Molecular
Medicament
Rapoarte

• Ultimii doi ani
• Total

• Anul trecut 0
• Total

• Luna trecuta
• Anul trecut
• Total

• Yan Liu
• Zhiqian Wang
• Wenliang Xiao

Acest articol este menționat în:

Abstract

Un studiu cuprinzător a relevat miARN multiple care sunt exprimate aberant în hipertrofie cardiacă, printre care miR-26a prezintă o expresie abundentă în inima normală (16). În acest sens, s-a emis ipoteza că miR-26a ar putea fi un regulator important în hipertrofia cardiacă și, prin urmare, în prezentul studiu, o serie de experimente într-un model de șobolan indus de constricție aortică abdominală transversală (TAAC) și angiotensină II (Ang II) au fost efectuate cardiomiocite induse (CM) izolate din inima de șobolan neonatală. MiR-26a supraexprimarea și suprimarea au fost mediate de mimică și respectiv de inhibitor. Factorul natriuretic atrial (ANF) și lanțul greu β-miozină (β-MHC) au fost evaluate ca indicatori ai hipertrofiei cardiace. Mai mult, studiul de față a avut ca scop confirmarea faptului că GATA4 este ținta miR-26a prin mutarea siturilor țintă în 3'-UTR a GATA4. Prin intermediul acestor experimente, studiul de față a avut ca scop elucidarea rolului miR-26 și a mecanismului său de reglare, în medierea hipertrofiei cardiace, care poate furniza ținte terapeutice în tratamentul hipertrofiei cardiace.

Materiale și metode

Animale

Celulele

Transfecția celulară și testul reporterului dual-luciferazei

Gena țintă a miR-26a a fost prezisă folosind TargetScan (www.targetscan.org). Mutantul 3'-UTR al GATA4 a fost sintetizat utilizând un kit QuikChange Multi-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, SUA). 3'-UTR de tip sălbatic sau mutant al GATA4 a fost clonat în siturile de restricție Kpn I și Bgl II în aval de cadrul de citire deschis al luciferazei Renilla în vectorul luciferază promotor pGL3 (Promega, Madison, WI, SUA). CM-urile cultivate în plăci cu 24 de godeuri (1,5 × 105 per godeu) au fost transfectate cu miR-26a mimic (50 nM) sau inhibitor (Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China) și co-transfectate cu reporter de luciferază care conține 3'-UTR de tip sălbatic sau mutant al GATA4 (200 ng) sau plasmida raportor Renilla luciferază pRL-RSV (20 ng; Promega) utilizând Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, SUA) conform protocolului producătorului. Supraexprimarea GATA4 a fost realizată prin transfectarea vectorului T (200 ng; Promega) care conține secvența de codificare a GATA4. La 48 de ore după transfecție, activitatea luciferazei a fost detectată utilizând sistemul GloMax®-Multi Detection System (Promega) normalizat împotriva activității genei luciferazei Renilla.

Imunohistochimie și imunocitochimie

Țesutul cardiac de la șobolani din grupurile de control și TAAC au fost încorporate în parafină și tăiate în felii de 4 um. Un total de 1 × 105 CM au fost însămânțate pe lamelă în plăci cu 6 godeuri și cultivate și tratate cu Ang II așa cum s-a descris mai sus. Celulele au fost fixate cu 4% paraformaldehidă timp de 15 min și transparente cu 0,5% Triton X-100 timp de 20 min. Toate lamelele de țesuturi și celule au fost incubate în 3% H202 timp de 15 minute la temperatura camerei. Celulele au fost blocate prin incubare în ser de capră (Sigma-Aldrich China, Inc.) timp de 30 de minute și ulterior celulele au fost incubate cu un anticorp monoclonal anti-α-actinină de șoarece (1: 1.000; Abcam; nr. Cat. Ab108198 ) la 4 ° C peste noapte, și apoi cu un anticorp secundar conjugat cu capră peroxidază de hrean (HRP) (1: 2.000; Abcam; nr. cat. ab7090) timp de 30 de minute. Semnalele pozitive au fost dezvoltate folosind colorarea diaminobenzidinei (Solarbio, Beijing, China), după care celulele au fost contracolorate cu hematoxilină. Diapozitivele au fost observate la microscop (MM200; Nikon, Tokyo, Japonia), iar aria CM a fost calculată folosind versiunea ImageJ 1.49 (National Institutes of Health, Bethesda, MD, SUA).

Test de încorporare a leucinei

Testul de încorporare a leucinei a fost efectuat pentru a reflecta sinteza proteinelor în CM. După tratamentul cu Ang II, s-a adăugat leucină marcată cu 3 H (1 p Ci/ml) la celule pentru incubare la 37 ° C timp de 12 ore. Ulterior, celulele au fost spălate de trei ori cu soluție salină tamponată cu fosfat rece și lizate în tampon de liză. Semnalul [3 H] de leucină a fost detectat prin scintilație lichidă, folosind Tri-Carb (PerkinElmer, Inc., Waltham, MA, SUA).

Transcriere inversă-PCR cantitativă (RT-qPCR)

Analiza Western blot

CM și țesuturile cardiace au fost lizate în tampon de test radioimunoprecipitare rece (RIPA) (Beyotime Institute of Biotechnology, Shanghai, China), iar probele de proteine ​​extrase au fost cuantificate folosind kitul de testare a proteinelor Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA, SUA ). Cantități identice de probe de proteine ​​au fost separate folosind electroforeză pe gel de dodecil sulfat de sodiu-poliacrilamidă 10% și transferate pe o membrană de fluorură de poliviniliden (Roche). Membrana a fost blocată cu lapte degresat 5% la temperatura camerei timp de 2 ore, urmată de o incubație cu anticorpul primar specific împotriva GATA4 (1: 1.000; Abcam; nr. Cat. Ab86371) la 4 ° C peste noapte. GAPDH a fost folosit ca referință internă. După spălare de trei ori timp de 5 minute de fiecare dată în soluție salină tamponată cu Tris cu Tween (TBST), membrana a fost incubată cu anticorpul secundar conjugat HRP la temperatura camerei timp de 2 ore și spălată din nou în TBST. Ulterior, benzile pozitive au fost dezvoltate utilizând substratul de chemiluminescență îmbunătățită (ECL) Plus Western Blotting (Thermo Fisher Scientific, Inc.) și analizate folosind software-ul ImageJ 1.49.

analize statistice

figura 1

miR-26a inhibă hipertrofia cardiacă într-un model de șobolan indus de TAAC. (A) Proporția HW, indicată de HW/BW, este mai mare în grupul TAAC. (B) Suprafața relativă a CM este mai mare în grupul TAAC. (C) expresia mARN a ANF și β-MHC este reglată în sus în grupul TAAC. (D) Nivelul miR-26a este inhibat în grupul TAAC. * P ANF și ARNm β-MHC au fost semnificativ reglate în sus, la tratamentul cu Ang II [P 3 H] a fost măsurată încorporarea leucinei pentru a evalua rata sintezei proteinelor în CM, deoarece sinteza accelerată a proteinelor este o altă caracteristică a hipertrofiei cardiace. a fost îmbunătățită în CM tratate cu Ang II, deși această îmbunătățire a fost diminuată de supraexpresia miR-26a. Luate împreună, aceste rezultate au indicat faptul că CM induse de Ang II au prezentat proprietăți hipertrofice cardiace, cum ar fi o zonă mai mare CM, sinteza accelerată a proteinelor și promovarea expresia genelor asociate hipertrofiei cardiace. Cu toate acestea, supraexpresia miR-26a a fost capabilă să inhibe în mod semnificativ aceste efecte, ceea ce implică faptul că exercită un rol în inhibarea hipertrofiei cardiace la CM cultivate.

Figura 2

miR-26a inhibă hipertrofia cardiacă în CM induse de Ang II. (A) expresia miR-26a este inhibată în CM tratate cu Ang II. (B) Zona CM este mai mare în celulele tratate cu Ang II, dar scade odată cu supraexprimarea miR-26a. (C) Expresia ARNm ANF și β-MHC este reglată în sus în CM tratate cu Ang II și reglată în jos prin supraexprimarea miR-26a. (D) Sinteza proteinelor, indicată prin încorporarea [3H] leucinei, este accelerată în celulele tratate cu Ang II și inhibată de supraexprimarea miR-26a. ** P GATA4 a fost prezis a fi gena țintă a miR-26a de către TargetScan (Fig. 3A). Prin urmare, a fost analizat impactul miR-26a asupra expresiei GATA4 folosind mimicul și inhibitorul miR-26a. Rezultatele RT-qPCR au demonstrat că expresia ARNm GATA4 a fost inhibată atunci când supraexprimarea miR-26a (P GATA4 a fost gena țintă a miR-26a.

Figura 3

GATA4 compensează rolurile supresive ale miR-26a în hipertrofia cardiacă

Figura 4

Pe scurt, prezentul studiu a identificat un rol protector al miR-26a prin suprimarea GATA4 și, la rândul său, alți factori din aval în hipertrofia cardiacă. Aceste rezultate sunt potențial utile în ceea ce privește posibila utilizare a miR-26a și a țintelor terapeutice precum GATA4, în tratamentul hipertrofiei cardiace.

Referințe

Senthil V, Chen SN, Tsybouleva N, Halder T, Nagueh SF, Willerson JT, Roberts R și Marian AJ: Prevenirea hipertrofiei cardiace prin atorvastatină într-un model de iepure transgenic de cardiomiopatie hipertrofică umană. Circ Res. 97: 285–292. 2005. Vezi articolul: Google Scholar: PubMed/NCBI

Okere IC, Young ME, McElfresh TA, Chess DJ, Sharov VG, Sabbah HN, Hoit BD, Ernsberger P, Chandler MP și Stanley WC. Hipertensiune. 48: 1116-1123. 2006. Vezi articolul: Google Scholar: PubMed/NCBI

Doyle B, Sorajja P, Hynes B, Kumar AH, Araoz PA, Stalboerger PG, Miller D, Reed C, Schmeckpeper J, Wang S și colab. secreția de factori cardiotrofici incluzând TGFbeta1. Celule stem Dev. 17: 941-951. 2008. Vezi articolul: Google Scholar: PubMed/NCBI

Săptămâni KL și McMullen JR: Inima sportivului față de inima căzută: Semnalizarea poate explica cele două rezultate distincte? Fiziologie (Bethesda). 26: 97–105. 2011. Vizualizați articolul: Google Scholar

Kodama H, Fukuda K, Pan J, Sano M, Takahashi T, Kato T, Makino S, Manabe T, Murata M și Ogawa S: Semnificația cascadei ERK comparativ cu calea JAK/STAT și PI3-K în hipertrofia cardiacă mediată de gp130 . Am J Physiol Heart Circ Physiol. 279: H1635 - H1644. 2000.PubMed/NCBI

Lezoualc'h F, Metrich M, Hmitou I, Duquesnes N și Morel E: proteine ​​mici care leagă GTP și regulatorii lor în hipertrofia cardiacă. J Mol Cell Cardiol. 44: 623–632. 2008. Vezi articolul: Google Scholar: PubMed/NCBI

Pan J, Singh SUA, Takahashi T, Oka Y, Palm-Leis A, Herbelin BS și Baker KM: PKC mediază hipertrofia cardiacă indusă de întindere ciclică prin GTPazele familiei Rho și protein kinazele activate de mitogen în cardiomiocite. J Cell Physiol. 202: 536-553. 2005. Vezi articolul: Google Scholar

Yue H, Li W, Desnoyer R și Karnik SS: Rolul STAT3 nuclear fosforilat în hipertrofia cardiacă indusă de receptorul angiotensinei II de tip 1. Cardiovasc Res. 85: 90–99. 2010. Vizualizați articolul: Google Scholar

Smooth MM, da Costa Martins PA și De Windt LJ: mici modificări pot face o mare diferență - reglarea microARN a hipertrofiei cardiace. J Mol Cell Cardiol. 52: 74–82. 2012. Vezi articolul: Google Scholar

Callis TE, Pandya K, Seok HY, Tang RH, Tatsuguchi M, Huang ZP, Chen JF, Deng Z, Gunn B, Shumate J și colab: MicroRNA-208a este un regulator al hipertrofiei cardiace și al conducției la șoareci. J Clin Invest. 119: 2772-2786. 2009. Vizualizați articolul: Google Scholar:

Wang K, Lin ZQ, Long B, Li JH, Zhou J și Li PF: Hipertrofia cardiacă este reglată pozitiv de MicroRNA miR-23a. J Biol Chem. 287: 589–599. 2012. Vizualizați articolul: Google Scholar:

Huang ZP, Chen J, Seok HY, Zhang Z, Kataoka M, Hu X și Wang DZ: MicroRNA-22 reglează hipertrofia cardiacă și remodelarea ca răspuns la stres. Circ Res. 112: 1234–1243. 2013. Vezi articolul: Google Scholar: PubMed/NCBI

Care A, Catalucci D, Felicetti F, Bonci D, Addario A, Gallo P, Bang ML, Segnalini P, Gu Y, Dalton ND și colab.: MicroRNA-133 controlează hipertrofia cardiacă. Nat Med. 13: 613–618. 2007. Vizualizați articolul: Google Scholar

Li Q, Song XW, Zou J, Wang GK, Kremneva E, Li XQ, Zhu N, Sun T, Lappalainen P, Yuan WJ și colab. . J Cell Sci. 123: 2444–2452. 2010. Vezi articolul: Google Scholar: PubMed/NCBI

Wei L, Yuan M, Zhou R, Bai Q, Zhang W, Zhang M, Huang Y și Shi L: MicroRNA-101 inhibă hipertrofia cardiacă de șobolan prin țintirea Rab1a. J Cardiovasc Pharmacol. 65: 357–363. 2015. Vezi articolul: Google Scholar: PubMed/NCBI

Cheng Y, Ji R, Yue J, Yang J, Liu X, Chen H, Dean DB și Zhang C: MicroARN-urile sunt exprimate aberant în inima hipertrofică: joacă un rol în hipertrofia cardiacă? Sunt J Pathol. 170: 1831–1840. 2007. Vezi articolul: Google Scholar: PubMed/NCBI

Sayed D, Hong C, Chen IY, Lypowy J și Abdellatif M: MicroARN-urile joacă un rol esențial în dezvoltarea hipertrofiei cardiace. Circ Res. 100: 416–424. 2007. Vezi articolul: Google Scholar: PubMed/NCBI

Gao J și Liu QG: Rolul miR-26 în tumori și țesuturi normale (Review). Oncol Lett. 2: 1019–1023. 2011.

Han M, Yang Z, Sayed D, He M, Gao S, Lin L, Yoon S și Abdellatif M: expresia GATA4 este reglementată în primul rând printr-un mecanism post-transcripțional dependent de miR-26b în timpul hipertrofiei cardiace. Cardiovasc Res. 93: 645-654. 2012. Vezi articolul: Google Scholar: PubMed/NCBI

Zhang ZH, Li J, Liu BR, Luo CF, Dong Q, Zhao LN, Zhong Y, Chen WY, Chen MS și Liu SM: MicroRNA-26 a fost redus în modelul de hipertrofie cardiacă de șobolan și poate fi o țintă terapeutică promițătoare. J Cardiovasc Pharmacol. 62: 312-319. 2013. Vezi articolul: Google Scholar: PubMed/NCBI

Parmentier JH, Pavicevic Z și Malik KU: Ang II stimulează fosfolipaza D prin activarea PKCzeta în VSMC: Implicații asupra aderenței, răspândirii și hipertrofiei. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290: H46 - H54. 2006. Vezi articolul: Google Scholar

Li R, Xiao J, Qing X, Xing J, Xia Y, Qi J, Liu X, Zhang S, Sheng X, Zhang X și Ji X: Sp1 mediază un rol terapeutic al MiR-7a/b în angiotensina II indusă de cardiace fibroză prin mecanism care implică căile TGF-β și MAPKs în fibroblastele cardiace. Plus unu. 10: e01255132015. Vizualizați articolul: Google Scholar

Garcia R, Thibault G și Cantin M: Corelația dintre hipertrofia cardiacă și nivelurile plasmatice ale factorului natriuretic atrial în modele non-spontane de hipertensiune la șobolan. Biochem Biophys Res Commun. 145: 532-541. 1987. Vezi articolul: Google Scholar: PubMed/NCBI

Haddad F, Qin AX, Bodell PW, Zhang LY, Guo H, Giger JM și Baldwin KM: Reglarea expresiei ARN antisens în timpul schimbării genei cardiace MHC ca răspuns la supraîncărcarea presiunii. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290: H2351 - H2361. 2006. Vezi articolul: Google Scholar: PubMed/NCBI

Hu X, Li T, Zhang C, Liu Y, Xu M, Wang W, Jia Z, Ma K, Zhang Y și Zhou C: GATA4 reglează expresia ANF sinergic cu Sp1 într-un model de hipertrofie cardiacă. J Cell Mol Med. 15: 1865–1877. 2011. Vizualizați articolul: Google Scholar

Charron F, Paradis P, Bronchain O, Nemer G și Nemer M: Interacțiunea cooperativă între GATA-4 și GATA-6 reglează expresia genei miocardice. Mol Cell Biol. 19: 4355–4365. 1999. Vezi articolul: Google Scholar: PubMed/NCBI

Liu YL, Huang CC, Chang CC, Chou CY, Lin SY, Wang IK, Hsieh DJ, Jong GP, Huang CY și Wang CM: Hipertrofia miocardică indusă de hiperfosfat prin calea de semnalizare GATA-4/NFAT-3 este atenuată de ERK tratament cu inhibitori. Cardiorenal Med. 5: 79–88. 2015. Vezi articolul: Google Scholar: PubMed/NCBI

Xiang F, Sakata Y, Cui L, Youngblood JM, Nakagami H, Liao JK, Liao R și Chin MT: Factorul de transcripție CHF1/Hey2 suprimă hipertrofia cardiacă printr-o interacțiune inhibitoare cu GATA4. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290: H1997 - H2006. 2006. Vezi articolul: Google Scholar: PubMed/NCBI

Kwon DH, Eom GH, Kee HJ, Nam YS, Cho YK, Kim DK, Koo JY, Kim HS, Nam KI, Kim KK și colab.: Receptorul legat de estrogen gamma induce hipertrofia cardiacă prin activarea GATA4. J Mol Cell Cardiol. 65: 88–97. 2013. Vezi articolul: Google Scholar: PubMed/NCBI

Liang Q, Wiese RJ, Bueno OF, Dai YS, Markham BE și Molkentin JD: Factorul de transcripție GATA4 este activat prin fosforilarea serinei 105 în cardiomiocite mediată de kinaza 1 și 2 reglată de semnal extracelular. Mol Cell Biol. 21: 7460–7469. 2001. Vezi articolul: Google Scholar: PubMed/NCBI

Articole similare

Septembrie 2016
Volumul 14 Numărul 3

Tipăriți ISSN: 1791-2997
ISSN online: 1791-3004

• Startup-ul alimentar israelian planifică prima plantă de carne din lume - Cuarț
• Modelul legendar Carol Alt dezvăluie atracția secretelor sale anti-îmbătrânire
• Deficitul de leucotrien A4 hidrolază protejează șoarecii de obezitatea indusă de dietă prin creșterea energiei
• Umflarea hipoosmotică crește nitrația proteinelor tirozină la astrocitele de șobolan cultivate - Schliess -
• Profilul lipidic și unele funcții cardiace la copiii cu obezitate - ScienceDirect