Departamentul Endocrinol Metabol, Universitatea din Jiao Tong din Shanghai, Spitalul 6 al Poporului afiliat,

pioglitazona

Shanghai Diabetes Institute, Shanghai Key Laboratory of Diabetes Mellitus, Shanghai

Centrul Clinic pentru Diabet, 600 Yishan Road, Shanghai 200233 (China)

Tel. + 86-18930173636, Fax + 86-021-64701361, E-mail [email protected]

Articole similare pentru „”

  • Facebook
  • Stare de nervozitate
  • LinkedIn
  • E-mail

Abstract

Introducere

Tiazolidinedionele (TZDs) sunt o clasă de agenți farmacologici care ameliorează rezistența la insulină prin creșterea activității receptorului γ (PPARγ) activat de proliferator [9]. Activarea PPARγ îmbunătățește sensibilitatea la insulină prin promovarea stocării acizilor grași în adipocite, inhibarea producției de mediatori inflamatori și citokine și scăderea nivelului de glucoză din sânge [10,11]. Mai multe studii au arătat în mod clar că nivelurile serice ale adipokinei RBP4 sunt semnificativ reglate în jos prin tratamentul TZD la șoareci obezi și pacienți diabetici de tip 2 [12,13,14]. Cu toate acestea, rămâne neclar dacă țesutul adipos și/sau ficatul mediază suprimarea expresiei serice a RBP4 de către agoniștii PPARγ. Scopul prezentului studiu a fost de a aborda această întrebare prin examinarea reglementării RBP4 în ficat și țesutul adipos de către pioglitazonă, un agonist PPARγ care are efecte anti-diabetice.

Materiale și metode

Tratamentul animalelor

Test de toleranță la insulină (ITT)

ITT a fost efectuată la sfârșitul tratamentului cu pioglitazonă sau soluție salină de către un I.P. injectarea insulinei (Humulin R, Eli Lilly and Company, SUA) la 0,5 U/kg corp după post timp de 4 ore. Concentrația de glucoză din sânge a fost determinată cu sânge din vena cozii folosind un glucometru (Lifescan, Johnson-Johnson Medical (China) Ltd.). Nivelurile de glucoză din sânge au fost măsurate la 0, 15, 30, 60, 90 și 120 de minute după administrarea insulinei. Zona de sub curbele glicemiei (AUCITT) a fost calculată și utilizată pentru a estima sensibilitatea la insulină. AUCITT = (BG0 '+ BG120')/2 + BG15 '+ BG30' + BG60 '+ BG90'.

Test de toleranță orală la glucoză (OGTT)

Animalele au fost postite peste noapte (12-16 ore) la trei zile după ITT. Șobolanilor li s-au administrat 2 g/kg corp. de glucoză prin gavaj oral. Sângele a fost colectat din sinusul retro-orbital la 0, 30, 60 și 120 de minute după provocarea glucozei, iar nivelurile de glucoză și insulină au fost măsurate. Au fost calculate suprafețele de sub curbe pentru nivelurile de glucoză din sânge (AUCBG) și insulină (AUCINS). AUCBG = (BG0 '+ BG180')/2 + BG30 '+ BG60' + BG120 'și AUCINS = (INS0' + INS180 ')/2 + INS30' + INS60 '+ INS120'.

Biochimia sângelui

Parametrii biochimiei serice au fost măsurați la șobolani care au postit peste noapte, incluzând trigliceride, colesterol total, lipoproteină-colesterol de înaltă densitate (HDL-C), lipoproteină-colesterol de densitate mică (LDL-C), alanină aminotransferază (ALT), aspartat transaminază (AST )), gamma glutamil transpeptidaza (GGT) și glucoza plasmatică. Măsurătorile au fost efectuate pe un analizor paralel multicanal Glamour 2000 (MD Instruments, Muskegon, MI, SUA). Nivelurile serice de RBP4 și insulină au fost măsurate cu kituri ELISA relevante (Phoenix Biotech, Beijing, China și Millipore Corporation, Billerica, MA, respectiv). Coeficientul de variație inter-test a fost mai mic de 8% pentru RBP4 și 5% pentru insulină.

Cultura și diferențierea celulară

Preadipocitele 3T3-L1 (American Type Culture Collection, Manassas, VA, SUA)) au fost propagate și menținute în DMEM (Gibco, Grand Island, NY, SUA) conținând 10% (vol/vol) ser de vițel [13]. Pentru a induce diferențierea, preadipocitele post-confluente de 2 zile în faza G1 (desemnate ca ziua 0) au fost hrănite cu DMEM conținând 10% (vol/vol) ser fetal bovin (FBS, Gibco, Grand Island, NY, SUA), 1 μg/ml de insulină, 1 μM dexametazonă și 0,5 mM 3-izobutil-1-metilxantină (IBMX, Sigma Aldrich, St. Louis, MO, SUA) timp de două zile. Celulele au fost apoi cultivate în DMEM suplimentat cu 10% FBS și 1 μg/ml insulină timp de încă 2 zile, urmat de incubare cu DMEM conținând 10% FBS. Celulele HepG2 au fost cultivate în DMEM suplimentat cu 10% FBS și 100 μg/ml penicilină/streptomicină (Gibco, Grand Island, NY, SUA). Celulele 3T3-L1 au fost tratate cu pioglitazonă atunci când peste 90% din celule au dobândit fenotip adipos. Celulele de control au primit un volum egal de etanol. Celulele HepG2, la confluență de 70-80%, au fost tratate în mod similar după o înfometare de 24 de ore. Atât adipocitele, cât și hepatocitele au fost tratate cu pioglitazonă la o concentrație de 5, 10 sau 20 μM, iar celulele au fost apoi colectate pentru analiza expresiei proteinei RBP4 prin Western blot.

Transcriere inversă PCR (RT-PCR)

ARN-ul total a fost izolat din ficat și țesutul adipos subcutanat folosind TRIzol (Invitrogen, Carlbad, CA, SUA) și două μg de ARN total au fost transcrise invers în ADNc (Takara, Tokyo, Japonia). În fiecare reacție RT-PCR, 2 μl de ADNc a fost amplificat într-un volum final de 20 μl amestec de reacție PCR folosind amestecul master universal TaqMan PCR (Takara, Tokyo, Japonia). Probele au fost incubate în sistemul Perkin-Elmer PCR 9700 (Applied Biosystems, Foster, CA, SUA) pentru o denaturare inițială la 95 (C timp de 10 min, urmat de 35 de cicluri PCR, fiecare ciclu fiind format din 95 ° C timp de 30 s, 62 ° C pentru 30 s și 72 ° C pentru 40 s. Au fost utilizați următorii primeri: șobolan RBP4 (nr. De acces XM_215285.4) 5′- GACAAGGCTCGTTTCTCTGG -3 ′ (sens) și 5′- AAAGGAGGCTACACCCCAGT -3 ′ (antisens) și β-actină de șobolan (nr. De acces NM_007393.1. ) 5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC -3 ′ (sens) și 5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT -3 ′ (antisens). Specificitatea PCR a fost verificată în continuare prin supunerea produselor amplificate la electroforeză pe gel de agaroză pe baza mărimii preconizate a produsului. Nivelurile de ARNm ale RBP4 și PPARγ au fost normalizate la controlul intern al β-actinei.

Western blot

analize statistice

Toate analizele statistice au fost efectuate cu versiunea 13.0 SPSS (pachetul statistic pentru științele sociale, SPSS Inc., Chicago, IL). Rezultatele sunt exprimate ca mijloace ± SD sau SE. Analiza lui Student t-test sau ANOVA unidirecțional a fost utilizat pentru a identifica diferențe semnificative între diferite grupuri. Corelația Spearman a fost utilizată pentru a determina factorii principali care influențează RBP4 seric. Toate P-valorile sunt cu două cozi și a P-valoarea mai mică de 0,05 este considerată statistic semnificativă.

Rezultate

Pioglitazona reduce expresia RBP4, metabolismul glucozei și lipidelor la șobolanii obezi

Am explorat mai întâi dacă pioglitazona îmbunătățește metabolismul glucozei și lipidelor la șobolanii obezi hrăniți cu HFD. Șobolanii hrăniți cu HFD au arătat o creștere semnificativă a greutății corporale, a glicemiei în post, a insulinei și a profilurilor lipidice plasmatice, inclusiv colesterolul total, trigliceridele și LDL-C, și o scădere a HDL-C în comparație cu animalele de control alimentate cu diete normale (Tabelul 1) . Aceste modificări metabolice au fost readuse la niveluri normale printr-un tratament cu pioglitazonă de 4 săptămâni. În comparație cu grupul HFD-UT, grupul HFD-PT a obținut un semnificativ (P -1), AUCINS (2,37 ± 1,12 ng· min· ml -1) și AUCITT (15,95 ± 2,14 mmol· min· L -1) au fost toate scăzute în grupul HFD-PT (Fig. 1).

FIG. 1

Pioglitazona a îmbunătățit sensibilitatea la insulină la șobolanii obezi. Valorile prezentate sunt (A) glucoza din sânge și (B) insulina serică în timpul testului oral de toleranță la glucoză (OGTT) și (C) nivelurile de glucoză din sânge în timpul testului de toleranță la insulină (ITT). Datelor sunt prezentate media ± SD (n = 8). * P ** P ## P ** P * P