Risuke Mizuno

1 Departamentul de Farmacologie Veterinară, Școala Absolventă de Agricultură și Științe ale Vieții, Universitatea din Tokyo, Tokyo, Japonia.

2 Departamentul de endocrinologie vasculară moleculară, Facultatea de Medicină, Universitatea din Tokyo, Tokyo, Japonia.

Masashi Isshiki

3 Departamentul de endocrinologie și diabet, Facultatea de Medicină, Universitatea de Medicină Saitama, Saitama, Japonia.

Nobuyuki Ono

4 Departamentul de Electronică și Inginerie de Control, Colegiul Național de Tehnologie din Nagano, Nagano, Japonia.

Mitsuhiro Nishimoto

5 Divizia de Epigenetică Clinică, Centrul de Cercetare pentru Știință și Tehnologie Avansată, Universitatea din Tokyo, Tokyo, Japonia.

Toshiro Fujita

4 Departamentul de Electronică și Inginerie de Control, Colegiul Național de Tehnologie din Nagano, Nagano, Japonia.

Abstract

Fundal: Sistemul limfatic contribuie la homeostazia lichidă în diferite țesuturi. Dovezi recente sugerează că limfangiogeneza indusă de o dietă bogată în sare (HSD) este asociată cu reglarea tensiunii arteriale. Ganglionii limfatici, localizați de-a lungul căilor limfatice, nu sunt doar țesuturi limfoide secundare importante pentru metastazele cancerului, inflamația și răspunsurile imune, dar sunt importante și pentru homeostazia fluidelor. Limfaticele aferente colectează limfa din zona pre-nodală și limfaticele eferente drenează limfa din ganglionii limfatici. Cu toate acestea, diferența de activitate mecanică dintre limfaticele aferente și eferente și efectul unui HSD asupra acestor vase nu au fost arătate.

Metode și rezultate: Modificările activității mecanice a limfaticelor aferente și eferente izolate în dieta normală cu sare (NSD) și șoarecii HSD de 4 săptămâni ca răspuns la creșterile presiunilor intraluminale de la 3 la 7 cmH2O au fost măsurate utilizând video-microscopie. Presiunea intramurală mai mare a scăzut în mod echivalent activitatea de pompare a limfaticelor aferente și eferente la șoarecii NSD. Un HSD a suprimat amplitudinea, fracția de ejecție și volumul de cursă a limfaticelor aferente, ducând la reduceri marcate ale activității de pompare. În contrast, activitățile de pompare ale limfaticelor eferente au fost rezistente la HSD și au fost păstrate prin creșterea frecvenței de contracție.

Concluzii: Un HSD a modulat diferențial activitatea mecanică a limfaticelor colectoare aferente și eferente în ganglionii limfatici iliaci murini.

Introducere

Sistemul limfatic joacă un rol important în reglarea transportului fluidelor extracelulare și a substanțelor macromoleculare precum albumina și acidul hialuronic în condiții fiziologice și fiziopatologice. 1,2 Acest sistem microcirculator, care include ganglionii limfatici, acționează și ca o cale pentru traficul de limfocite și macrofage în timpul răspunsurilor imunologice și pentru celulele carcinomului în metastazele limfatice. 1,3 Ganglionii limfatici joacă un rol esențial în imunitate. De exemplu, celulele B născute din timus și celulele B derivate din măduva osoasă sunt distribuite țesuturilor limfoide secundare, inclusiv ganglionii limfatici, plasturile Peyer, amigdalele, glanda timusului și apendicele. Celulele T și B intră în țesuturile limfoide secundare prin venule endoteliale ridicate (HEV). Limfocitele care scapă de ganglionii limfatici revin în sistemul venos prin vasele limfatice eferente și canalul toracic.

Recent, au fost detectate molecule de adeziune specifice implicate în interacțiunea dintre HEV și limfocite. Se raportează că celulele care plutesc în spații interstițiale și capilare limfatice, cunoscute sub numele de situsuri inițiale pentru metastaza cancerului, interacționează prin intermediul citokinelor sau chemokinelor. 5 În plus, examinarea clinică a ganglionilor limfatici santinelă este avantajoasă pentru pacienții cu cancer pentru a îmbunătăți calitatea vieții prin prevenirea edemului limfatic secundar și reducerea traumei chirurgicale. 6-8 Astfel, în fiziopatologia sistemului limfatic, ganglionul limfatic este un factor critic pentru dinamica limfatică.

Ganglionii limfatici au o structură unică care implică circulația sângelui și a limfei. În general, mai multe vase limfatice aferente se conectează la ganglionii limfatici și unul sau mai multe vase limfatice eferente relativ mari drenează limfa de la ganglioni. Aceste vase limfatice aferente și eferente care penetrează ganglionii limfatici funcționează ca o serie de pompe limfatice pentru a propulsa lichidul limfatic intra-nodal prin constricție și dilatare oscilatorie, precum și drenarea limfei din părți mai periferice. Celulele musculare netede din vasele limfatice ale oamenilor și animalelor prezintă activitate spontană intrinsecă și servesc drept mecanism principal al pompei in vivo și ex vivo. 1 Presiunea intraluminală a limfaticelor este unul dintre cei mai importanți factori pentru reglarea contracției spontane a mușchiului neted limfatic. O creștere a presiunii intraluminale mărește frecvența și scade amplitudinea modificărilor oscilatorii în diametrul vaselor limfatice. 9-11 În ciuda cercetărilor ample asupra sistemului limfatic, analizele funcționale ale limfaticelor aferente și eferente nu au fost pe deplin prezentate.

Hipertensiunea este un factor de risc major pentru boli precum accident vascular cerebral, insuficiență cardiacă și boli de rinichi. Aportul ridicat de sare este strâns asociat cu patogeneza și dezvoltarea hipertensiunii sensibile la sare. 12 Încărcarea sării, prin excreția renală ineficientă de sodiu, duce adesea la extinderea volumelor de lichide din corpul circulant. Ca efect al încărcării de sare asupra sistemului limfatic, Machnik și colab. a raportat factorul de creștere endotelial vascular (VEGF) -C mediază hiperplazia capilarelor limfatice în urechea rozătoarelor și a propus că capilarele ajută la menținerea homeostaziei fluide și a tensiunii arteriale. 13 Cu toate acestea, modificările funcționale ale sistemului de transport limfatic induse de sare rămân necaracterizate în colectarea limfaticelor, în special în vasele care perfuzează prin ganglioni limfatici. Prin urmare, în studiul de față am examinat efectul presiunii intraluminale asupra activității mecanice a limfaticelor aferente și eferente în ganglionii limfatici după o dietă normală cu sare (NSD) și o dietă bogată în sare (HSD).

Materiale și metode

Animale

Șoarecii masculi ICR, cu vârsta de 5 săptămâni (n = 34, Tokyo Jikken Dobutsu, Tokyo, Japonia), au fost împărțiți în grupuri NSD (n = 17) și HSD (n = 17). Șoarecii NSD au fost hrăniți cu o dietă standard de pelete și apă timp de 9 săptămâni. Șoarecii HSD au fost hrăniți cu NSD timp de 5 săptămâni și apoi au primit o soluție salină HSD (8% NaCl; g/v) și 1% (g/v) timp de 4 săptămâni. Comitetul de etică animală al Facultății de Medicină a Universității din Tokyo a aprobat toate protocoalele experimentale în conformitate cu principiile și liniile directoare privind îngrijirea animalelor ale Societății Fiziologice din Japonia.

Studii in vivo: măsurători ale tensiunii arteriale și ale ritmului cardiac

Presiunea arterială arterială și frecvența cardiacă a șoarecilor NSD (n = 5) și HSD (n = 5) au fost măsurate folosind metoda coșului (BP-98A-L, Natsume).

Studii ex vivo: preparate tisulare

Șoarecii au fost sacrificați de un impact puternic asupra capului, urmat de decapitare. După o incizie în cavitatea abdominală, limfaticele aferente și eferente cu ganglionii limfatici iliaci au fost excizate și plasate într-o cutie Petri care conține soluție rece (4 ° C) Krebs-bicarbonat (în mM: 120,0 NaCl, 5,9 KCl, 2,5 CaCl2, 1,2 MgSO4, 1,2 NaH2PO4, 5 glucoză și 25,0 NaHCO3). 14.15

Cu instrumente microchirurgicale și un microscop operațional, vasele limfatice au fost izolate și apoi transferate într-o cameră de organe de 10 ml cu două micropipete de sticlă care conțin soluție Krebs-bicarbonat. După ce fiecare vas limfatic a fost montat pe o pipetă (proximal) și fixat cu suturi, presiunea de perfuzie a fost ridicată la 4 cmH2O pentru a spăla și a degaja vasul. Ulterior, capătul distal al vasului a fost montat pe micropipeta de ieșire (distală). Micropipetele proximale și distale au fost conectate printr-un tub Tygon cu o seringă de 10 ml și, respectiv, un robinet. Soluția Krebs-bicarbonat barbotată cu 5% CO2/10% O2/85% N2 (v/v) a fost perfuzată extraluminal peste limfaticele din camera organelor. Debitul soluției superfuzate a fost menținut la 2,5 ml/min pe tot parcursul experimentului. După canularea limfaticelor, camera a fost transferată în stadiul unui microscop (Olympus BH-2, Tokyo, Japonia). Limfaticele au fost apoi încălzite încet la 37 ° C și lăsate să se echilibreze timp de -90 min.

Măsurarea caracteristicilor mecanice ale vaselor limfatice

Pentru a măsura activitatea mecanică a vaselor limfatice izolate, am folosit un sistem de microscopie video, așa cum s-a descris anterior. 14,15 Un obiectiv obiectiv (x10) și o cameră monocromă cu dispozitiv cuplat la încărcare (KOCOM, KCB-270A, Coreea) au fost folosite pentru a obține imagini limfatice, care au fost afișate pe un monitor de televiziune monocrom (Hamamatsu Photonics, C1846, Hamamatsu, Japonia). Diametrul limfaticelor a fost măsurat cu un dispozitiv de detectare a diametrului cu o metodă de detectare a muchiilor. 16 Au fost înregistrate pe un DVD recorder (Pioneer, DVR55, Tokyo, Japonia) și un oscilograf cu scriere directă (Sanei-Sokki, Recti 8K, Tokyo, Japonia). Lungimea eșantioanelor aferente și eferente izolate după canulare au fost de 2-3 mm și respectiv de 4-5 mm. Vasele utilizate în prezentul studiu conțineau o supapă și am măsurat diametrul acesteia în amonte de supapă. 14.15

În studiul de față, am măsurat diametrul pasiv (PD; μm), diametrele active (diametrul maxim; Dmax μm și diametrul minim; Dmin μm) și frecvența (min -1) a activității limfatice la șoarecii NSD și HSD. Am calculat amplitudinea (Dmax - Dmin), fracția de ejecție (EF; (πDmax 2 −πDmin 2)/πDmax 2), indicele volumului cursei (SVI; πDmax 2 −πDmin 2) și frecvența ori SVI. 16

Efectul presiunii intraluminale asupra funcției limfatice în vasele NSD și HSD

După perioada de echilibrare la o presiune intraluminală de 5 cmH2O, presiunea intraluminală a crescut de la 3 la 7 cmH2O în pași de 2 cmH2O prin ridicarea unei seringi de 10 ml conectată la tubul de intrare, în timp ce tubul de ieșire a fost închis cu un robinet pe tot parcursul experimentului . Fiecare nivel de presiune a fost menținut timp de ± 15 min pentru a permite vaselor să prezinte oscilații stabile și spontane cu diametru. La sfârșitul fiecărui experiment, soluția Krebs-bicarbonat a fost schimbată într-o soluție Krebs-bicarbonat fără Ca 2+ care conținea și acid etilendiaminetetraacetic (EDTA; 1 mM) și nifedipină (un blocant al canalelor Ca 2+, 10 μM). Vasele limfatice au fost incubate cu soluție fără Ca2+ timp de -20 min și etapele de presiune au fost repetate. PD-urile au fost măsurate la fiecare valoare a presiunii. 9-11

Droguri

Toate sărurile și EDTA au fost obținute de la Wako (Osaka, Japonia); nifedipina era de la Sigma Aldrich (St. Louis, MO, SUA).

Statistici

Modificările diametrelor vaselor în urma creșterii presiunii intraluminale au fost exprimate ca procent din PD-ul corespunzător (100 × diametru în prezența Ca 2+ extracelular/diametru în absența Ca 2+ extracelular). 9-11 Datele sunt prezentate ca medie ± eroare standard a mediei, iar n indică numărul de nave. Diferențe semnificative (p Fig. 1A - F). Cei trei parametri (PD, Dmax și Dmin) ai ambelor vase limfatice aferente și eferente au crescut ca răspuns la presiunea intraluminală crescută de la 3 la 7 cmH2O cu sau fără încărcare de sare (Fig. 1A - F). Un HSD a scăzut semnificativ PD, Dmax și Dmin ale vaselor limfatice aferente, dar nu și ale vaselor limfatice eferente în intervalul presiunilor intraluminale pe care le-am testat (Fig. 1A - C).

sare

Modificări ale diametrului pasiv (PD; μm, (A) NSD și (D) HSD), diametrul maxim (Dmax; μm, (B) NSD și (E) HSD) și diametrul minim (Dmin; μm, (C) NSD și (F) HSD) a limfaticelor ca răspuns la creșterea presiunii intraluminale. Panourile superioare și inferioare indică limfatice aferente (cercuri) și eferente (pătrate), respectiv. Simbolurile albastre și roșii indică vasele izolate de șoareci NSD (n = 6) și respectiv HSD (n = 6). * p 2+ soluție Krebs-bicarbonat/diametru în soluție Krebs-bicarbonat fără soluție. 9.10

Ca răspuns la creșterea presiunilor intraluminale de la 3 la 7 cmH2O,% Dmax al vaselor limfatice aferente în NSD (de la 75 ± 2% la 71 ± 2%, n = 6) și HSD (de la 80 ± 4% la 75 ± 4%, n = 6) șoareci au scăzut ușor, prezentând o relație negativă între presiune și% Dmax la șoareci NSD (-1,0 ± 0,5, n = 6) și HSD (-1,3 ± 1, n = 6). Nu au existat diferențe semnificative în% Dmax și pante între șoareci NSD și HSD (Fig. 2A). Astfel, un HSD nu a afectat tonul miogen al limfaticelor aferente care a fost ușor crescut de presiunea mai mare. % Dmin al vaselor limfatice aferente la șoarecii NSD și HSD a fost constant sub presiuni intraluminale de la 3 la 7 cmH2O. % Dmin al limfaticelor aferente la șoareci HSD (70 ± 3%, n = 6) la 5 cmH2O a fost semnificativ mai mare decât cel al șoarecilor NSD (63 ± 2%, n = 6), sugerând contractilitate scăzută după un HSD (Fig. 2B). Relația dintre presiune și% Dmin nu a fost semnificativ diferită între șoarecii NSD (0,7 ± 0,4, n = 6) și HSD (-0,5 ± 0,7, n = 6).

Modificări induse de presiunea intraluminală în% diametru maxim (% Dmax, (A) NSD și (B) HSD) și% diametru minim (% Dmin, (C) NSD și (D) HSD) exprimat ca procent din diametrul pasiv corespunzător al limfaticelor. Panourile superioare și inferioare indică limfatice aferente (cercuri) și eferente (pătrate), respectiv. Cercurile albastre și roșii indică vasele izolate de șoareci NSD (n = 6) și respectiv HSD (n = 6). * p Fig. 2C). Creșterea presiunii a crescut% Dmin de limfatice eferente la șoareci NSD și HSD fără diferențe semnificative între șoareci NSD și HSD la presiuni de la 3 la 7 cmH2O. O relație pozitivă între presiune și% Dmin a fost observată la șoareci NSD (1,4 ± 0,1, n = 6) și HSD (1,9 ± 0,6, n = 6), dar nu a existat nicio diferență semnificativă între grupuri (Fig. 2D). Astfel, tonul miogen al vaselor limfatice aferente și eferente a fost aproape identic, a rămas constant ca răspuns la creșteri ale presiunii intramurale și nu a fost afectat de încărcarea sării. Contractilitatea ambelor vase limfatice aferente și eferente a scăzut în mod similar ca răspuns la creșterea presiunii intramurale. Cu toate acestea, contractilitatea numai a vaselor limfatice aferente a fost redusă cu un HSD la o presiune de 5 cmH2O.

Inotropism și cronotropism al vaselor limfatice aferente și eferente la șoarecii NSD și HSD: Răspunsuri la presiunea intraluminală crescută

Pentru a clarifica în continuare efectele HSD asupra inotropismului și cronotropismului activității de pompare a intrărilor și ieșirilor din ganglionii limfatici iliaci, am calculat amplitudinea, EF, frecvența, SVI și frecvența × SVI a vaselor limfatice de la șoareci NSD și HSD ca răspuns la creșteri ale presiunii intraluminale.

Creșterea presiunii intraluminale de la 3 la 7 cmH2O a redus amplitudinea și EF, parametrii inotropi ai activității de pompare și a limfaticelor aferente și eferente, indicând faptul că creșterile presiunii intraluminale au provocat un efect inotrop negativ asupra contracției spontane a limfaticelor aferente și eferente atât în ​​NSD cât și în NSD. Șoareci HSD (Fig. 3A - D). Deși amplitudinea și EF ale limfaticelor aferente și eferente după un NSD au fost similare, un HSD a scăzut semnificativ parametrii inotropi în vasele limfatice aferente (Fig. 3A, B), dar nu și în vasele limfatice eferente (Fig. 3C, D), indicând că încărcarea ridicată a sării inhibă selectiv activitatea pompei inotrope în vasele limfatice aferente ale ganglionilor limfatici care nu afectează părțile eferente.