Bibliotecă NCBI. Un serviciu al Bibliotecii Naționale de Medicină, Institutele Naționale de Sănătate.

d-sintaza

Baza de date Madame Curie Bioscience [Internet]. Austin (TX): Landes Bioscience; 2000-2013.

Baza de date Bioscience Madame Curie [Internet].

Yoshihiro Urade, Naomi Eguchi și Osamu Hayaishi .

Autori

Afilieri

Introducere

figura 1

Calea biosintetică și metabolică a PGD2. cPLA2: fosfolipaza citosolică A2; TXA2: tromboxan A2.

Secvență de aminoacizi și structuri secundare și terțiare

ADNc pentru L-PGDS a fost mai întâi izolat dintr-o bibliotecă 10 de ADNc de creier de șobolan și ulterior din multe alte specii de mamifere, inclusiv omul 11 ​​și șoarecele, 12 și, de asemenea, de la 2 amfibieni. 13, 14 ADNc pentru L-PGDS codifică o proteină compusă din 189 și 190 de resturi de aminoacizi în șoareci și, respectiv, în enzima umană. Figura 2, prezintă alinierea secvenței enzimelor umane și șoarecilor. L-PGDS este modificat post-translațional prin scindarea unei peptide semnal hidrofobe N-terminale cuprinzând 24 și 22 de resturi de aminoacizi în șoarece și, respectiv, în enzima umană. Două situri de N-glicozilare la pozițiile Asn51 și Asn78 ale șoarecelor și ale enzimelor umane 10 sunt conservate în toate enzimele mamiferelor identificate până acum, dar nu au fost găsite în omologii amfibieni. L-PGDS de mamifere este puternic glicozilat cu 2 lanțuri de zahăr N-glicozilate, fiecare cu o greutate moleculară de 3.000. Structurile glucidice ale L-PGDS au fost determinate în probe purificate din lichidul cefalorahidian uman (LCR), 15 ser, 16 urină 16, 17 și lichid amniotic. 17 Cu toate acestea, rămâne de stabilit semnificația funcțională a lanțurilor de zahăr.

Figura 2

Alinierea secvenței L-PGDS umane și de șoarece. Site-ul de scindare al secvenței semnal (săgeți), reziduul catalitic de cisteină (stea), o cistină (cercuri deschise) și 2 site-uri de glicozilare (cercuri închise) ale L-PGDS sunt prezentate în partea de sus a secvenței. Poziții (mai multe.)

Proprietățile chimice și structurale ale proteinelor L-PGDS au fost analizate utilizând proteina recombinantă heterologă exprimată în E. coli sau drojdie. L-PGDS este o enzimă foarte stabilă și este extrem de rezistentă la tratamentul termic 1 și la digestia proteazei. 18 De exemplu, mai mult de 50% din activitate a fost reținută după încălzirea enzimei timp de 5 minute la 100 ° C și pH alcalin. 1 L-PGDS a fost aproape complet repliat prin diluarea și răcirea enzimei denaturate cu 1% SDS la 100 ° C timp de 10 min sau cu clorhidrat de guanidină 6 M. 19 Astfel, L-PGDS este o proteină interesantă pentru studiul replierii proteinelor.

Spectroscopia circulară cu dicroism a șobolanului L-PGDS recombinant a arătat că enzima este compusă în principal din catene β, 19 asemănătoare cu alte lipocaline. Am cristalizat deja șoarece L-PGDS recombinant. Cu toate acestea, calitatea datelor de difracție cu raze X obținute de la cristalele pregătite inițial au fost insuficiente pentru a determina coordonatele fiabile ale L-PGDS. Cel mai recent, modificând condițiile de cristalizare și folosind mutantul selenometionil Cys65Ala, 20 am determinat cu succes structura cristalografică cu raze X a L-PGDS cu 2 conformeri diferiți ai calicelor deschise și închise la rezoluția 2.1Å (Kumasaka T, Irikura D, Ago H, Aritake K, Yamamoto M, Miyano M, YU și OH, rezultate nepublicate). Analiza cristalografică cu raze X a dezvăluit că L-PGDS posedă o structură tipică a plicului de lipocalină, β-butoi. Cu toate acestea, L-PGDS conține 2 buzunare hidrofobe; unul este situsul catalitic corespunzător buzunarului de legare a ligandului altor lipocaline și celălalt, situsul de legare a ligandului lipofil, situat pe partea moleculei L-PGDS opusă celei care conține situsul de legare a retinoidului.

Proprietăți de legare a ligandului

Similar cu alte lipocaline, L-PGDS leagă retinoizii, 21 bilirubina și biliverdina 22 cu afinități mari (Kd = 30-80 nM). Prin monitorizarea stingerii fluorescenței intrinseci a triptofanului L-PGDS și prin spectroscopie circulară cu dicroism a liganzilor legați, am arătat că L-PGDS leagă acidul all-trans- sau 9-cis-retinoic și all-trans- sau 13-cis -retinaldehidă, dar nu tot-trans-retinol, la un raport molar de 1: 1 cu un Kd de 70 la 80 nM. 21 Afinitățile L-PGDS pentru retinoizi sunt comparabile sau puțin mai mari decât cele ale altor lipocaline care acționează ca transportori retinoizi extracelulari, cum ar fi β-lactoglobulina, proteina de legare a retinolului plasmatic și proteina de legare a acidului retinoic plasmatic (revizuită în alte capitole ). L-PGDS leagă, de asemenea, hormonul tiroidian cu un Kd de 0,7-2 μM și biliverdină și bilirubină cu afinități mari, adică cu un Kd de 30-40 nM. 22 Am descoperit recent că L-PGDS își leagă produsul PGD2 cu afinitate ridicată (Kd de 20 nM; Aritake K, YU; rezultate nepublicate), sugerând că L-PGDS acționează nu numai ca o enzimă producătoare de PGD2, ci și ca o extracelulară transportator de PGD2 pentru a preveni metabolismul și deshidratarea neenzimatică a acestuia.

Dintre acei liganzi hidrofobi nesubstrat, retinoizi, 21 bilirubină și biliverdină 22 au inhibat activitatea PGDS într-o manieră necompetitivă. Cu toate acestea, potențialele lor inhibitorii au fost remarcabil de slabe (IC50 = 4 ~ 10 μM), spre deosebire de afinitățile lor ridicate (Kd = 30-80 nM) de legare la L-PGDS, evaluate prin stingerea fluorescenței intrinseci a triptofanului. Prin urmare, situsul catalitic și situsul de legare pentru acei liganzi hidrofobi sunt considerați diferiți unul de celălalt. Pe de altă parte, am prezis că PGD2 este legat de buzunarul catalitic. Două buzunare distincte de legare au fost identificate în cele din urmă prin studiul cristalografic al L-PGDS de șoarece, așa cum este descris mai sus.

Prin urmare, propunem că L-PGDS este o proteină multifuncțională; acționează ca o enzimă producătoare de PGD2 prin cuplarea cu ciclooxigenaza-1 sau -2, enzimele din amonte în cascada PG, în interiorul celulelor și funcționează și ca proteină lipofilă de legare a ligandului după ce a fost secretată în spațiile extracelulare și în diferitele corpuri lichide. Așa cum este descris în paragraful următor, PGD2 este mai puțin stabil chimic decât PGE2 sau PGF2α, fiind deshidratat în seria J de PG-uri. Odată legat de L-PGDS, PGD2 este stabilizat remarcabil pentru a încetini conversia la PG-urile din seria J. Mai mult, afinitatea de legare a L-PGDS pentru PGD2 este ușor mai slabă decât acele afinități a 2 tipuri distincte de receptori PGD2, adică, tipul D al receptorilor prostanoizi (DP, DP1) și CRTH2 (DP2). Prin urmare, prezicem că L-PGDS leagă PGD2 instabil chimic, transportă PGD2 în spațiul extracelular către locurile de acțiune și transferă PGD2 către receptorii săi.

Proprietăți enzimatice ca PGD sintază

L-PGDS este prima lipocalină recunoscută ca enzimă. L-PGDS a fost inițial purificat din creierul de șobolan 1 ca PGD sintază (PGH2 D-izomerază, EC 5.3.99.2), care catalizează izomerizarea grupului 9,11-endoperoxid de PGH2, un precursor comun al diferitelor prostanoide, pentru a produce PGD2 cu grupări 9-hidroxi și 11-ceto în prezența compușilor sulfhidril. PGD2 este PG-ul principal produs în sistemul nervos central al diferitelor mamifere și este implicat în reglarea somnului 23, 24 și a nocicepției12 prin receptorii DP (DP1). 25, 26 PGD2 este, de asemenea, produs și secretat activ de mastocite, 18 bazofile și celule Th2 27 de H-PGDS evolutiv diferite, 6 - 8 acționând ca un mediator alergic și inflamator prin DP (DP1) 25, 28 și CRTH2 DP2 ) 29 de receptori într-o manieră autocrină și/sau paracrină.

Localizarea intracelulară a L-PGDS a fost investigată cel mai intens în creier. 30 - 32 Prin microscopie imunoelectronică, depozitele imunoreactive ale L-PGDS au fost observate în reticulul endoplasmic cu suprafață aspră, membrana nucleară externă, aparatul Golgi și veziculele secretoare ale celulelor oligodendrogliale 30 și celulelor trabeculare arahnoide la șobolanii adulți 31 și ai arahnoidului uman și celulele meningiomului. 32 Colocalizarea L-PGDS și a ciclooxigenazei, care produc PGH2, a fost demonstrată în practic toate celulele leptomeningelor, celulelor epiteliale ale plexului coroidian și celulelor microgliale perivasculare, sugerând că aceste celule sintetizează PGD2 activ. 31

Așa cum s-a menționat mai sus, PGD2 este chimic instabil și nonenzimic deshidratat pentru a produce seria J de PG-uri cu o structură ciclopentenonică, cum ar fi PGJ2, Δ 12 -PGJ2 și 15-deoxi-Δ 12, 14 -PGJ2, toate care arată activități farmacologice destul de diferite de cele din PGD2. Deoarece 15-deoxi-Δ 12, 14 -PGJ2 s-a demonstrat că acționează ca un ligand pentru PPARγ, un receptor nuclear implicat în diferențierea adipocitelor, macrofagelor și monocitelor, 33, 34 mulți cercetători au studiat posibila implicare a 15- deoxi -Δ 12, 14 -PGJ2 în diferitele tipuri de funcții fiziologice. Cu toate acestea, acele PG din seria J nu au fost detectate în probe fiziologice proaspete. Relevanța fiziologică a seriei J de PG este, așadar, puțin probabilă. 35 PGD2 este metabolizat și de 11-ceto PGD2 reductază (PGF2 sintază), aparținând familiei aldo-ceto reductazei, la 9α, 11β-PGF2, 36 - 38 un stereoizomer al PGF2α, având activități farmacologice diferite de cele ale PGF2α.

L-PGDS necesită compuși sulfhidril liberi, cum ar fi β-mercaptoetanol, DTT sau GSH, pentru reacția sa. Activitatea enzimatică este inhibată de modificatorii SeCl4 39 și SH, cum ar fi N-etilmaleimida și iodo acetoamida, indicând faptul că reziduul Cys este implicat în reacția catalitică a L-PGDS. 1 Trei reziduuri Cys, Cys65, Cys89 și Cys186, în L-PGDS uman, sunt conservate printre toate speciile. Două dintre aceste reziduuri Cys, Cys89 și Cys186, formează o punte disulfură, care este extrem de conservată printre majoritatea lipocalinelor, dar nu toate. Pe de altă parte, Cys65 este unic pentru L-PGDS, deoarece nu a fost găsit niciodată în alte lipocaline. Modificarea chimică și mutageneza direcționată către sit au arătat că reziduul Cys65 este reziduul cheie pentru reacția catalitică a L-PGDS. 20, 40 Astfel, se consideră că L-PGDS a evoluat de la o lipocalină nonenzimică ancestrală comună la enzimă prin achiziționarea unui reziduu activ, Cys65.

Inhibarea somnului prin administrarea centrală sau sistemică de Se 4+ a fost demonstrată la șobolanii în mișcare liberă 41, 42 și la ovinele fetale neanesteziate, 43 sugerând că PGD2 produs de L-PGDS joacă un rol important în inducerea și menținerea somnului.

Structura și reglarea genei

Gena pentru L-PGDS a fost donată din 12 surse de șobolani, 44 de oameni, 45 și șoareci și s-a arătat că acoperă aproximativ 3 kb și conține 7 exoni împărțiți cu 6 introni. Organizarea genei este remarcabil de analogă cu cea a altor lipocaline în ceea ce privește numărul și dimensiunea exonilor și faza de îmbinare a intronilor. 44, 45 Genele umane și ale șoarecilor au fost mapate la cromozomul 9q34.2-34.3 45 și respectiv 2B-C1, 46, ambele fiind localizate în grupul de gene lipocalinice.

Reglarea transcripțională a genei L-PGDS a fost studiată după stimularea cu diverși hormoni. De exemplu, hormonul tiroidian activează expresia L-PGDS printr-un element de răspuns al hormonului tiroidian în celulele TE671 derivate din creierul uman. 47 Dexametazona, un glucocorticoid sintetic, induce expresia L-PGDS prin intermediul receptorilor glucocorticoizi din celulele GT1-7 neuronale de șoarece. 48 17β-Estradiol reglează expresia genei L-PGDS într-un mod specific țesutului și regiunii. Activează expresia prin receptorii β estrogeni din inima șoarecelui 49 și crește expresia L-PGDS în nucleii arcuați și ventromediali ai hipotalamusului de șobolan, dar o scade în zona preoptică ventrolaterală a hipotalamusului, zonă care este un centru de somn . 50, 51

Expresia genei L-PGDS este reglată în jos prin legarea Hes-1, un omolog al mamiferelor Drosophila Hairy și intensificator al split, la cutia N a promotorului în celulele leptomeningeale primare cultivate la șobolani 52 și celulele TE671 umane. 53 Am demonstrat recent că expresia genei L-PGDS umană este activată prin semnalizarea protein kinazei C prin dezpresiune a semnalizării Notch-HES și îmbunătățirea funcției AP-2β în celulele TE671. 53 Stresul de forfecare fluid induce expresia genei L-PGDS în celulele endoteliale vasculare umane 54 prin legarea c-Fos și c-Jun la situsul de legare AP-1 al promotorului. 55

L-PGDS (β-Trace) ca marker clinic

L-PGDS este localizat în sistemul nervos central și în organele genitale masculine ale diferitelor mamifere 53, precum și în inima omului 54, iar localizarea celulară a L-PGDS a fost studiată pe larg în aceste țesuturi ale diferitelor mamifere. De exemplu, L-PGDS este localizat în mod predominant în leptomeningii, plexul coroid și oligodendrocitele șobolanului, șoarecelui și creierului uman 12, 30 - 32, 58 și este secretat în LCR. În testicul și epididimul oamenilor 59 și al altor mamifere, 60 - 68 L-PGDS este localizat în celulele Leydig, celulele Serotoli și celulele epiteliale ductale și este secretat din ele în plasma seminală. Printre diferitele țesuturi umane, inima exprimă cel mai intens ARNm L-PGDS. 57 În inima umană, L-PGDS este localizat în celulele miocardice și celulele endocardice atriale și cel mai interesant a fost detectat în celulele musculare netede (având fenotipul de sinteză) în intima arteriosclerotică și în placa aterosclerotică a arterelor coronare cu stenoză severă, fiind secretat de aceste celule în plasmă. 57

L-PGDS este aceeași proteină ca β-trace, 69, 70 care a fost descoperită inițial în 1961 ca fiind o proteină majoră a LCR 71 uman și identificată ulterior în plasma seminală, ser și urină. Prin urmare, concentrația de urme L-PGDS/β în fluidele corporale poate fi un marker clinic util pentru diferite boli. 7, 9 Concentrațiile urmei L-PGDS/β în plasma seminală, ser și urină au fost evaluate pe larg în ultimii ani ca biomarker pentru diagnosticul mai multor tulburări neurologice, 72 - 78 disfuncție a formării spermei, 59 și cardiovascular 57, 79 - 81 și boli renale 82 - 87. Concentrația serică a L-PGDS/β-trace prezintă o schimbare circadiană cu o creștere nocturnă, care este suprimată în timpul lipsei totale de somn, dar nu este afectată de lipsa somnului de mișcare rapidă a ochilor (REM). 88 Concentrația L-PGDS în secrețiile cervicovaginale a femeilor însărcinate cu membrane rupte a fost raportată a fi semnificativ mai mare decât cea a femeilor însărcinate normale. 89

Mai mult decât atât, reglarea în sus a expresiei genei L-PGDS a fost raportată la un șoareci model demielinizant genetic, de tip twitcher 90 și la pacienții cu scleroză multiplă, 91, 92 Tay-Sachs sau boala Sandohof. 93 Un singur polimorfism nucleotidic găsit în regiunea 3'-netradusă a genei L-PGDS umane (4111 A> C) s-a dovedit a fi asociat cu ateroscleroza carotidă la pacienții hipertensivi japonezi. 94 La aceștia, nivelurile serice ale colesterolului lipoproteic de înaltă densitate au fost mai mari la subiecții cu genotipul A/A decât la cei cu genotipul A/C sau C/C, iar grosimea maximă intima-media în artera carotidă comună a fost mai mică în grupul A/A decât în ​​grupurile A/C și C/C. Analiza RT-PCR în segmente de nefrone de șobolan microdisecate a arătat că mARN-ul L-PGDS este exprimat pe scară largă în cortex și în medula exterioară și, în principal, în membrul ascendent gros și în canalul colector. 95 Într-un model de șoarece de nefropatie indusă de adriamicină, sa demonstrat că excreția urinară de L-PGDS precede albuminuria evidentă. 96

Anomalii funcționale ale șoarecilor L-PGDS KO și L-PGDS-șoareci TG supraexprimați umani

Am generat șoareci L-PGDS KO cu mutația nulă prin recombinare omoloagă 12 și am demonstrat că șoarecii KO cresc normal, dar prezintă mai multe anomalii funcționale în reglarea nocicepției, a somnului 12, a 24, 97 și a metabolismului energetic. 98 șoareci L-PGDS KO nu prezintă alodinie (durere provocată de atingere), care este un fenomen tipic al durerii neuropatice, după o administrare intratecală de PGE2 sau bicuculină, un antagonist al receptorului acidului γ-aminobutiric (GABA). 12 Șoarecii KO nu acumulează PGD2 în creier în timpul lipsei de somn și nici nu prezintă revenirea somnului nonREM după lipsa somnului; întrucât șoarecii de tip sălbatic prezintă o creștere a conținutului de PGD2 din creier în timpul lipsei de somn, ceea ce induce revenirea somnului nonREM. 24, 97 L-PGDS șoareci KO devin intoleranți la glucoză și rezistenți la insulină într-o rată accelerată în comparație cu șoarecii de tip sălbatic. 98 Șoarecii KO posedă adipocite de dimensiuni mai mari decât șoarecii de tip sălbatic și dezvoltă nefropatie și o îngroșare aortică atunci când sunt hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi. 98

De asemenea, am generat șoareci TG 99 care au supra-exprimat L-PGDS uman sub controlul promotorului β-actinei. Am descoperit serendipit că acești șoareci TG au arătat o creștere tranzitorie a somnului nonREM după ce cozile lor au fost tăiate pentru prelevarea de ADN utilizate pentru analiza genetică. 97, 99 Am arătat că stimularea nocivă a tăierii cozii a indus o creștere remarcabilă a conținutului de PGD2 în creierul șoarecilor TG, dar nu și în cel al celor de tip sălbatic, 97, 99, deși nu înțelegem încă în detaliu mecanism responsabil de această creștere. Alternativ, într-un model de astm indus de ovalbumină, șoarecii TG au prezentat o producție de PGD2 remarcabil crescută în plămâni după provocarea antigenului și au dezvoltat inflamație pulmonară eozinofilă pronunțată și eliberare de citokine Th2 în comparație cu colegii lor de tip sălbatic. 100 Acești șoareci TG au prezentat, de asemenea, adipogeneza accelerată (Fujitani Y, Aritake K și Y.U., rezultate nepublicate). Prin urmare, șoarecii L-PGDS TG sunt utili ca model animal unic pentru a studia anomaliile funcționale cauzate de supraproducția PGD2.

Observații de închidere

Recent, L-PGDS administrat exogen s-a demonstrat că inhibă creșterea celulelor musculare netede vasculare obținute de la șobolani hipertensivi spontan, dar nu de la animalele de control normotensiv 80 și L-PGDS a fost, de asemenea, identificat ca țintă celulară a proteinei imediat-timpurii, BICP0, de herpesvirus bovin 1. 101 Cu toate acestea, mecanismele de acțiune ale L-PGDS care funcționează în aceste procese rămân a fi elucidate. Cel mai recent am determinat coordonatele tridimensionale ale L-PGDS complexate cu acid retinoic și, de asemenea, am găsit un inhibitor activ oral al L-PGDS. Aceste rezultate sunt utile pentru proiectarea inhibitorilor L-PGDS, care vor promova evaluarea farmacologică ulterioară a L-PGDS ca enzimă și transportator retinoid. Mai multe grupuri încearcă acum să identifice liganzi endogeni ai L-PGDS în diferite fluide corporale. Screeningul pentru anomalii funcționale ale șoarecilor manipulați de gena L-PGDS este încă în desfășurare prin cercetări colaborative cu multe grupuri.