Microbiologia sistemelor

Acest articol face parte din subiectul de cercetare

Interacțiuni între diete, microbiota intestinală și metabolismul gazdei Vizualizați toate cele 55 de articole

Editat de
Yuheng Luo

Universitatea Agricolă Sichuan, China

Revizuite de
Natasa Golic

Institutul de genetică moleculară și inginerie genetică, Universitatea din Belgrad, Serbia

Monica Di Paola

Universitatea din Florența, Italia

Afilierile editorului și ale recenzenților sunt cele mai recente oferite în profilurile lor de cercetare Loop și este posibil să nu reflecte situația lor în momentul examinării.

microbiota

  • Descărcați articolul
    • Descărcați PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Suplimentar
      Material
  • Citarea exportului
    • Notă finală
    • Manager de referință
    • Fișier TEXT simplu
    • BibTex
DISTRIBUIE PE

Cercetare originală ARTICOL

  • 1 Colegiul de Farmacie, Universitatea Sahmyook, Seul, Coreea de Sud
  • 2 Colegiul de Farmacie, Universitatea Națională Chungbuk, Cheongju, Coreea de Sud
  • 3 Colegiul de biotehnologie și resurse animale, Universitatea Sahmyook, Seul, Coreea de Sud

Disbioza microbiotei intestinale este un factor care contribuie la bolile metabolice legate de obezitate, cum ar fi hiperglicemia și hiperlipidemia. Farmacoterapia pentru bolile metabolice implică modularea microbiotei intestinale, care se sugerează a fi o potențială țintă terapeutică. În acest studiu, modularea microbiotei intestinale de către statine (medicamente care scad colesterolul: atorvastatina și rosuvastatina) a fost investigată într-un model de șoareci în vârstă cu obezitate indusă de dietă bogată în grăsimi și a fost descrisă asocierea dintre microbiota intestinală și răspunsurile imune. Atorvastatina și rosuvastatina au crescut semnificativ abundența genurilor Bacteroides, Butyricimonas, și Mucispirillum. Mai mult, abundența acestor genuri a fost corelată cu răspunsul inflamator, inclusiv nivelurile de IL-1β și TGFβ1 în ileon. În plus, transplantul oral de microbiote fecale cu material fecal colectat din grupurile de șoareci tratați cu rosuvastatină a îmbunătățit hiperglicemia. Din aceste rezultate, efectul statinelor asupra îmbunătățirilor metabolice ar putea fi explicat prin modificarea microbiotei intestinale. Descoperirile noastre sugerează că modularea microbiotei intestinale de către statine are un rol important în acțiunile terapeutice ale acestor medicamente.

Introducere

Bolile metabolice legate de obezitate, inclusiv hiperlipidemia, hipertensiunea și diabetul de tip 2 (T2D), sunt poveri de sănătate prevalente, globale (Wang și colab., 2008). Stilul de viață, inclusiv lipsa exercițiului fizic și o dietă occidentalizată, este un factor major care contribuie la prevalența bolilor metabolice (Lee S.E. și colab., 2018). Bolile metabolice sunt asociate cu un risc crescut de mortalitate la populația vârstnică; în special, hiperlipidemia este un factor de risc important pentru bolile cardiovasculare (Isomaa și colab., 2001; Felix-Redondo și colab., 2013).

Recent, Colegiul American de Cardiologie/American Heart Association (ACC/AHA) a recomandat statinele ca tratament de primă linie al hiperlipidemiei, iar statinele sunt în prezent cel mai utilizat tratament pentru hiperlipidemie (Safeer și Lacivita, 2000; Stone și colab., 2014). Statinele acționează prin inhibarea 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzimei A (HMG-CoA) reductază, o enzimă importantă implicată în calea de sinteză a colesterolului (Stancu și Sima, 2001). Mai mult, statinele induc expresia receptorilor lipoproteinelor cu densitate scăzută (LDL) și promovează îndepărtarea colesterolului LDL din sânge (Young și Fong, 2012). Mai mult, statinele s-au raportat că au efecte antiinflamatorii și imunomodulatoare (Lee și colab., 2016).

Microbiota intestinală este un factor important de mediu pentru reglarea homeostaziei energetice și a sistemului imunitar (Wu și Wu, 2012; Sanz și colab., 2015). Modularea microbiotei intestinale îmbunătățește rezultatul diferitelor boli, inclusiv sindromul metabolic și bolile inflamatorii, și influențează farmacoterapia (Wilson și Nicholson, 2009; Karkman și colab., 2017). Recent, diverse intervenții precum suplimente alimentare (Lee și Ko, 2016; Talsness și colab., 2017), prebiotice sau probiotice (Delzenne și colab., 2011; Markowiak și Slizewska, 2017) și medicamente (Shin și colab., 2013; Lee; Ko, 2014) au raportat că modifică compoziția microbiotei intestinale, care are un rol important în ameliorarea bolilor metabolice. În studii recente, sa constatat că terapia cu statine afectează compoziția microbiotei intestinale (Khan și colab., 2018; Liu și colab., 2018). Nolan și colab. (2017) au arătat că rosuvastatina a influențat microbiota intestinală și a crescut semnificativ abundența familiei Lachnospiraceae, și genurile Rikenella și Coprococ la șoareci C57BL/6 hrăniți cu HFD.

Obiectivele acestui studiu au fost (1) identificarea efectelor statinelor asupra microbiotei intestinale și îmbunătățirilor metabolice și (2) investigarea corelației dintre modificările semnificative ale microbiotei induse de statine și reglarea inflamatorie.

Materiale și metode

Animale și protocol experimental

Șoarecii C57BL/6N de sex masculin de 4 săptămâni au fost achiziționați de la Samtako Co., Ltd (Osan, Coreea de Sud) și au fost adaptați la condițiile de laborator timp de 1 săptămână, în care animalele au fost găzduite cu acces gratuit la apă și alimente la o temperatură - instalație animală controlată de umiditate sub un ciclu de lumină - întuneric de 12 ore la 22 ± 2 ° C și 55 ± 5% umiditate. Șoarecii au fost hrăniți fie cu o dietă bogată în grăsimi (HFD) de 45% kcal (FeedLab, Inc., Guri, Coreea de Sud) pentru a induce tulburări metabolice precum obezitate, hiperglicemie și hiperlipidemie, fie o dietă obișnuită (RD) Inc., Seoul, Coreea de Sud) timp de 39 de săptămâni. Atorvastatină (HFD-Ator: 10 mg/kg greutate corporală, n = 6) sau rosuvastatină (HFD-Rosu: 3 mg/kg greutate corporală, n = 6) a fost administrat în fiecare zi în timpul HFD în ultimele 16 săptămâni. Un grup de șoareci hrăniți cu RD (n = 6) și un grup de șoareci alimentați cu HFD (n = 6) au fost incluse ca controale normale și, respectiv, ale bolii. Toate procedurile experimentale au fost efectuate în conformitate cu orientările etice emise de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor (IACUC) din Universitatea Sahmyook pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator (SYUIACUC 2015001).

Măsurători metabolice

Greutatea corporală și nivelurile serice de glucoză la șoareci au fost monitorizate la fiecare 2 săptămâni. Șoarecii au fost postiti peste noapte (12 ore), probele de sânge au fost prelevate dintr-o tăietură de coadă, iar nivelurile serice de glucoză au fost măsurate folosind sistemul Accu-Chek Performa (Roche, Elveția). Testarea toleranței la glucoză intraperitoneală (IPGTT) a fost efectuată la 16 săptămâni după administrarea statinei (Atorvastatin; Ator, Rosuvastatin; Rosu). După post peste noapte (12 ore), șoarecii au fost injectați intraperitoneal cu soluție de glucoză [2 g/kg greutate corporală, în soluție salină tamponată cu fosfat (PBS)] și s-au obținut probe de sânge din vena cozii 0, 30, 60, 90, și 120 de minute după injectarea glucozei. La sfârșitul perioadei experimentale, șoarecii au fost sacrificați sub anestezie cu eter și s-a colectat sânge prin intermediul puncție cardiacă. Probele de sânge au fost centrifugate la 10.000 rpm timp de 5 minute pentru a izola serul. Serul a fost pregătit pentru a determina nivelurile de colesterol total, LDL, apolipoproteina A-1 (ApoA-1) și apolipoproteina B (ApoB) folosind un analizor biochimic (AU480, Beckman Coulter, Statele Unite).

Biomarcatori imunomodulatori

Țesutul ileum din fiecare grup a fost imediat înghețat în azot lichid și depozitat la -70 ° C pentru a determina nivelurile de transcrieri genetice. Expresia interleukinei-1β (IL-1β; exemplu direct: 5′-CAGGATGAGGACATGACACC-3 ′, exemplu invers: 5′-CTCTGCAGACTCAAACTCCAC-3 ′), interleuchină-6 (IL-6; exemplu forward: 5′-GTACTCCAGAAGACCAGAGC- 3 ′, exemplu invers: 5′-TGC TGG TGA CAA CCA CGG CC-3 ′), factor de creștere transformant β 1 (TGFβ1; exemplu înainte: 5′-GCGGACTACTATGCTAAAGAGG-3 ′, exemplu invers: 5′- GTAGAGTTCCACATGTTGCTCC-3 ′ ), interleukina-4 (IL-4; exemplu înainte: 5′- GAGCCATATCCACGGATGCGACAA-3 ′, exemplu invers: 5′- CATGGTGGCTCAGTACTACGAGTA-3 ′) și interleucina-10 (IL-10; exemplu direct: 5′-TGGCCACACTTCAGAGCG 3 ', Exemplu invers: 5'-TTCAGGGATGAAGCGGCTGG-3') a fost investigat în țesutul ileon. ARN-ul total a fost extras folosind un RiboEx ™ (GeneAll, Coreea). ARN-ul a fost apoi cuantificat citind absorbanța la 260 nm. ADNc a fost sintetizat folosind un premix HyperScript ™ RT (GeneAll, Coreea). Pentru a cuantifica nivelul de expresie a ARNm, s-au folosit SYBR ® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Statele Unite) și un sistem StepOnePlus ™ în timp real PCR (Applied Biosystems, Statele Unite). GAPDH a fost folosit ca control intern.

Bună analiză a microbiotei

ADN-ul total a fost extras folosind trusa de izolare a ADN-ului PowerSoil (MO BIO Laboratories, Inc., Statele Unite) din probe de cecum, care au inclus materiale fecale. Secvențele parțiale ale genelor 16S rRNA au fost amplificate pe baza protocolului de amplificare 16S rRNA din Earth Microbiome Project (Gilbert și colab., 2010). Genele ARNr 16S au fost amplificate folosind setul de primer 515F/806R, care include o secvență adaptor pentru amplificarea regiunii V4 (primer 515F înainte: 5'-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG GTG CCA GCM GCC GCG GTA A-3 ′; Exemplu invers 806R: 5′-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGG ACT ACH VGG GTW TCT AAT-3 ′). Pentru a atașa indicii duali și adaptorul la produsele cu reacție în lanț a polimerazei amplificate (PCR), s-a efectuat suplimentar un index PCR folosind o ADN polimerază AmpONE TM α-Pfu (GeneAll, Coreea) și Nextera ® XT Index Kit v2 (Illumina, Statele Unite) . Produsele PCR după amplificare și atașare au fost purificate folosind ExpinTM PCR SV (GeneAll, Coreea). Genele de ARNr 16S bacteriene parțiale au fost amplificate folosind MiSeq Reagent Kit V3 (600 cicluri) și platforma MiSeq (Illumina, Statele Unite) la KoBioLabs, Inc.

Înainte de analiza secvențelor ARNr 16S, fișierele BCL au fost convertite în fișiere brute FASTQ incluzând secvențele read1, index și read2 folosind CASAVA-1.8.2 (Illumina). După preprocesare (pași de filtrare și tăiere a calității folosind FASTX-Toolkit) (Gordon și Hannon, 2010), secvențele au fost atribuite unităților taxonomice operaționale (OTU, 97% identitate), iar secvențele reprezentative au fost selectate folosind software-ul QIIME 1.7.0 (Caporaso et. al., 2010). Apoi, au fost analizate compoziția taxonomică, diversitatea alfa (curba de rarefacție și indicele Shannon al diversității bacteriene) și diversitatea beta (PCoA a distanțelor UniFrac). Mărimea efectului LDA (LEfSe) a fost utilizată pentru a estima abundența taxonomică și a caracteriza diferențele dintre grupuri (Segata și colab., 2011). Gruparea ierarhică a primelor zece genuri bacteriene dintre cele mai abundente pe grupe a fost realizată utilizând corelația rangului Spearman și a fost generată o hartă de căldură utilizând software-ul MultiExperiment Viewer (MEV) (v4.8.1). Datele de secvențiere de generație următoare (NGS) sunt disponibile la 1 .

Abundențele relative ale a patru genuri bacteriene au fost confirmate folosind SYBR ® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Statele Unite) și un sistem StepOnePlus ™ PCR în timp real (Applied Biosystems, Statele Unite). Seturi de grunduri specifice genului pentru Eubacteria (UniF340; grund înainte: 5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAGT-3 ', UniR514; exemplu invers: 5'-ATTACCGCGGCTGCTCCG-3'), Akkermansia (AM1; exemplu înainte: 5′-CAGCACGTGAAGGTGGGGAC-3 ′, AM2; exemplu invers: 5′-CCTTGCGGTTGGCTTCAGAT-3 ′), Bacteroides (AllBac296f; exemplu înainte: 5′-GAGAGGAA GGTCCCCCAC-3 ′, AllBac412r; exemplu invers: 5′-CGCTAC TTGGCTGGTTCAG-3 ′), Butyricimonas (Buty1f; exemplu înainte: 5′-GGTGAGTAACACGTGTGCAAC-3 ′, Buty1r; exemplu invers: 5′-TACCCCGCCAACTACCTAATG-3 ′) și Mucispirillum (MucisF; exemplu înainte: 5′-CGTTTGCAAGAA TGAAACTCAAA-3 ′, MucisR; exemplu invers: 5′-CACAGCATTATCTCTAACGCCTT-3 ′) au fost utilizate pentru amplificare (Layton și colab., 2006; Collado și colab., 2007; Cahenzli și colab. ., 2013).

Transplantul de microbiote fecale (FMT)

Materialul fecal (0,1 g) de la șoareci tratați cu rosuvastatină (grupul HFD-Rosu) a fost adunat în 1 ml de PBS. Șoarecilor li s-a permis să bea apă care conține penicilină G procaină (2.000 UI/L) și streptomicină (2.5 mg/L) timp de 5 zile înainte de FMT. După centrifugare la 2.000 g timp de 2 minute, 500 μL de supernatant au fost administrați la șoareci tratați cu antibiotice hrăniți cu HFD timp de 48 de săptămâni (HFD-fRosu, n = 6) prin intermediul gavaj oral. Profilurile metabolice, citokinele inflamatorii și abundențele bacteriene au fost analizate și comparate între RD (n = 5) și HFDn = 4) grupuri la 4 săptămâni după FMT.

Analize statistice

Datele pentru fiecare grup sunt prezentate ca medie ± eroare standard a mediei (SEM). Abundența relativă a fost analizată utilizând LEfSe pe baza testelor Kruskal - Wallis și Wilcoxon, iar semnificația a fost definită la P –Δ Δ Metoda de cuantificare relativă Ct (ΔΔCt = (Ct. Țintă - Ct.β - actină)grup1 - (Ct.Target - Ct.β - actin) Group2) a fost utilizat. Semnificația statistică a fost evaluată prin analiza unică a varianței (ANOVA), urmată de cea a lui Duncan post hoc test cu pachetul agricolae în RStudio. Toate analizele statistice au fost efectuate folosind RStudio. A P valoare Cuvinte cheie: atorvastatină, rosuvastatină, microbiota intestinală, IL-1β, TGFβ1, acid gras cu lanț scurt

Citație: Kim J, Lee H, An J, Song Y, Lee C-K, Kim K și Kong H (2019) Alterări în microbiota intestinală prin terapia cu statine și posibile efecte intermediare asupra hiperglicemiei și hiperlipidemiei. Față. Microbiol. 10: 1947. doi: 10.3389/fmicb.2019.01947

Primit: 16 martie 2019; Acceptat: 08 august 2019;
Publicat: 04 septembrie 2019.

Yuheng Luo, Universitatea Agricolă Sichuan, China

Monica Di Paola, Universitatea din Florența, Italia
Natasa Golic, Universitatea din Belgrad, Serbia

* Corespondență: Hyunseok Kong, [email protected]

† Acești autori au contribuit în mod egal la această lucrare