Abstract

Analiza Northern blot pentru nivelurile de ARNm PDK2 și PDK4.

Extracția ARN și analiza Northern blot au fost efectuate așa cum s-a descris anterior (10). Pe scurt, ARN-ul total a fost extras din mușchii înghețați folosind Tri Reagent de la Centrul de Cercetare Moleculară (Cincinnati, OH) conform instrucțiunilor producătorului. Electroforeza a fost efectuată folosind 25 μg fiecare din preparatele totale de ARN într-un gel de denaturare de 1%. ARN-ul a fost apoi transferat capilar pe o membrană de nylon cu încărcare pozitivă (BrightStar-Plus; Ambion, Austin, TX). Sondele ADNc pentru PDK2 și PDK4 de șobolan au fost obținute prin RT-PCR utilizând un kit Advantage One Step RT-PCR de la Clontech (Palo Alto, CA) și următoarele exemple: PDK-4, 5′-CGTCGCCAGAATTAAAGCTC și 3′-CTGCCAGTTCTCTCTCTGAC și PDK -2, 5′-GTCAGCTAGGGGCCTTCTCT și 3′-CAGGACTATGCAGGCAGTGA. Sondele ADNc au fost marcate cu [32 P] dCTP (Perkin Elmer) folosind un kit de marcare ADN DECAprime (Ambion). Hibridizarea a fost efectuată la 42 ° C în soluție Ultrahyb (Ambion). Densitățile relative din autoradiografii au fost cuantificate folosind Bio-Rad Molecular Analyst. Pentru a controla încărcarea ARN, toate pete au fost cuantificate pentru gliceraldehidă-3-fosfat dehidrogenază prin utilizarea unei sonde incluse în kitul de etichetare ADN DECAprime (Ambion).

insulinei

Analiza Western blot pentru nivelurile de proteine ​​totale și fosforilate ale Akt și FOXO1.

Alte teste.

Glucoza plasmatică a fost analizată printr-o metodă de glucoză oxidază pe un Beckman Glucose Analyzer II (Beckman, Fullerton, CA). Insulina plasmatică a fost măsurată prin radioimunotest folosind un kit de la Linco Research (St. Charles, MO). FFA-urile plasmatice au fost măsurate folosind un kit colorimetric pe bază de acil-CoA oxidază (Wako Chemicals, Richmond, VA). Lactatul plasmatic a fost măsurat printr-o metodă lactat oxidază pe un analizor de lactat YSI (Yellow Springs Instruments, Yellow Springs, OH).

analize statistice.

Datele sunt exprimate ca mijloace ± SE. Semnificația diferențelor în valorile medii între diferitele grupuri de tratament a fost evaluată utilizând ANOVA unidirecțional, urmată de o analiză ad hoc folosind testul Tukey. Corelația Pearson a fost utilizată pentru a evalua corelația univariată. P 2 mmol/l (P 0,05). În plus, nivelul de ARNm PDK2 nu a fost modificat de perfuzia finală de insulină de 5 ore în toate cele trei grupuri de perfuzie (cu soluție salină, Intralipid și lactat) (P> 0,05). În schimb, nivelurile de mARN ale PDK4 au fost suprimate de insulină cu> 80% în grupul martor salin (discuție P). Rezultate similare au fost obținute la nivelul mușchiului solei (Fig. 3), care conține în principal fibre oxidative cu mișcare lentă (versus fibre cu mișcare rapidă în mușchiul gastrocnemius), sugerând că efectul insulinei asupra expresiei mARN-ului PDK4 și modificarea acestuia în stările rezistente la insulină sunt independent de tipul fibrei musculare.

Studiul nostru anterior (10) a demonstrat că o perfuzie de insulină de 5 ore a avut un efect profund (~ 72%) pentru scăderea nivelului de ARNm PDK4, dar efectul insulinei a fost doar modest (~ 21%) la nivelul proteinelor, sugerând că 5- h perioada de perfuzie cu insulină nu a fost un timp suficient pentru ca transcrierea scăzută a PDK4 să se reflecte pe deplin în nivelul proteinelor. În studiul de față, nu am determinat nivelul proteinei PDK4, deoarece detectarea unei modificări a efectului mic al insulinei asupra nivelului de proteină PDK4 ar fi practic imposibil sau ar necesita altfel un număr mare de experimente.

Efectele rezistenței acute la insulină asupra capacității insulinei de a crește fosforilarea Akt și FOXO1.

Studiile anterioare (1-3) sugerează că nivelul crescut de FFA circulant este responsabil pentru reglarea în sus a expresiei PDK4 în foamete și în diabetul experimental. FFA sunt un ligand endogen pentru PPAR-α (38,39), despre care se știe că induce expresia PDK4 musculară (6,35). Cu toate acestea, studiul nostru anterior (10) a demonstrat că modificările expresiei PDK4 care apar în timpul alimentării șobolanilor la post nu ar putea fi explicate prin modificări ale FFA plasmatice, deoarece suprimarea FFA plasmatică timp de 5 ore similar cu cele din timpul realimentării nu a avut niciun efect asupra expresiei ARNm PDK4 . În studiul de față, creșterea valorilor FFA plasmatice timp de 10 ore prin perfuzie intralipidă (în absența modificărilor insulinei plasmatice) nu a crescut nivelul de mARN al PDK4. De fapt, am observat o scădere cu 25% a nivelului de ARNm PDK4 la mușchii gastrocnemius cu perfuzia Intralipid. Astfel, aceste date ne întăresc sugestia că nivelul FFA plasmatic poate să nu joace un rol major în reglarea în sus a expresiei PDK4 în foamete și diabet (10). În plus față de PPARα, FFA stimulează PPARγ. S-a demonstrat că PPARγ antagonizează activitatea FOXO1 (40). Este de conceput că FFA-urile plasmatice crescute stimulează PPARγ și antagonizează legarea FOXO1 la promotorul PDK4, care poate fi responsabil pentru scăderea nivelului de mARN al PDK4 cu perfuzie intralipidă.

În prezentul studiu, rezistența la insulină a fost indusă acut prin perfuzie intralipidă sau lactat. Aceste modele de rezistență acută la insulină au fost bine caracterizate de noi (29,31,41) și de alții (36,42). Modificările GIR cu Intralipid sau lactat sunt similare cu cele raportate anterior (29,31). Studiile noastre anterioare (29,31,41) au demonstrat că aceste modificări se datorează în mare parte modificărilor absorbției de glucoză stimulată de insulină în mușchii scheletici. În plus, o infuzie de 5 ore de lactat (29) sau Intralipid (FNL, JHY, date nepublicate) in vivo, la doze identice cu cele din prezentul studiu, a scăzut activitatea de transport a glucozei stimulată de insulină, după cum a fost evaluată in vitro în mușchii în urma perfuziilor. Deoarece modificările căilor de semnalizare a insulinei în aceste modele de rezistență la insulină au fost bine documentate (29,42), în studiul de față am determinat doar fosforilarea Akt stimulată de insulină, care este direct legată de fosforilarea FOXO1. Modificările în fosforilarea Akt stimulată de insulină sunt similare cu cele descrise în studiile anterioare (29,42), care au demonstrat că aceste modificări au fost cauzate de stimularea insulinei afectată a PI3K, un eveniment din amonte.

Studii recente (23,24) au implicat FOXO1 în reglarea expresiei PDK4 de către insulină. Studiile efectuate pe celule cultivate au arătat că insulina și alți factori de creștere reglează activitățile factorilor de transcripție FOXO prin fosforilare prin calea PI3K-Akt (25). Astfel, factorii de transcripție FOXO se localizează în nucleu în stare bazală și, după stimularea cu factori de creștere, se fosforilează prin Akt, ducând la exportul nuclear și inhibarea transcripției dependente de FOXO (26). În prezentul studiu, am găsit o corelație pozitivă semnificativă între nivelurile de ARNm fosforilat (activ) FOXO1 și PDK4 și o corelație negativă semnificativă între fosforilarea Akt și nivelurile FOXO1 nefosforilate, sugerând că mecanismele de mai sus pentru reglarea insulinei a expresiei PDK4 prin Akt și fosforilarea FOXO1 operează în mușchiul scheletului de șobolan intact. Cu toate acestea, nu putem exclude posibilitatea ca mecanismele independente de FOXO1 să fie implicate și în reglarea insulinei a expresiei mARN-ului PDK4 (43). Studii recente (44,45) au sugerat un rol al coactivatorului PPARγ 1α în reglarea expresiei genei PDK4 prin mecanisme independente FOXO1. Rămâne de studiat dacă coactivatorul PPARγ 1α contribuie la reglarea acută a insulinei a expresiei genei PDK4.

În concluzie, rezultatele noastre demonstrează că capacitatea insulinei de a suprima expresia mARN-ului PDK4 în mușchiul scheletic, observată în studiul nostru anterior (10), a fost afectată în stările rezistente la insulină induse acut la șobolani cu perfuzie Intralipid sau lactat. Datele noastre indică, de asemenea, că această afectare a fost însoțită de stimularea insulinei afectată a fosforilării Akt și FOXO1, sugerând un rol major al acestor molecule în reglarea expresiei PDK4 de către insulină în mușchiul scheletic.