hrăniți cu dieta lipidică oxidată din cauza depunerii crescute de colesterol. O altă explicație pentru creșterea colesterolului oxidat în arterele pulmonare poate fi că acizii grași oxidați din uleiul alimentar facilitează autooxidarea colesterolului. S-a arătat de Sevanian și McLeod 40 că în plasma hipercolesterolemică umană, prezența acizilor grași nesaturați peroxidați are ca rezultat creșterea auto-oxidării colesterolului.

Efectele grăsimilor dietetice oxidate asupra procesului aterosclerotic au fost descrise la mai multe specii de animale. În 1965, Kaunitz și colab 41 au hrănit cu șobolani ulei de semințe de bumbac timp de 2 ani și au descoperit ateroscleroză crescută în arterele coronare atunci când uleiul a fost încălzit înainte de hrănire. Kritchevsky și Tepper 42 au raportat că la iepurii hrăniți cu colesterol, grăsimile polinesaturate dietetice încălzite (uleiul de porumb) erau mai aterogene decât uleiul de porumb neîncălzit. În schimb, nu a existat o creștere a aterogenității dacă uleiul încălzit a fost mononesaturat (ulei de măsline). La momentul acestor studii, rolul oxidării în ateroscleroză nu era încă apreciat și nu a fost efectuată măsurarea gradului de oxidare în uleiurile dietetice. Totuși, împreună cu experimentele noastre, pare rezonabil să speculăm că în timpul încălzirii, grăsimile polinesaturate se oxidează, ceea ce duce la creșterea lipoproteinelor serice oxidate și la ateroscleroza ulterioară.

În prezent, mecanismul prin care lipidele dietetice oxidate măresc aterogeneza rămâne de elucidat. Cu toate acestea, s-a demonstrat că β-VLDL oxidat este degradat de macrofage cu o viteză accelerată în comparație cu β-VLDL 43 44 neoxidat și că β-VLDL oxidat duce la creșterea acumulării de lipide în celulele musculare netede în cultură. 45 46 Astfel, β-VLDL oxidat poate prezenta proprietăți aterogene crescute în comparație cu forma sa neoxidată. De asemenea, s-a sugerat că peroxizii lipidici preformați din acizii grași polinesaturați oxidați în β-VLDL pot accelera auto-oxidarea altor lipide, 40 47, cum ar fi colesterolul și fosfolipidele, rezultând o aterogenitate crescută a particulelor oxidate β-VLDL. 48 49

În rezumat, studiul de față indică faptul că lipidele oxidate din dietă accelerează formarea leziunilor cu dungi grase la iepuri. Dacă studii ulterioare demonstrează că lipidele oxidate sunt aterogene la om, recomandările dietetice vor trebui modificate pentru a reduce aportul de lipide oxidate.