Laboratorul de afiliere pentru adaptarea fiziologică a animalelor, Institutul de sistematică și ecologie a animalelor, filiala siberiană, Academia Rusă de Științe, Novosibirsk, Rusia

parfumului

Laboratorul de afiliere a biochimiei acizilor nucleici, Institutul de biologie chimică și medicină fundamentală, filiala siberiană, Academia Rusă de Științe, Novosibirsk, Rusia

Departamentul de afiliere histologie, Institutul de traumatologie Novosibirsk, Novosibirsk, Rusia

Laboratorul de afiliere a biochimiei acizilor nucleici, Institutul de biologie chimică și medicină fundamentală, filiala siberiană, Academia Rusă de Științe, Novosibirsk, Rusia

Laboratorul de adaptare fiziologică a animalelor, Institutul de sistematică și ecologia animalelor, filiala siberiană, Academia rusă de științe, Novosibirsk, Rusia, Departamentul de resurse genetice animale, Institutul de citologie și genetică, filiala siberiană, Academia rusă de științe, Novosibirsk, Rusia

  • Ekaterina A. Litvinova,
  • Elena P. Goncharova,
  • Alla M. Zaydman,
  • Marina A. Zenkova,
  • Mihail P. Moshkin

Cifre

Abstract

fundal

Mirosul de la șoarecii receptivi funcționează ca un semnal, care stimulează șoarecii masculi să caute potențiali parteneri de împerechere. Acest comportament de căutare este cuplat cu riscul de infecție datorat adulmecării atât a mirosurilor parfumate, cât și a zonelor nazale și anogenitale ale femelelor, care adăpostesc bacterii și viruși. Luarea în considerare a evoluției gazdei sub presiuni parazitare inevitabile, inclusiv helminthes, bacterii, viruși etc., prezice adaptări care ajută la protejarea gazdelor împotriva paraziților asociați cu împerecherea.

Metode și constatări

Propunem că percepția semnalelor feminine de către șoareci masculi BALB/c duce la o redistribuire adaptivă a apărării imune direcționată către protecția împotriva riscurilor de infecție respiratorie. Rezultatele noastre demonstrează migrarea macrofagelor și neutrofilelor către căile respiratorii superioare la expunerea la stimuli de miros feminin, ceea ce duce la o rezistență crescută a bărbaților la infecția experimentală cu virusul gripal. Această intervenție moderată a leucocitelor nu a avut niciun efect negativ asupra performanței aerobe la șoareci masculi.

Concluzii

Datele noastre oferă prima demonstrație a răspunsului imunologic adaptiv la stimulii mirosului feminin prin inducerea răspunsurilor imune nespecifice în tractul respirator superior.

Citare: Litvinova EA, Goncharova EP, Zaydman AM, Zenkova MA, Moshkin MP (2010) Semnalele parfumului feminin îmbunătățesc rezistența șoarecilor masculi la gripă. PLOS ONE 5 (3): e9473. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0009473

Editor: Peter Sommer, Pasteur Institute Korea, Republica Coreea

Primit: 29 septembrie 2009; Admis: 7 februarie 2010; Publicat: 1 martie 2010

Finanțarea: Acest proiect a fost susținut de Fundația Rusă pentru Cercetare de Bază N 08-04-00406a (www.rfbr.ru) și Programul de Studii Interdisciplinare al Filialei Siberiene din RAS N 15, 94 (www.sbras.nsc.ru). Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Mirosul șoarecilor femele ca semnal pentru reproducere stimulează șoarecii masculi să caute un partener de reproducere [1] - [3]. La rândul său, comportamentul de căutare crește riscul de infecții respiratorii la șoareci masculi datorită adulmecării semnelor urinare și fecale contaminate, care adăpostesc mulți agenți de infecție [4] - [6]. Adulmecarea naso-nazală atunci când este localizat partenerul adaugă un risc de infecție cauzat de bacteriile și virusurile aeriene.

Pentru testarea ambelor predicții, am studiat șoarecii masculi păstrați cu sau fără mirosuri feminine. În aceste grupuri de șoareci, am evaluat recrutarea leucocitelor în căile respiratorii superioare prin examinarea histologică a țesutului pulmonar, am estimat rezistența la virusul gripal ca exemplu de infecție respiratorie și am măsurat MOC ca indicator al performanței aerobe. Am folosit virusul gripal A/WSN/33 (H1N1) adaptat la șoarece. Unele tulpini de virusuri gripale derivate de la om s-au reprodus eficient în plămânii de șoarece fără adaptare prealabilă a gazdei [17] - [18]. Gripa nu apare la populațiile sălbatice Mus musculus din cauza virulenței ridicate și a contagiozității scăzute [19] - [20].

Metode

Animale și condiții de adăpostire

Am obținut șoareci BALB/c consangvinizați de 8-10 săptămâni din stocul Institutului de Imunologie Clinică (Filiala Siberiană, Academia Rusă de Științe Medicale, Novosibirsk, Rusia). Toți șoarecii masculi (n = 106) și femele (n = 25) au fost găzduiți (4-6 săptămâni) în grupuri de un singur sex de cinci sau șase animale, cu excepția a 15 minute necesare pentru testarea performanței aerobe maxime. Am menținut grupurile masculine și feminine în cuști standard din plastic (35 × 21 × 9 cm) cu rumeguș (fulgi de lemn) ca material de cuibărit. Am furnizat pelete alimentare (BioPro, Novosibirsk) și apă ad libitum. Șoarecii au fost menținuți la 22-24 ° C sub un ciclu de lumină-întuneric 12-12 cu luminile stinse la 1400 ore.

În fiecare cușcă, masculii au fost marcați individual prin lovituri pe coadă făcute cu markeri chirurgicali ai pielii. La fiecare 5 zile, animalele erau plasate într-o cușcă curată cu rumeguș proaspăt. Șoarecii au fost folosiți în experimente în decurs de 2 săptămâni de la sosire. Am împărțit aleatoriu șoarecii masculi în două grupuri: bărbații expuși la parfum feminin (n = 52) și masculii izolați de semnalele chimice feminine (n = 54). Șoarecii femele și două grupuri de masculi au fost ținute în camere separate pentru animale, cu ventilație independentă.

Tratament de pat pentru femei

Așternutul (fulgi de lemn) din cuști cu femele BALB/c mature a fost folosit pentru expunerea masculilor la mirosurile feminine, deoarece este cel mai natural semnal sexual pentru șoareci. Folosind cinci cuști cu cinci femele pe cușcă, am colectat așternuturi feminine murdare în ultimele 5 zile, expunând masculii la o nouă porție (5 ml) de așternut femelă murdară în fiecare zi. Bărbații din tratamentul fără expunere la femei au primit un eșantion similar de așternut curat. Am adăugat porțiuni noi de așternut zilnic cu aproximativ 1 oră înainte de stingerea luminilor.

Conform recomandării lui Vandenberg [21], am furnizat șoarecilor femele 2-3 g de așternut murdar din cuști masculine pentru a-și regulariza ciclurile de estru. Examinarea frotiurilor vaginale la 2 săptămâni după tratamentul cu parfum a demonstrat că cel puțin 30% dintre șoarecii femele se aflau în est. Astfel, fiecare probă de așternut de 5 zile din cuștile feminine a fost contaminată cu urină și fecale de șoareci receptivi.

Infecția cu virusul gripal

Am utilizat șoareci masculi BALB/c în experiment ca una dintre tulpinile de șoarece consangvinizate cele mai susceptibile la virusul gripal A/WSN/33 (H1N1). Virusul a fost obținut din colecția Institutului de Virologie Ivanovsky (Academia Rusă de Științe Medicale, Moscova, Rusia). Virusul gripal uman A/WSN/33 (H1N1), care prezintă o modificare specifică a proteinei M1, provoacă pneumonie letală la șoarecii BALB/c [19]. Virusul a fost crescut în ouă de pui embrionare. Am recoltat lichid alantoic, conținând virusul și l-am depozitat în alicote la –80 ° C. Înainte de aplicare, stocul de virus (5 × 107 FFU (unități de formare a focalizării)/ml) a fost diluat în serie de zece ori cu soluție salină tamponată cu fosfat rece (PBS). Bărbații au fost infectați intranazal (sub anestezie cu eter) cu virusul gripal A/WSN/33 (H1N1) în 50 pl de PBS. Am folosit cinci doze diluate în serie care conțineau de la 2,5 × 10 1 la 2,5 × 105 FFU. Șoarecii au fost cântăriți la fiecare două zile timp de 10 zile după infectarea cu virusul gripal. Cazurile de mortalitate au fost înregistrate zilnic cu 1 oră înainte de stingerea luminilor în 3 săptămâni până la recuperarea completă a șoarecilor masculi supraviețuitori. Pentru o săptămână înainte de infecția experimentală și timp de 3 săptămâni după infecție, bărbații BALB/c au fost expuși fie la așternuturi murdare pentru femei (n = 41), fie la fulgi de lemn proaspeți (n = 41).

Agregate leucocitare în țesutul pulmonar

Am făcut preparate histologice ale țesutului pulmonar recoltate din grupurile suplimentare de șoareci masculi neinfectați care au fost fie expuși (n = 3), fie nu expuși (n = 5) la așternutul feminin în decurs de 1 săptămână. Probele de plămâni au fost fixate în formalină tamponată 10%. Secțiunile histologice (4 μm) ale probelor pulmonare au fost colorate cu hematoxilină și eozină (HE). Numărul agregatelor leucocitare, dimensiunea acestora și intensitatea semnalului în scara de gri au fost determinate în fiecare secțiune. Am calculat numărul de leucocite pe secțiune folosind o ecuație de regresie [22].

Performanță aerobă

Consumul maxim de oxigen a fost analizat la șoarecii masculi neinfectați, care au fost expuși fie la așternut de sex feminin (n = 8), fie la fulgi de lemn proaspătă (n = 8) în decurs de 1 săptămână înainte de măsurare. Șoarecii au fost expuși la HELOX (20% O2: 80% He) pentru a stimula metabolismul energetic [23]. În timpul acestui test, șoarecii masculi au fost ținuți singuri în cutii de respirometrie (volum, 0,5 L). Animalele au fost monitorizate într-un respirometru închis menținut la 10 ° C și aerate de o pompă cu circuit cu HELOX timp de 15 minute. NaOH uscat a fost utilizat pentru legarea CO2. În timpul fiecărui minut, cu excepția celor 5 și 10 minute necesare pentru alimentarea cu O2, circulația HELOX a fost oprită timp de 10 s pentru a măsura consumul curent de oxigen (VO2) printr-o scădere de presiune într-un manometru electronic. VO2 a fost ajustat la condiții standard (0 ° C, 1,01 × 106 Pa). Vârful individual al consumului de oxigen a fost considerat MOC.

Analize statistice

Diferențele în ratele mortalității între bărbații infectați tratați cu parfum și cei netratați au fost calculați utilizând un test chi-pătrat. Am folosit ANOVA bidirecțional pentru a determina influența parfumului feminin și doza de virus asupra pierderii maxime în greutate la șoarecii masculi infectați. LD50 a fost calculat conform Reed și Muench [24]. Pierderea maximă în greutate dependentă de doză a fost procesată prin testul diferenței mai puțin semnificative (LSD). Am folosit testele t Student pentru a compara LD50, pierderea maximă în greutate și MOC pentru cele două condiții de tratament. Diferențele în numărul de agregate leucocitare și număr de leucocite în țesutul pulmonar au fost evaluate printr-un test U Mann-Whitney. Am folosit măsuri repetate ANOVA pentru compararea dinamicii VO2 la bărbații tratați cu parfum și bărbații netratați în timpul expunerii lor la mediul HELOX. Toate datele sunt exprimate ca medie ± SE.

Declarație de etică

Toate animalele au fost manipulate în strictă conformitate cu buna practică a animalelor, astfel cum a fost definită de organismele naționale și/sau locale de bunăstare a animalelor, și toate manipulările cu animale au fost aprobate de comitetul corespunzător în conformitate cu „Liniile directoare pentru manipularea animalelor experimentale” (ordinea Prezidiul Academiei Ruse de Științe din 02 aprilie 1980 nr. 12000-496).

Rezultate

Rezistența la gripă

Scăderea masei corporale a depins de doza de virus gripal aplicat intranazal (F4.76 = 6.97, p 2 = 5.52, P = 0.019). Bărbații expuși la așternutul feminin au prezentat un LD50 mai mare decât bărbații izolați de femele (Fig. 2).

Șoareci masculi BALB/c neexpuși (coloane albe) și expuși (coloane negre) la așternutul feminin (medie ± SE). Literele majuscule marchează diferențe semnificative statistic ale mediilor la bărbații care nu sunt expuși la așternutul feminin și literele mici marchează diferențe semnificative statistic ale mediilor la bărbații expuși la așternutul feminin (test LSD, p Figura 2. Mortalitatea cumulată după infecția cu gripă.

Șoareci masculi BALB/c care nu sunt expuși (puncte albe) și expuși (puncte negre) la așternutul feminin (medie ± SE). LD50 la bărbații expuși la așternut pentru femei (4,73 ± 0,30 log FFU) a fost semnificativ mai mare în comparație cu bărbații izolați din așternut pentru femei (3,28 ± 0,35 log FFU, t = 2,84, p 0,05, test Mann-Whitney). Cu toate acestea, numărul agregatelor de leucocite și numărul mediu de leucocite pe agregat nu au diferit între cele două grupuri (Tabelul 1).

(A) Șoareci masculi BALB/c care nu sunt expuși la așternutul feminin. (B) Șoareci masculi BALB/c expuși la așternutul feminin. Microscopie cu lumină (măriri × 100 și × 200).

Performanță aerobă

MOC indus de frig nu a diferit între bărbații expuși (9,73 ± 0,39, n = 8) și nu expuși (9,00 ± 0,29, n = 8) la așternutul feminin (p> 0,05, testul t Student). Cu toate acestea, consumul de oxigen în timpul unei expuneri de 15 minute la HELOX a fost mai mare în orice moment al bărbaților tratați cu miros comparativ cu bărbații izolați de semnalele chimice feminine (Fig. 4). Măsurile repetate ANOVA au confirmat un efect semnificativ statistic al mirosurilor feminine asupra consumului de oxigen (F1,14 = 5,46, p = 0,035), precum și asupra punctelor de timp ale dinamicii consumului de oxigen (F12,168 = 41,34, p Figura 4. Performanța aerobă.

Consumul de oxigen în timpul expunerii de 15 minute la HELOX (medie ± SE) de către șoarecii masculi care nu sunt expuși (puncte albe) și expuși (puncte negre) la așternutul feminin (măsuri repetate ANOVA F1,14 = 5,46, p = 0,035) MOC a fost similar la bărbații expuși (n = 8, 9,73 ± 0,39) și nu expuși (n = 8, 9,00 ± 0,29) la așternutul feminin.

Discuţie

În plus față de inducția binecunoscută a reglării neuroendocrine a spermatogenezei și a comportamentului de împerechere prin semnale feminine [2], [3], [25], lucrarea noastră demonstrează că astfel de semnale joacă un rol în creșterea rezistenței la virusul gripal, care a fost utilizat ca agent patogen respirator disponibil. Acest efect dublu al mirosurilor feminine poate compensa riscul infecțiilor respiratorii, care însoțește comportamentul de căutare indus de feromoni și evaluarea olfactivă a unui partener de împerechere. Fenomenul este explicabil cauzal printr-o creștere a numărului de celule imunocompetente din țesutul pulmonar al șoarecilor masculi expuși la așternutul murdar feminin. În studiul nostru anterior, am găsit în mod semnificativ mai multe macrofage, neutrofile și eozinofile în fluidele de spălare pulmonară de la bărbații expuși la așternutul murdar feminin, comparativ cu bărbații menținuți fără expunere la semnale chimice masculine [10]. Atât neutrofilele, cât și macrofagele sunt efecte majore ale apărării imune nespecifice împotriva infecțiilor respiratorii [7], [8], [26], iar migrarea lor către căile respiratorii superioare crește rezistența la pneumonia experimentală [27]. Acest lucru poate ajuta la explicarea rezistenței sporite la gripă la șoarecii masculi observată după expunerea la așternuturile murdare pentru femei.

Nu am găsit studii speciale privind recrutarea leucocitelor induse de feromonii sexuali sau mecanismul neuroendocrin dependent de feromoni, cu excepția dovezilor experimentale ale scăderii parfumului sau testosteronului feminin a monocitelor circulante [10], [28] și a ipotezei cu privire la androgen. -realocarea indusă a apărării imune către piele și alte zone periferice [29]. De asemenea, nu putem respinge explicațiile neferomonale ale recrutării leucocitelor către căile respiratorii superioare, cum ar fi efectul componentelor bacteriene inhalate din așternutul murdar contaminat în timpul mirosului. Indiferent, așternutul contaminat cu bacterii este o componentă semnificativă a semnalelor sexuale naturale la șoareci. În plus, unii compuși bacterieni sunt recunoscuți de receptorii formil peptidici (FPR) în epiteliul olfactiv vomeronazal [30]. În studiul nostru, am ținut masculii în grupuri de un singur sex și puteau adulmeca așternuturile murdare de alți bărbați; cu toate acestea, componentele feromonale și bacteriene ale acestui așternut nu și-au crescut rezistența la virusul gripal la nivelul pe care l-am observat la bărbații expuși la mirosurile feminine.

Migrația leucocitelor către țesutul pulmonar este o manifestare obișnuită a inflamației tractului respirator, ceea ce implică o scădere a eficienței atât a ventilației pulmonare, cât și a performanței aerobe [31], [32]. Cu toate acestea, dimensiunile agregatelor leucocitare din studiul nostru au variat de la 11 la 1029 celule per agregat, ceea ce este considerabil mai mic decât cel raportat pentru o infiltrare inflamatorie tipică [33], [34]. O evaluare directă a rezervelor funcționale ale sistemului cardiorespirator a arătat că, spre deosebire de efectul respirator negativ prezis al migrației leucocitelor în plămâni, masculii tratați cu parfum au demonstrat un VO2 mai mare la răcire în HELOX decât bărbații izolați de semnalele chimice feminine. Cu toate acestea, performanța aerobă maximă a fost similară în ambele grupuri mici.

Astfel, datele noastre sunt primele care demonstrează migrarea leucocitelor ca răspuns la semnalele olfactive legate de împerechere. Aceasta prevede o adaptare anticipativă a șoarecilor masculi la riscurile potențiale de infecții respiratorii și, în același timp, nu reduce performanța lor aerobă.

Mulțumiri

Prima versiune a acestui manuscris a fost îmbunătățită considerabil de către Prof. J. Burns (Bethany College, SUA). Mulțumim prof. M. Ferkin, D. Penn și Dr. S. Zala pentru comentarii utile. Recunoașterea noastră specială se adresează prof. Lee Drickamer, care a examinat și corectat versiunea finală a manuscrisului.

Contribuțiile autorului

Conceput și proiectat experimentele: EAL MAZ MPM. A efectuat experimentele: EAL EPG AMZ. Analiza datelor: EAL MPM. Reactivi/materiale/instrumente de analiză contribuite: EPG AMZ MAZ. Am scris lucrarea: EAL MPM.