Abstract

DECLARAȚIE DE IMPORTANȚĂ Motivația de a mânca depinde de echilibrul relativ al activității în regiuni distincte ale creierului care induc sau suprima pofta de mâncare. O cantitate anormală de activitate în neuroni care induce pofta de mâncare poate provoca obezitate, în timp ce o cantitate anormală de activitate în neuroni care suprimă pofta de mâncare poate provoca malnutriție și o reducere severă a greutății corporale. Scopul acestui studiu a fost de a determina dacă o populație de neuroni cunoscuți ca induc pofta de mâncare („neuroni AgRP”) ar putea induce consumul de alimente pentru a depăși suprimarea poftei de mâncare după administrarea diferiților compuși care suprimă pofta de mâncare. Am descoperit că stimularea neuronilor AgRP ar putea depăși diferite forme de suprimare a apetitului și ar putea scădea activitatea neuronală într-o populație separată de neuroni care suprimă apetitul, oferind noi perspective asupra modului în care creierul reglează aportul de alimente.

aportul

  • AgRP
  • apetit
  • CGRP
  • ChR2
  • consumul de alimente
  • nucleul parabrahial

Introducere

Motivația de a mânca depinde de echilibrul relativ al activității dintre sistemele creierului orexigen și anorexigen (Sternson și Eiselt, 2017). Neuronii care exprimă proteina Agouti (AgRP) în nucleul arcuat al hipotalamusului sunt o populație neuronală cheie orexigenă care crește comportamentul de consum alimentar ca răspuns la nevoia homeostatică (Ilnytska și Argyropoulos, 2008; Sternson, 2013). Acești neuroni exprimă, de asemenea, neuropeptida Y și neurotransmițătorul inhibitor GABA (Tong și colab., 2008; Wu și colab., 2009). Neuronii AgRP cresc activitatea ca răspuns la lipsa de alimente și administrarea hormonului orexigenic grelină, după cum se demonstrează prin expresia Fos (un marker indirect al activității neuronale), înregistrarea electrofiziologică în feliile cerebrale și imagistica in vivo a calciului (Takahashi și Cone, 2005; Betley și colab., 2015; Chen și colab., 2015; Mandelblat-Cerf și colab., 2015). Mai mult, neuronii AgRP sunt atât necesari, cât și suficienți pentru medierea comportamentului de hrănire: inhibarea chimiogenetică a neuronilor AgRP scade semnificativ hrănirea (Krashes și colab., 2011) și ablația genetică a neuronilor AgRP provoacă foamete (Luquet și colab., 2005); în schimb, stimularea optogenetică sau chimiogenetică a neuronilor AgRP determină o creștere rapidă și reversibilă a aportului de alimente (Aponte și colab., 2011; Krashes și colab., 2011).

Pentru a orchestra comportamentul consumului de alimente, neuronii AgRP se proiectează către mai multe populații neuronale în aval redundante (Betley și colab., 2013). Pentru a promova maxim aportul de alimente, neuronii AgRP pot inhiba simultan alte sisteme cerebrale care suprimă activ apetitul. De exemplu, stimularea neuronilor AgRP poate inhiba neuronii anorexigenici din nucleul talamic paraventricular, restabilind indirect modele de răspuns de tip foame în cortexul insular după o masă (Livneh și colab., 2017).

Neuronii AgRP pot inhiba, de asemenea, direct sau indirect, neuronii anorexigenici din nucleul parabrahial (PBN) care exprimă peptida legată de gena calcitoninei (CGRP) și s-a dovedit că suprima pofta de mâncare (Carter și colab., 2013). Acești neuroni cresc activitatea ca răspuns la semnale anorexigenice, cum ar fi amilina și colecistochinina (CCK), hormoni secretați în urma unei mese de către pancreas și respectiv intestinul subțire (Becskei și colab., 2007; Carter și colab., 2013). Neuronii PBN CGRP cresc, de asemenea, expresia Fos după administrarea de inhibitori exogeni ai apetitului, cum ar fi clorura de litiu (LiCl), o sare care creează disconfort gastric și lipopolizaharida (LPS), o componentă a peretelui celular bacterian care induce inflamația (Rinaman și Dzmura, 2007; Carter și colab., 2013, 2015). Stimularea optogenetică sau chimiogenetică a neuronilor PBN CGRP reduce rapid și reversibil aportul de alimente (Carter și colab., 2013; Campos și colab., 2016). În condițiile inițiale, inactivarea chimiogenetică a neuronilor PBN CGRP crește dimensiunea și durata mesei, dar nu are niciun efect asupra aportului total de alimente în timp (Campos și colab., 2016). În schimb, în ​​timpul condițiilor de suprimare a apetitului, inactivarea chimiogenetică a neuronilor PBN CGRP crește aportul total de alimente (Carter și colab., 2013; Campos și colab., 2016). Inactivarea permanentă a neuronilor PBN CGRP prin intermediul toxinei tetanice elimină complet efectele sățioase ale CCK (Campos și colab., 2016).

Neuronii AgRP trimit proiecții GABAergic către PBN (Wu și colab., 2009; Atasoy și colab., 2012; Betley și colab., 2013; Campos și colab., 2016), sugerând că neuronii AgRP pot inhiba direct sau indirect neuronii PBN CGRP . În concordanță cu această ipoteză, neuronii CGRP sunt foarte activi după ablația neuronilor AgRP (Wu și colab., 2009; Campos și colab., 2016), iar stimularea proiecțiilor AgRP-la-PBN reduce expresia Fos în neuronii CGRP PBN după administrare al hormonului anorexigenic exendin-4 (Campos și colab., 2016).

Am testat ipotezele conform cărora neuronii AgRP ar putea depăși suprimarea poftei de mâncare după administrarea de compuși anorexigenici și scăderea activității în neuronii PBN CGRP. Am constatat că stimularea neuronilor AgRP sau a proiecțiilor AgRP neuron-PBN a crescut aportul de alimente după administrarea de amilină, CCK și LiCl, dar nu și LPS. Stimularea neuronilor AgRP a ameliorat suprimarea poftei de mâncare cauzată de stimularea chemogenetică a neuronilor PBN CGRP și reducerea expresiei Fos în neuronii PBN CGRP în toate condițiile. Descoperirile noastre arată că neuronii AgRP pot depăși suprimarea apetitului neinflamator și pot reduce activitatea în neuronii anorexigenici PBN CGRP, elucidând modul în care creierul echilibrează intrările orexigenice și anorexigenice pentru a regla comportamentul de hrănire.

Materiale și metode

Toate experimentele au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor de la Colegiul Williams și au fost efectuate în conformitate cu liniile directoare descrise în Ghidul Institutelor Naționale de Sănătate pentru Îngrijirea și Utilizarea Animalelor de Laborator. Am folosit șoareci masculi AgRP Cre/+ (Tong et al., 2008; Jackson Laboratories, Catalog # 012899) crescuți pe un fundal C57BL/6. În unele experimente, am încrucișat șoareci AgRP Cre/Cre cu șoareci Calca Cre/+ (Carter și colab., 2013) pentru a produce șoareci AgRP Cre/+; Calca Cre/+. Toți șoarecii aveau 7-9 săptămâni în momentul intervenției chirurgicale și nu mai mult de 16-20 săptămâni la încetarea experimentelor. Șoarecii au fost adăpostiți în cuști individuale cu un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore la 22 ° C.

Pregătirea virusului.

S-au obținut vectori de serotip 1 (AAV1) de virus recombinant adeno-asociat recombinabil inductibil care poartă fie ChR2-mCherry (AV-1-20297P), eGFP (AV-1-ALL854), fie TdTomato (AV-1-ALL864) Vector Core al Universității din Pennsylvania. Vectorii AAV8 inducibili de cre conținând fie hM3Dq-mCherry (44361), fie mCherry (50459) au fost obținuți de la Addgene. Alicote virale au fost depozitate la -80 ° C înainte de injecția stereotaxică.

Chirurgie stereotaxică.

Șoarecii au fost anesteziați cu 4% izofluran și așezați pe un cadru stereotaxic (David Kopf Instruments). Odată ajunși pe cadru și în restul procedurilor chirurgicale, șoarecii au primit 1-2% izofluran trans-nazal. După ce craniul a fost expus și nivelat în plan orizontal, AAV a fost injectat stereotaxic unilateral sau bilateral, așa cum este descris în text, în nucleul arcuat [Fig. 1A; anteroposterior (AP), -1,4 mm; mediolateral (ML), 0,45 mm; dorsoventral (DV), −5,9 mm]. În unele experimente, AAV a fost, de asemenea, injectat stereotaxic în nucleul parabrahial (AP, -4,9 mm; ML, 1,4 mm; DV, 3,8 mm). Un total de 0,5 μl de virus a fost injectat la o rată de 0,1 μl/min și a fost lăsat să difuzeze 8-10 min înainte ca acul de injectare să fie îndepărtat.

După injecția virală, șoarecii au primit implantarea chirurgicală unilaterală a unei canule mono-fibre optice (lentile dorice) deasupra nucleului arcuit (Fig. 1A; AP, -1,4 mm; ML, 0,45 mm; DV 5,5 mm). În experimentele ulterioare, șoarecii au primit implantare chirurgicală unilaterală sau bilaterală de canule de fibră optică deasupra PBN (AP, -5,2 mm; ML, 1,6 mm; DV, 3,0 mm). Canulele au fost fixate pe craniu cu C&B Metabond (Parkell) și acrilic dentar. Toți șoarecii au primit cel puțin 14 zile pentru a se recupera după operație înainte de începerea procedurilor experimentale. În urma experimentelor comportamentale, secțiunile cerebrale care conțin nucleul arcuat au fost inspectate pentru exprimarea virusului și implantarea corectă a canulelor cu fibre optice (Fig. 1B, C); animalele care nu au prezentat expresie virală (fluorescență mCherry sau GFP) sau plasarea corectă a canulelor nu au fost incluse în analiza ulterioară a datelor.

Măsurători ale consumului de alimente.

Pentru testele de hrănire, șoarecii au fost adăpostiți individual în cuști de măsurare a consumului de alimente/lichide atașate sticlelor de apă montate pe cântare (Omnitech Electronics). Șoarecii au primit o dietă lichidă de Vanilla Ensure (Abbott Nutrition) diluată într-un raport 1: 2 cu apă. Această dietă lichidă avea o densitate calorică de 450 kcal/L. Șoarecii au fost lăsați să se obișnuiască timp de minimum 72 de ore. Sticlele care conțin dietă lichidă au fost spălate și dezinfectate zilnic și completate complet la începutul ciclului de lumină. Deoarece șoarecii au avut tendința de a-și crește aportul de alimente ca răspuns la completarea dietei lichide, au fost efectuate studii de consum de alimente la cel puțin 3 ore după schimbarea sticlelor de alimente proaspete. Toate măsurătorile consumului de alimente au fost obținute în timpul celor 4 ore medii ale ciclului inactiv (4-7 ore după apariția luminii).

Fotostimulare.

Șoarecii au fost atașați la cabluri de fibră optică (1,5 m lungime, 200 μm diametru; lentile dorice) acoperite cu tub opac termocontractabil și lăsate să se aclimatizeze timp de cel puțin 5 zile înainte de sesiunile experimentale. Fotostimularea a fost produsă de un laser cu lumină albastră de 473 nm (LaserGlow) acționat de un stimulator de impulsuri Master-8 (AMPI), care a fost programat să livreze impulsuri de lumină de 10 ms la 20 Hz timp de 1 s la fiecare 4 s timp de 20 min. 1D) . Pentru fiecare studiu, aportul de alimente a fost înregistrat exact 1 oră: cele 20 de minute înainte, în timpul și după fotostimulare (Fig. 1D).

Farmacologie.

Toți compușii anorexigenici au fost preparați în soluție salină sterilă 0,9% și depozitați la -20 ° C înainte de utilizare. Pentru fiecare studiu cu aport alimentar, 250 μl de soluție salină sterilă 0,9%, amilină (10 μg/kg; Bachem), CCK (10 μg/kg; Bachem), LiCl (84 mg/kg; Bachem) sau LPS (50 μg/kg; Calbiochem), a fost administrat intraperitoneal. Pentru compușii cu acțiune rapidă (amilină, CCK, LiCl) și controlul salin, injecțiile au fost efectuate cu 10 minute înainte de înregistrarea aportului de alimente (30 de minute înainte de stimularea optogenetică; Fig. 1E). Deoarece LPS nu suprimă pofta de mâncare imediat, ci mai degrabă reduce pofta de mâncare prin inițierea unui răspuns inflamator, injecțiile cu LPS au fost efectuate cu 4 ore înainte de înregistrarea aportului alimentar (Fig. 1E). Toate studiile privind consumul de alimente au fost efectuate în timpul celor 4 ore medii ale perioadei inactive. Șoarecilor li s-a permis cel puțin 24 de ore să se recupereze după injecția de amilină, CCK și LiCl înainte de începerea studiilor ulterioare și cel puțin 48 de ore să se recupereze după injectarea de LPS pentru a explica timpul suplimentar de recuperare datorat răspunsului inflamator. La fiecare șoarece s-au efectuat maximum opt studii pe compus.

Pentru experimentele farmacogenetice, șoarecii au primit o injecție intraperitoneală de clozapină-N-oxid (CNO; 0,5 mg/kg, Sigma-Aldrich) cu 2 ore înainte de măsurarea aportului alimentar. Șoarecilor li s-a permis cel puțin 48 de ore să se recupereze între studii.

Histologie.

La sfârșitul procedurilor experimentale, șoarecii au fost anesteziați cu injecție intraperitoneală de 2,2,2 tribromoetanol (Sigma-Aldrich, 48402) dizolvat în alcool terț-amilic și soluție salină sterilă 0,9%. Șoarecii au fost apoi perfuzați transcardic cu 0,01 m PBS rece, pH 7,4, urmat de 4% paraformaldehidă în PBS. Creierele au fost extrase, lăsate să se fixeze peste noapte în 4% paraformaldehidă la 4 ° C și crioprotejate în 30% zaharoză dizolvată în PBS pentru încă 24 de ore la 4 ° C. Fiecare creier a fost secționat la 30 μm pe un microtom (Leica Microsystems) și colectat în PBS rece.

Pentru experimentele de imunohistochimie, secțiunile au fost spălate de trei ori în PBS cu 0,2% Triton X-100 (PBST) timp de 10 minute la temperatura camerei. Secțiunile au fost apoi incubate într-o soluție de blocare compusă din PBST cu 3% ser de măgar normal (Jackson ImmunoResearch, 017-000-121) timp de 15 minute la temperatura camerei. Pentru expunerea primară la anticorpi, secțiunile au fost incubate în iepuri anti-Fos (1: 1000; Cell Signaling Technology, 2250) în soluție de blocare peste noapte la 4 ° C. După trei spălări de 5 minute în soluție de blocare, secțiuni au fost incubate în AlexaFluor 488 măgar anti-iepure (1: 250; Jackson ImmunoResearch, 711-545-152) în soluție bloc timp de 1 oră la temperatura camerei. În cele din urmă, secțiunile au fost spălate de trei ori în PBS.

Secțiunile creierului au fost montate în PBS pe lamele de sticlă SuperFrost Plus (VWR, 48311-703), acoperite cu Dapi Fluoromount-G (Southern Biotech, 0100-20) și depozitate în întuneric la 4 ° C înainte de microscopie și imagistică. Diapozitivele au fost realizate cu ajutorul unui microscop epifluorescent Eclipse 80i (Nikon), iar imaginile au fost capturate folosind o cameră digitală RETIGNA 2000R. Imaginile rezultate au fost procesate minim folosind Photoshop CS5 (Adobe Systems) pentru a spori luminozitatea și contrastul pentru o reprezentare optimă a datelor. Toate imaginile digitale au fost procesate în același mod între condițiile experimentale pentru a evita manipularea artificială între diferite seturi de date.

Cuantificarea colocalizării Fos și mCherry în PBN a fost efectuată pe secțiuni adiacente de la ∼ - 4,90 la -5,50 mm de la bregma (21 secțiuni pe șoarece). Toată analiza de cuantificare a fost efectuată de un investigator orbit de identitatea condițiilor utilizate pentru a induce Fos.

Proiectare experimentală și analiză statistică.

Am folosit un design experimental între subiecți pentru toate experimentele, cu excepția celor efectuate în Figura 3, în care am folosit un design subiecți (comparând condițiile ad libitum și privarea alimentelor la animale). Toate experimentele comportamentale au inclus un n ≥ 5 pentru fiecare cohortă de animale cu cel puțin cinci studii pentru fiecare animal. Toate experimentele de expresie Fos au inclus un n = 5 pentru fiecare cohortă de animale cu un singur studiu pentru fiecare animal. Datele au fost analizate folosind Prism 6.0 (GraphPad Software). Testele statistice au inclus ANOVA bidirecțional cu măsuri repetate (Fig. 2, 3, 4D - F, 6B - G, I), ANOVA bidirecțional fără măsuri repetate (Fig. 5) și testul t cu două cozi nepereche așa cum este descris in text.

Rezultate

Stimularea optogenetică a neuronilor AgRP induce hrănirea după administrarea de compuși anorexigenici neinflamatori

Paradigme optogenetice și farmacologice utilizate pentru manipularea comportamentelor de hrănire. A, Diagrama care prezintă plasarea unei canule mono-fibre optice deasupra nucleului arcuit și a constructelor AAV utilizate pentru transducerea neuronilor AgRP. Triunghiurile gri și negru reprezintă site-uri loxP și, respectiv, lox2722. B, C, Imagini reprezentative care arată expresia unilaterală a ChR2-mCherry (B) sau GFP (C) în nucleul arcuat. Linia punctată arată locația aproximativă a vârfurilor implanturilor cu fibră optică. Bara de scalare, 250 μm. D, Protocol de fotostimulare. În timpul perioadei de fotostimulare de 20 de minute, impulsurile de lumină de 10 ms au fost livrate la 20 Hz timp de 1 s la fiecare 4 s. E, Cronologie a injecției pentru experimentele de aport alimentar.

Model de anatomie funcțională a proiecțiilor neuronale AgRP. Neuronii AgRP cresc aportul de alimente prin proiectarea către populațiile din aval (conexiuni verzi) care inițiază hrănirea, incluzând nucleul de pat al stria terminalis (BNST), hipotalamusul lateral (LH), nucleul hipotalamic paraventricular (PVH) și nucleul talamic paraventricular (PVT). Neuronii AgRP inhibă, de asemenea, alte stări comportamentale/fiziologice care nu se hrănesc prin proiectarea către regiuni din aval (conexiuni roșii), cum ar fi MeA pentru a inhiba frica și agresivitatea sau arcuirea neuronilor kisspeptin (Kiss) pentru a inhiba reproducerea. Rezultatele noastre demonstrează că neuronii AgRP dezactivează stările de suprimare a apetitului neinflamatorii prin proiectarea către PBN (conexiuni roșu închis).

Note de subsol

Această lucrare a fost susținută de National Institutes of Health Grant DK105510 de la Institutul Național de Digestiv și Diabet și Boli Renale (NIDDK) către M.E.C. Mulțumim lui R. Palmiter pentru șoarecii Calca Cre și N. Goldstein, B. Levine și C. Mook pentru comentarii constructive și feedback pe hârtie.

Autorii declară că nu există interese financiare concurente.