ABSTRACT

INTRODUCERE

Scopul prezentului studiu a fost analizarea genelor metabolismului glucozei, adică gene aparținând celor două căi principale legate de glucoză: glicoliză și gluconeogeneză (Fig. S1), pentru: (i) identificarea și caracterizarea evoluției genelor de glicoliză duplicate în păstrăv curcubeu (adică fosfofructokinază hepatică și piruvat kinazic hepatic); (ii) determinați modelul de expresie al genelor duplicate legate de metabolismul glucozei, adică gene glicolitice (paralogi de glucokinază, gcka și gckb; paralogi de fosfofructokinază hepatică, pfkla și pfklb; piruvat kinază hepatică și de celule roșii din sânge, pklr) și gene gluconeogene (fosfenol citosolic și mitocondrial piruvat carboxicinază p1b1 și pb1 p1 și fbp1b2; paralogii glucozei 6-fosfatazei g6pca, g6pcb1.a, g6pcb1.b, g6pcb2.a și g6pcb2.b), precum și activitatea lor enzimatică globală corespunzătoare în stadii critice de dezvoltare în ontogeneza ficatului; și (iii) studiați modelul de expresie al acestor gene în timpul tranziției nutriționale de la hrănirea endogenă la cea exogenă la păstrăvul hrănit cu o dietă care nu conține carbohidrați sau cu un conținut ridicat de carbohidrați.

metabolismului

MATERIALE ȘI METODE

Declarație de etică

Experimentul a fost realizat în strictă conformitate cu cadrele legale ale UE referitoare la protecția animalelor utilizate în scopuri științifice (Directiva 2010/63/UE) și orientările legislației franceze care reglementează tratamentul etic al animalelor (decretul nr. 2001-464, 29 mai 2001). Acesta a fost aprobat de Direction Departementale des Services Veterinaires (Serviciile veterinare franceze) pentru efectuarea de experimente pe animale (INRA 2002–36, 14 aprilie 2002). Stația experimentală INRA este certificată pentru experimentare pe animale sub autorizația nr. A64.495.1 de către Serviciile veterinare franceze, autoritatea relevantă.

Dietele de pește

Două hrană experimentală pentru aluvinele de păstrăv curcubeu, adică no-CHO (dietă fără carbohidrați) și high-CHO (dietă cu carbohidrați foarte ridicați), au fost preparate în propriile instalații (INRA, Donzacq, Landes, Franța) sub formă de pelete extrudate. Glucoza și amidonul gelatinizat au fost incluse ca surse de carbohidrați; proteine ​​provenite din făină de pește și lipide alimentare din ulei de pește și făină de pește (Tabelul 1). Cele două diete au avut cantități similare de lipide. Creșterea mare a conținutului de carbohidrați din dietă (~ 60%) în dieta bogată în CHO a fost compensată de o proporție mai mică de proteine ​​(~ 20%). Nu s-au adăugat carbohidrați la dieta fără CHO, care conținea aproximativ 60% proteine ​​brute.

Formularea și compoziția apropiată a celor două diete experimentale (fără CHO și cu conținut ridicat de CHO)

Pește și design experimental

Analiza dietelor

Compoziția chimică a dietelor a fost analizată folosind următoarele proceduri: substanța uscată a fost analizată după uscare la 105 ° C timp de 24 de ore, conținutul de lipide a fost obținut prin extracție cu eter de petrol (Soxtherm), conținutul de proteine ​​(N × 6,25) a fost obținut prin Metoda Kjeldahl după digestia acidă, energia brută a fost măsurată într-un calorimetru cu bombă adiabatică (IKA, Heitersheim Gribheimer, Germania), iar conținutul de cenușă a fost măsurat prin incinerarea probelor într-un cuptor cu mufla timp de 6 ore la 600 ° C.

Analiza compoziției corpului a ovocitelor, embrionilor și alevinelor de hrănire endogene

Conținutul de glicogen și glucoză a fost analizat la 600 mg de pești în grup (ovocite, embrioni din stadiul 2 până în stadiul 23 și alevine de hrănire endogenă, stadiul 31). Conținutul de glicogen a fost determinat printr-o tehnică de hidroliză descrisă anterior de Good et al. (1933). Fiecare probă a fost măcinată în 1 mol l-1 HCI (VWR, SUA). O alicotă a fost salvată în această etapă pentru a măsura conținutul de glucoză liberă. După 10 min de centrifugare la 10.000 g, glucoza liberă a fost măsurată folosind trusa de cantitare a glucozei fluorimetrică Amplite ™ (AAT Bioquest ®, Inc., SUA) conform instrucțiunilor producătorului. Restul de țesut măcinat a fost fiert la 100 ° C timp de 2,5 ore și apoi neutralizat cu 5 mol l -1 KOH (VWR, SUA). PH-ul soluției a fost apoi ajustat la 7,4 și glucoza totală (glucoză liberă + glucoză obținută din hidroliza glicogenului) a fost măsurată folosind același kit ca înainte. Conținutul de glicogen a fost evaluat prin scăderea nivelului de glucoză liberă.

Conținutul total de lipide a fost determinat în duplicat prin metoda sulfofosfovanilun descrisă de Barnes și Blackstock (1973) utilizând un standard de ulei de pește (Sopropeche, Boulogne-sur-Mer, Franța) în loc de colesterol.

Conținutul total de proteine ​​a fost, de asemenea, măsurat în duplicat, utilizând metoda Kjeldahl ca și pentru analiza dietetică.

Analiza in silico

Genele ortologe pfkl și pklr din genomul păstrăvului curcubeu (Berthelot și colab., 2014) au fost identificate în browserul genomului Oncorhynchus mykiss (Genoscop: http://www.genoscope.cns.fr/trout/) extras din baza de date SIGENAE ( http://www.sigenae.org) folosind instrumentul BLAST (toate numerele de acces sunt date în Tabelul 2). Secvențele de la alte specii au fost colectate din baza de date Ensembl Genome (versiunea Ensembl 77, octombrie 2014: http://www.ensembl.org). Instrumentul de analiză a secvențelor din software-ul EMBL Pfam (http://pfam.xfam.org) a fost utilizat pentru a confirma identitățile secvenței. Software-ul Genomicus, v01.01 (http://www.genomicus.biologie.ens.fr/genomicus-trout-01.01/cgi-bin/search.pl) a fost utilizat pentru a confirma identitatea genelor pfkl.

Exemple de secvențe și numere de acces pentru analiza qPCR

Analiza filogenetică a pklr (Fig. 1) a fost efectuată utilizând pachetul MEGA software v6 (Tamura și colab., 2013), așa cum s-a descris anterior (Marandel și colab., 2015). Arborele filogenetic, bazat pe secvențe de aminoacizi deduse pe toată lungimea, a fost produs folosind metoda de îmbinare vecină (NJ) și confirmat prin metoda evoluției minime (datele nu sunt prezentate). Fiabilitatea arborilor deduși a fost estimată utilizând metoda bootstrap cu 1000 de replici. Pentru înrădăcinarea arborelui a fost utilizată secvența de proteine ​​Petromyzon marinus pk (Ensembl Accession ENSPMAP00000000233). Distanțele evolutive au fost calculate utilizând metoda de corecție Poisson (Zuckerkandl, 1965) și exprimate în unități ale numărului de substituții de aminoacizi pe sit. Analiza a implicat 10 secvențe de aminoacizi. Toate pozițiile care conțin goluri și date lipsă au fost eliminate, lăsând un total de 127 de poziții în setul de date final.

Analiza filogenetică a Pklr (piruvat kinază a ficatului și a globulelor roșii din sânge). Secvențele de aminoacizi deduse au fost aliniate utilizând software-ul MUSCLE (Edgar, 2004). Analiza filogenetică a fost efectuată utilizând software-ul Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) v6.0 (Tamura și colab., 2013). Arborele filogenetic a fost construit folosind metoda îmbinării vecine (NJ). Fiabilitatea arborelui dedus a fost estimată folosind metoda bootstrap cu 1000 de replicări. Secvența pklr de lamprea (Petromyzon marinus, Ensembl ID: ENSPMAP00000000233) a fost folosită pentru a înrădăcina copacul. Numerele de aderare la proteine ​​sunt date între paranteze.

Au fost alocate noi adnotări genetice în conformitate cu liniile directoare ale Nomenclaturii ZFIN (http://zfin.org/). Toate secvențele și aminoacizii parțiali deduși sunt date în Fig. S2.

Extracția totală de ARN și sinteza ADNc

Expresia genetică relativă a fost determinată prin RT-PCR cantitativă în timp real. Probele au fost omogenizate folosind Precellys® 24 (Bertin Technologies, Montigny-le-Bretonneux, Franța): (1) în tuburi de 7 ml conținând reactiv Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, SUA) și margele ceramice de 2,8 mm timp de 2 × 30 s, separate cu 15 s, la 5500 rpm pentru ovocite și embrioni (30 pe probă și pe spawn); și (2) în tuburi de 2 ml care conțin reactiv Trizol (Invitrogen) și margele ceramice de 2,8 mm timp de 2 × 20 s, separate cu 15 s, la 5500 rpm pentru alevine (1 alevină pe tub, 6 alevine pe spawn/dietă pentru amestec și hrană exogenă a peștilor). ARN de control al luciferazei (Promega), 10 pg pe 1,9 mg de embrion/alevină sau ovocit, a fost adăugat la fiecare probă pentru a permite normalizarea datelor în timpul dezvoltării timpurii, așa cum s-a descris anterior (Desvignes și colab., 2011; Marandel și colab., 2012) . ARN-ul total a fost apoi extras conform instrucțiunilor producătorului. ARN total (1 μg) a fost utilizat pentru sinteza ADNc. Trusa Super-Script III RNAse H-Reverse transcriptase (Invitrogen) a fost utilizată cu primeri aleatori (Promega, Charbonniéres, Franța) pentru a sintetiza ADNc.

RT-PCR în timp real

Activitatea generală a enzimei

analize statistice

Normalitatea distribuțiilor a fost evaluată folosind testul Shapiro-Wilk. Datele au fost apoi analizate de un test non-parametric Kruskal - Wallis urmat de un test Tukey ca analiză post hoc. Datele au fost analizate folosind software-ul R (v3.1.0)/Pachetul R Commander.

REZULTATE

Analiza in silico a păstrăvului curcubeu genele pfkl și pklr

Nu s-a găsit nicio genă ortologă pklr în genomul păstrăvului curcubeu (fie utilizând software-ul Genomicus, fie prin BLAST direct împotriva genomului păstrăvului curcubeu), dar un contig EST (Sigenae, AF246146.s.om.10) care are o omologie de secvență înaltă (aproximativ 75%) cu gene tklost pklr a fost identificată. O analiză filogenetică a fost efectuată pentru a-și confirma identitatea și acest lucru a arătat că contigul identificat a fost grupat cu ortologi pklr vertebrate (Fig. 1). Mai mult, analiza Pfam a confirmat că secvența păstrăvului a fost legată de o genă care codifică piruvat kinaza. În concluzie, analiza noastră in silico a identificat două gene pfkl paralogice în genomul păstrăvului curcubeu, una ortologă la pfkla de pește zebră (schela 7584) și cealaltă la pfklb de pește zebră (schela 8651, GSONMG00001975001) și o genă ortologă pklr (Sigenae, AF246146.s.om.10).

Analiza expresiei și activitatea enzimatică generală a produselor genetice legate de metabolismul glucozei în timpul dezvoltării embrionilor

PCR în timp real a fost efectuată pentru a determina expresia specifică etapei genelor legate de metabolismul glucozei păstrăvului curcubeu în timpul embriogenezei și în alevine eclozionate. Etapele au fost definite pe baza tabelului de dezvoltare Vernier (Vernier, 1969) și au ales să vizeze perioadele de interes de dezvoltare pentru studiul metabolismului glucozei [adică ovocit la stadiul 8, înainte de activarea genomului embrionar (EGA); etapa 10, EGA; etapele 12 și 15, perioada epiboliei; stadiul 22, ficat primitiv; stadiul 23, vena portală hepatică primitivă și stadiul 31, embrion eclozat/perioada de hrănire endogenă]. Această analiză a arătat (Fig. 2) că nivelurile de ARNm ale tuturor genelor metabolismului glucozei au crescut după EGA (stadiul 10) pentru a atinge un nivel maxim în etapele 22 și 23, cu excepția g6pcb1.b și g6pcb2.b, ale căror niveluri de ARNm au crescut până la etapa 31.

Exemplu de exprimare a genelor gluconeogene și glicolitice în timpul dezvoltării. Datele sunt abundența relativă a genelor gluconeogene (stânga) și glicolitice (dreapta) în timpul dezvoltării. Embrionii au fost eșantionați în conformitate cu Vernier (1969) în etapele O (ovocit), 2, 5, 6, 7, 8, 10, 12, 15, 22 și 23 și 31 (alevin). Pentru toate etapele, nivelul de expresie genică a fost normalizat prin abundența de ARN exogen de luciferază. Datele sunt exprimate ca mijloace ± s.e.m. (N = 3 bazine de embrioni, câte un bazin de 30 de embrioni per reproducere). Diferite litere indică diferențe semnificative între condiții (P Vizualizați acest tabel:

  • Vizualizați în linie
  • Vizualizați fereastra pop-up
  • Descărcați PowerPoint

Activitatea generală a enzimei

Compoziția corpului în timpul dezvoltării embrionilor

Pentru a urmări consumul relativ de macronutrienți în embrion și în rezervele de gălbenuș în timpul dezvoltării, au fost măsurate nivelurile de proteine, lipide și carbohidrați (adică glucoză și glicogen). Nu a fost observată nicio variație semnificativă statistic a nivelurilor de lipide sau proteine ​​în timpul dezvoltării (Tabelul 4). Deși conținutul global de carbohidrați al embrionilor (Tabelul 4, Fig. 3) nu a fost modificat în mod semnificativ în timpul dezvoltării, acesta a părut să scadă în etapele 22 și 23, la fel ca și conținutul de glicogen (Fig. 3).

Compoziția corporală a embrionilor și alevinelor eclozionate