Etnofarmacologie

Acest articol face parte din subiectul de cercetare

Metabolomica și metabolismul medicinei tradiționale chinezești Vizualizați toate cele 31 de articole

Editat de
Haitao Lu

Universitatea Shanghai Jiao Tong, China

Revizuite de
Rene Cardenas

Universitatea Națională Autonomă din Mexic, Mexic

Songxiao Xu

Artron BioResearch Inc., Canada

Afilierile editorului și ale recenzenților sunt cele mai recente oferite în profilurile lor de cercetare Loop și este posibil să nu reflecte situația lor în momentul examinării.

frontierelor

  • Descărcați articolul
    • Descărcați PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Suplimentar
      Material
  • Citarea exportului
    • Notă finală
    • Manager de referință
    • Fișier TEXT simplu
    • BibTex
DISTRIBUIE PE

Cercetare originală ARTICOL

  • 1 Laboratorul cheie din Shenzhen pentru pregătirea medicinii chinezești din spital, Spitalul de medicină tradițională chineză din Shenzhen, Shenzhen, China
  • 2 Al patrulea Colegiu Medical Clinic al Universității de Medicină Chineză din Guangzhou, Shenzhen, China

Un decoct din plante chinezești, Zishen Jiangtang Pill (ZJP), a fost prescris clinic pacienților diabetici pentru a preveni nivelurile excesive de zahăr din sânge de zeci de ani. Cu toate acestea, mecanismele potențiale ale acestei acțiuni nu au fost bine cercetate. Scopul acestui studiu a fost de a explora variațiile metabolice ca răspuns la tratamentul PPP pentru un model animal de diabet obez de tip 2. Un instrument de metabolomică bazat pe UHPLC-Orbitrap/MS a fost realizat pentru a releva mecanismele potențiale ale PPP la șoarecii diabetici. Tratamentul cu ZJP a restabilit semnificativ nivelurile crescute de insulină, glucoză și colesterol total la șoarecii cu dietă bogată în grăsimi. Un număr total de 26 de biomarkeri potențiali au fost găsiți și identificați în probele de ser, dintre care 24 de metaboliți au fost puternic afectați și au fost conduși înapoi la nivelurile de control după tratamentul cu ZJP. Prin analiza căilor metabolice, s-a sugerat că metabolismul glutationului, biosinteza hormonilor steroizi și metabolismul glicerofosfolipidelor sunt implicate îndeaproape în boala diabetului zaharat. Din rezultatele de mai sus, se poate concluziona că ZJP prezintă o activitate antidiabetică promițătoare, în mare parte datorită reglării metabolismului fosfolipidic, inclusiv fosfatidilcoline, lizofosfatidilcoline și fosfatidilinozitol.

Introducere

Pilula Zishen Jiangtang (ZJP), unul dintre produsele TCM, este formată din Astragali Radix, Rehmanniae Radix Praeparata, Epimedii Folium, Notoginseng Radix et Rhizoma și alte plante medicinale. ZJP a fost prescris clinic pacienților cu T2DM cu o eficacitate bună pentru menținerea nivelului de glucoză din sânge timp de decenii, deoarece se consideră că are eficiența tonificării qi și yin, a hrănirii rinichiului și oaselor (Li și colab., 2018). Studiile farmacologice anterioare au arătat că ZJP ar putea reduce concentrația de glucoză din sânge la șobolanii diabetici (Li și colab., 2018). Cu toate acestea, mecanismul de bază al ZJP asupra diabetului este mai puțin cunoscut.

În ultimul deceniu, metabolomica încearcă să dezvolte o analiză sistematică a tuturor metaboliților moleculelor mici și a fost aplicată cu succes pentru a descifra mecanismele moleculare ale TCM (Cao și colab., 2015; Li și colab., 2017; Wang și colab., 2017) . Metabolomica este o profilare holistică a metaboliților cu molecule mici, oferind un instantaneu al proceselor fiziologice. Viziunea holistică utilizată de metabolomică este similară cu cea a TCM, care ne permite să investigăm în profunzime TCM cu condiții complexe și factori multipli (Wang și colab., 2015). Dezvoltarea recentă a tehnologiilor de spectrometrie de masă oferă o platformă analitică în înțelegerea fiziopatologiei diabetului și a complicațiilor sale (Sas și colab., 2015).

Aici, în studiul nostru actual, am folosit instrumente de metabolomică pentru a investiga rolul PPP la șoarecii diabetici de tip 2 induși de dieta bogată în grăsimi și mecanismul său potențial. O abordare metabolomică bazată pe UHPLC-Orbitrap/MS a fost dezvoltată pentru a identifica profilurile metabolice ale modelului T2DM și șoarecilor normali, iar biomarkerii potențiali pentru T2DM au fost selectați. Apoi au fost analizate și efectele PPP asupra acestor biomarkeri și a căii metabolice corespunzătoare.

Materiale și metode

Chimic și reactiv

tabelul 1. Compoziția și proporția plantei în ZJP.

Inducerea diabetului zaharat experimental la șoareci

Șoareci de sex masculin C57BL/6 de șase săptămâni au fost achiziționați de la Nanjing University-Nanjing Biopharmaceutical Institution. Animalele experimentale au fost menținute într-o instalație specifică pentru animale fără patogeni (SPF) sub un ciclu de 12 ore lumină-întuneric, cu hrană și apă ad libitum. Acest studiu a fost realizat în conformitate cu recomandările Ghidului Institutului Național de Sănătate pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator. Toate procedurile la animale au fost efectuate cu aprobarea protocolului din partea Comitetului de Etică al Spitalului de Medicină Chineză Tradițională Shenzhen, Universitatea de Medicină Chineză din Guangzhou (Shenzhen, China) și s-au făcut toate eforturile pentru a reduce la minimum suferința animalelor.

Șoarecii au primit fie o dietă normală, fie o dietă bogată în grăsimi timp de 12 săptămâni. Grupul de control a fost alimentat cu o dietă normală (Cod LAD3001M, Nantong Trofee Feed Technology Co., Ltd.). Dieta experimentală a fost un model modificat bazat pe dieta modelului obezității cu 60% bogat în grăsimi din seria Van Heek (Cod TP23400, Nantong Trofee Feed Technology Co., Ltd.), iar hrana a fost produsă în conformitate cu standardul AIN93. După aproximativ 12 săptămâni de modelare, șoarecii cu dietă bogată în grăsimi au fost împărțiți în mod aleatoriu în 4 grupuri (n = 10 per grup): Grupa 1: grup model (numai dietă bogată în grăsimi); Grupa 2: grupa Deltaminei (168 mg/kg/zi); Grupa 3: doză mare de grup Zishen Jiangtang Pill (H-ZJP) (1,51 g/kg/zi); Grupa 4: doză mică de grup Zishen Jiangtang Pill (L-ZJP) (0,75 g/kg/zi). Același volum de apă distilată a fost dat grupurilor de control și model. După 8 săptămâni de tratament, șoarecii au fost sacrificați. Probele de sânge au fost colectate din venele retro-orbitale.

Analiza biochimică

Analiza imunohistochimiei

Au fost luate țesuturile insulei de șoareci, fixate cu paraformaldehidă neutră 4%, transformate în secțiuni de parafină de 4 μm după deshidratare, încorporate cu ceară și tăiate. Secțiunile au fost incubate cu anticorpi primari specifici direcționați împotriva insulinei (Cat Nr. Ab8304, Abcam) și respectiv glucagon (Cat Nr. Ab36598, Abcam), respectiv. Ulterior, secțiunile au fost incubate cu anticorpi secundari conjugați cu HRP (Cat Nr. KIT-9901, MXB Biotechnologies) și vizualizați cu un microscop de fluorescență (Olympus, Japonia).

Pregătirea probei pentru analiza LC-MS

Probele de ser au fost decongelate la temperatura camerei și din care s-au adăugat 100 μl cu 300 μl de acetonitril răcit cu gheață. Soluția a fost bine amestecată prin vortex timp de 30 s, menținută la 4 ° C timp de 10 min, apoi centrifugată (12.000 rpm timp de 10 min la 4 ° C). Supernatantul (250 pl) a fost transferat și adăugat cu 20 pl IS (2-clor-L-fenilalanină, 1 mg/ml), apoi evaporat la sec sub azot gazos la 37 ° C. Reziduul a fost re-dizolvat cu 100 pl de acetonitril 10% și centrifugat (13.000 rpm timp de 10 min la 4 ° C) după ce a fost vortexat timp de 60 s. Supernatantul a fost transferat în flacoane de prelevare automată pentru analize ulterioare UHPLC-Orbitrap/MS.

Validarea metodei

Pentru a garanta calitatea datelor bioanalitice nețintite, s-au utilizat probe de control al calității (QC) pentru validarea metodei. Aici, 20 μl de probe de ser din fiecare grup au fost reunite pentru a obține o probă QC și probele QC au fost extrase folosind metoda de extracție a probelor menționată mai sus. Probele QC au fost analizate la fiecare șase probe pe parcursul întregii proceduri de analiză. Repetabilitatea și stabilitatea au fost realizate prin pregătirea și analiza a șase probe QC.

Separarea cromatografică a fost efectuată pe un sistem Dionex UltiMate 3000 UHPLC (Thermo Scientific, San Jose, CA, Statele Unite). Coloana Waters Acquity BEH C18 (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters, Milford, Statele Unite) a fost aplicată pentru toate analizele la 30 ° C. Faza mobilă a fost compusă din 0,1% apă formică acid (A) și acetonitril (B) la un debit de 0,2 mL/min. Volumul injecției a fost stabilit ca 2 μl. Pentru analiza modului pozitiv, condițiile de gradient au fost următoarele: 0-4 min 10-13% B; 4-6 min 13-50% B; 6-10 min 50% B; 10-14 min 50-85% B; 14-18 min 85% B; 18–20 min 85–100%; 20-25 min 100%; reechilibrează: 10 min. Pentru analiza modului negativ, condițiile de gradient au fost după cum urmează: 0-2 min 15% B; 2–4 min 15–55% B; 4-8 min 55% B; 8-14 min 55-70% B; 14-22 min 70-80% B; 22-24 min 80-100%; 24-28 min 100%; reechilibrează: 10 min.

Experimentele de spectrometrie de masă au fost realizate pe un spectrometru de masă orbitrap (LTQ ORBITRAP VELOS PRO, Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, Statele Unite) echipat cu o sursă de ionizare electrospray (ESI) atât în ​​mod pozitiv, cât și în mod negativ. Intervalul de scanare a fost de la 100 la 1500. Parametrii MS: temperatura de ionizare prin electrospray (° C): 350 (ESI +)/350 (ESI -); Debitul de gaz înveliș (arb): 35 (ESI +)/35 (ESI -); Debit de gaz auxiliar: (arb): 10 (ESI +)/10 (ESI -); Debitul gazului de măturat (arb): 0 (ESI +)/0 (ESI -); Tensiunea de pulverizare I (kV): 3,2 (ESI +)/3,2 (ESI -); Temperatură capilară (° C): 300 (ESI +)/300 (ESI -).

Procesarea datelor

Fișierele de date brute au fost pretratate, procedurile au inclus găsirea vârfurilor, alinierea, filtrarea și normalizarea la suprafața totală, un set de date tridimensional a constat în informații despre eșantion, intensități de vârf, timp de retenție de vârf (RT) și raportul masă-încărcare/z ) a fost obținut. Timpul de retenție și datele m/z au fost utilizate pentru a fi identificate pentru fiecare ion. Mai mult, vârfurile cu valoare lipsă (intensitatea ionului = 0) în mai mult de 80% eșantioane au fost eliminate pentru a obține variabile consistente. Apoi, matricile de date rezultate au fost importate în software-ul SIMCA14.1 (Umetrics, Umeå, Suedia) pentru analize statistice multivariate. Metodele de analiză care conțin analiza componentelor principale (PCA), analiza discriminantă parțială a celor mai mici pătrate (PLS-DA) și analiza discriminantă parțială a celor mai mici pătrate ortogonale (OPLS-DA) au fost utilizate pentru analiza profilului de metaboliți (Chang et al., 2017).

Identificarea biomarkerilor și analiza căilor metabolice

Modelul de analiză discriminantă ortogonală a celor mai mici pătrate a fost realizat pentru a vizualiza diferența metabolică între grupul model și grupul control. Acele variabile cu VIP> 1 în modelul OPLS-DA, precum și variabilele cu p | corr | valoare> 0,58 în graficul S, iar variabilele cu interval de încredere traversate de zero în graficul de încărcare cu cuțite au fost considerate ca potențiali biomarkeri. Potențialii biomarkeri au fost identificați folosind Masslynx (Waters Technologies, Statele Unite) combinat cu baza de date METLIN 1 și baza de date HMDB 2. Apoi, curbele caracteristice de funcționare a receptorului (ROC) (SPSS 19.0) au fost aplicate pentru a analiza datele pentru evaluarea puterii predictive a biomarkerilor identificați. Analiza căii a depins de baza de date KEGG 3, MetaboAnalyst 3.0 4 .

Analize statistice

Datele individuale au fost exprimate ca deviație medie ± _standard (SD). Analizele statistice au fost efectuate folosind ANOVA unidirecțional (versiunea 13.0, SPSS). Modificările semnificative statistic au fost clasificate ca semnificative (∗) unde p ∗∗) unde p ∗∗∗) unde p ∗∗ P # P ## P −4% –1,0 × 10 −4% pentru precizii de masă (tabele suplimentare S1, S2).

Figura 3. Scorul este reprezentat de modelele PCA și OPLS-DA bazate pe profilarea metabolică. (A) Graficul scorului PCA-X al modului ion pozitiv. (B) Graficul scorului PCA-X al modului cu ioni negativi. (C) Graficul scorului OPLS-DA al modului ion pozitiv. (D) Graficul scorului OPLS-DA al modului cu ioni negativi. ESI + înseamnă ionizarea electrospray pozitivă. ESI - înseamnă ionizarea prin pulverizare negativă. Punctele albastre reprezintă grupul de control, punctele verzi reprezintă grupul de modele.

UHPLC-Orbitrap/MS Profiluri metabolice la șoareci normali și diabetici

Prin utilizarea metodei dezvoltate UHPLC-Orbitrap/MS, au fost detectate un total de 8000/8000 vârfuri (ESI +/ESI -) în probele de ser. Vectorii de date din grupurile de control și model au fost colectate ca matrice pentru analiza PCA și OPLS-DA pentru a descoperi variații potențiale. Graficele de scor ale PCA au demonstrat o separare clară între grupurile de control și model în profilurile metabolice (figurile 3A, B). Rezultate similare au fost găsite în graficele de scor ale OPLS-DA (Figurile 3C, D). Pentru analiza OPLS-DA, modelul a arătat o clasificare excelentă și o capacitate predictivă între grupurile de control și model, cu interceptarea R 2 Y peste 0,99 și Î 2 peste 0,85 (Figura 3).

Potențiali biomarkeri pentru diabetul indus de dietă bogată în grăsimi

Un total de 26 de biomarkeri potențiali au fost găsiți și identificați în probele de plasmă (Tabelul 2). Analiza curbei ROC a demonstrat aria detaliată sub curbă (ASC), p-valoarea, intervalul de încredere de 95% și valoarea de eroare a celor 26 de potențiali biomarkeri identificați pentru predicția diabetului (Figura 4). Cei 26 de metaboliți au prezentat proprietăți diagnostice excelente, cu o suprafață medie sub curbă la 0,78-1,00 și p-valoare la 0–0.034. Aici, datele au indicat faptul că biomarkerii identificați au exercitat o puternică abilitate de diagnostic.

masa 2. Identități ale metaboliților diferențiali între control și model.

Figura 4. Analiza ROC a 26 de biomarkeri potențiali din ser la șoareci diabetici. Zona detaliată sub curbă (ASC), p-valoarea, intervalul de încredere de 95% și valoarea de eroare a celor 26 de biomarkeri potențiali identificați sunt indicați în curba ROC. Cei 26 de metaboliți reglementați au oferit abilități diagnostice bune, cu o suprafață medie sub curbă de la 0,78 la 1,00 și p-valoare la 0–0.034.

ZJP induce schimbarea metabolică a șoarecilor experimentali

Pentru a dezvălui rolul benefic al PPP pentru tratarea diabetului, analiza PLS-DA a fost efectuată pentru a obține modificările traiectoriei metabolice după tratamentul medicamentos. Așa cum se indică în Figura 5, traiectoria metabolică a grupului model a fost deplasată treptat spre cea a grupului de control după administrarea PPL sau deltamină. Mai mult, cantitățile relative de 26 de potențiali metaboliți au fost obținute folosind intensități maxime din matricile de date rezultate, printre care 24 de metaboliți au fost puternic afectați de PPL în comparație cu grupul model (Figura 6). Aici, șoarecii tratați cu ZJP au revenit la niveluri normale modificate de dieta bogată în grăsimi, care a inclus reglarea în jos a biomarkerilor.

Figura 5. Efectul ZJP asupra profilării metabolice prin graficele scorului PLS-DA. Punctaj PLS-DA în modul ion pozitiv (A) și modul ion negativ (B) pentru grupurile de control, model și tratate.

Figura 6. Conținutul relativ de 26 de metaboliți. Metaboliții au fost identificați într-o probă de ser. Datele sunt reprezentate ca mijloace ± SD (n ≥ 8, ∗ P ∗∗ P ## P Cuvinte cheie: medicină pe bază de plante, diabet de tip 2, metabolomică, biomarkeri potențiali, căi metabolice

Citare: Chen J, Zheng L, Hu Z, Wang F, Huang S, Li Z, Zheng P, Zhang S, Yi T și Li H (2019) Metabolomica dezvăluie efectul pilulei Zishen Jiangtang, un produs pe bază de plante chinezesc cu conținut ridicat de grăsimi Diabetul zaharat de tip 2 indus de dietă la șoareci. Față. Farmacol. 10: 256. doi: 10.3389/fphar.2019.00256

Primit: 08 august 2018; Acceptat: 28 februarie 2019;
Publicat: 19 martie 2019.

Haitao Lu, Universitatea Shanghai Jiao Tong, China

Rene Cardenas, Universitatea Națională Autonomă din Mexic, Mexic
Songxiao Xu, Artron BioResearch Inc., Canada

* Corespondență: Jianping Chen, [email protected] Huilin Li, [email protected]