Linda B. Moore

Departamente de * Endocrinologie moleculară, † Schimb tehnologic strategic și ‡ Chimie medicinală, Glaxo Wellcome Research and Development, 5 Moore Drive, Research Triangle Park, NC 27709

Bryan Goodwin

Departamente de * Endocrinologie moleculară, † Schimb tehnologic strategic și ‡ Chimie medicinală, Glaxo Wellcome Research and Development, 5 Moore Drive, Research Triangle Park, NC 27709

Stacey A. Jones

Departamente de * Endocrinologie moleculară, † Schimb tehnologic strategic și ‡ Chimie medicinală, Glaxo Wellcome Research and Development, 5 Moore Drive, Research Triangle Park, NC 27709

Domnul Bruce Wisely

Departamente de * Endocrinologie moleculară, † Schimb tehnologic strategic și ‡ Chimie medicinală, Glaxo Wellcome Research and Development, 5 Moore Drive, Research Triangle Park, NC 27709

Cosette J. Serabjit-Singh

Departamente de * Endocrinologie moleculară, † Schimb tehnologic strategic și ‡ Chimie medicinală, Glaxo Wellcome Research and Development, 5 Moore Drive, Research Triangle Park, NC 27709

Timothy M. Willson

Departamente de * Endocrinologie moleculară, † Schimb tehnologic strategic și ‡ Chimie medicinală, Glaxo Wellcome Research and Development, 5 Moore Drive, Research Triangle Park, NC 27709

Jon L. Collins

Departamente de * Endocrinologie moleculară, † Schimb tehnologic strategic și ‡ Chimie medicinală, Glaxo Wellcome Research and Development, 5 Moore Drive, Research Triangle Park, NC 27709

Steven A. Kliewer

Departamente de * Endocrinologie moleculară, † Schimb tehnologic strategic și ‡ Chimie medicinală, Glaxo Wellcome Research and Development, 5 Moore Drive, Research Triangle Park, NC 27709

Abstract

Sf. Sunătoarea (Hypericum perforatum) este un remediu pe bază de plante utilizat pe scară largă pentru tratamentul depresiei. Studii clinice recente demonstrează că extractele de hiperic cresc metabolismul diferitelor medicamente, inclusiv contraceptive orale combinate, ciclosporină și indinavir. În acest raport, arătăm că hiperforina, un element constitutiv al St. Sunătoarea cu activitate antidepresivă este un ligand puternic (Ki = 27 nM) pentru receptorul pregnanei X, un receptor nuclear orfan care reglează expresia citocromului P450 (CYP) 3A4 monooxigenază. Tratamentul hepatocitelor umane primare cu extracte de hypericum sau hiperforină are ca rezultat o inducere marcată a expresiei CYP3A4. Deoarece CYP3A4 este implicat în metabolismul oxidativ al> 50% din toate medicamentele, descoperirile noastre oferă un mecanism molecular pentru interacțiunea St. Sunătoarea cu medicamente și sugerează că extractele de hiperic pot interacționa cu multe mai multe medicamente decât au fost realizate anterior.

Sf. Sunătoarea este un remediu antic pe bază de plante care a câștigat popularitate pe scară largă ca „Prozac al naturii”. Mai multe studii clinice oferă dovezi că St. Sunătoarea este la fel de eficientă ca antidepresivele convenționale, sintetice (1-3). Extractele de Hypericum sunt active în mai multe modele comportamentale de depresie și inhibă absorbția serotoninei, dopaminei, noradrenalinei și acidului γ-aminobutiric în sinapsele rozătoarelor (4-8). Sf. Sunătoarea este un amestec complex de peste două duzini de constituenți. Dovezi recente indică faptul că derivatul acilfloroglucinolului hiperforină este responsabil pentru o mare parte din activitatea antidepresivă a plantei. Hiperforina inhibă recaptarea neurotransmițătorilor în sinapse (6-8). Mai mult, efectele clinice ale St. Sunătoarea despre depresie se corelează cu conținutul său de hiperforină (9).

Ca remediu pe bază de plante, St. Sunătoarea nu a fost supusă testării clinice riguroase a candidaților moderni la medicamente. Mai multe rapoarte recente oferă dovezi că St. Sunătoarea promovează metabolismul medicamentelor administrate concomitent, inclusiv inhibitorul proteazei HIV indinavir, ciclosporina imunosupresoare și contraceptivele orale (10-14). Deoarece fiecare dintre aceste medicamente este metabolizat de citocromul P450 (CYP) 3A4, o monooxigenază implicată în metabolismul multor xenobiotice, aceste descoperiri au sugerat că St. Sunătoarea ar putea induce expresia CYP3A4. Se știe că transcrierea CYP3A4 este indusă de o serie de xenobiotice, inclusiv medicamente precum antibioticul rifampicină, clotrimazolul antimicotic, troglitazona sensibilizantă la insulină și fenobarbitalul barbituric (15, 16). Creșterile expresiei CYP3A4 reprezintă baza pentru o serie de interacțiuni medicamentoase stabilite (15).

Noi și alții am descris recent un nou membru al familiei receptorilor de hormoni steroizi/tiroidieni, denumit receptorul pregnane X (PXR), care servește ca un regulator cheie al transcripției CYP3A4 (17-21). PXR se leagă de promotorul CYP3A4 și este activat de gama de xenobiotice cunoscute pentru a induce expresia CYP3A4. În acest raport, arătăm că St. Sunătoarea activează PXR și induce expresia CYP3A4 în hepatocitele umane. Mai mult, am identificat hiperforina ca fiind componenta St. Sunătoarea responsabilă de activarea PXR. Datele noastre demonstrează că PXR poate fi activat de produsele vegetale și sugerează că St. Sunătoarea trebuie utilizată cu precauție de pacienții care iau medicamente metabolizate de CYP3A4.

Metode

Reactivi și St. Pregătirea extractului de sunătoare.

Preparate comerciale cu capsule de St. Sunătoarea a fost obținută din Nature's Way Products (Springville, UT; 300 mg); Nature's Plus (Melville, NY; 300 mg); și Nutraceutical (pentru Solaray, Park City, UT; 900 mg). Conținutul capsulei a fost transferat în flacoane de sticlă chihlimbar și extras cu 1 ml alcool etilic absolut (Aaper Alcohol and Chemical, Shelbyville, KY) prin agitare ușoară timp de 30 de minute. Extractele au fost centrifugate la 300 × g timp de 5 minute, iar stratul de alcool a fost transferat într-un tub curat de centrifugă și recentrifugat la 425 × g timp de 30 de minute. Extractele de etanol au fost decantate și depozitate în flacoane de sticlă chihlimbar la -20 ° C. Produsele chimice și sursele acestora sunt următoarele: hiperforină (Apin Chemicals Limited, Abingdon, Oxon, Marea Britanie); amentoflavonă și isoquercitrin (Indofine Chemical Company, Belle Mead, NJ); hiperozidă (Research Plus, Bayonne, NJ); kaempferol, luteolin, myricetin, quercetin, quercitrin, rifampicin, β-sitosterol (din soia), scopoletin și umbelliferonă (Sigma); rutină (Acros Organics, filială a Fisher Scientific); hipericină și pseudohipericină (Calbiochem); iar SR12813 a fost sintetizat în casă. Datorită sensibilității multor componente ale sunătoarei la lumină, extracțiile de etanol și prepararea și diluarea compușilor s-au făcut în întuneric sau în lumină redusă.

Analize de transfecție.

Experimentele de transfecție tranzitorie și testele de cloramfenicol acetiltransferază (CAT) au fost efectuate într-un format cu 96 de godeuri cu plasmida de expresie pSG5-hPXR și (CYP3A1) 2-tk-CAT reporter așa cum s-a descris anterior (21).

Competiție Ligand Testele de legare.

Testele de legare a competiției de proximitate a scintilației au fost efectuate cu domeniul purificat de legare a ligandului PXR uman și [3 H] SR12813 așa cum s-a descris anterior (21).

Cultura primară a hepatocitelor umane și analiza Northern Blot.

Hepatocitele umane primare au fost obținute de la Steve Strom (Universitatea din Pittsburgh). Celulele au fost cultivate în plăci cu șase godeuri acoperite cu Matrigel în mediu E fără Williams (Life Technologies, Rockville, MD) suplimentat cu dexametazonă 100 nM și insulină-transferină-seleniu (ITS-G; Life Technologies). La 48 de ore după izolare, hepatocitele au fost tratate cu extracte de etanol brut de St. Sunătoare, rifampicină (10 μM) sau hiperforină (1 μM), care au fost adăugate la mediul de cultură sub forma a 1000 × stocuri fie în etanol, fie în dimetil sulfoxid. Culturile de control au primit vehicul singur. Celulele au fost cultivate încă 30 de ore înainte de recoltare, iar ARN-ul total a fost izolat utilizând un reactiv disponibil comercial (Trizol; Life Technologies) conform instrucțiunilor producătorului. ARN total (10 μg) a fost rezolvat pe un gel de denaturare a agarozei 1%/2,2 M formaldehidă și transferat la o membrană de nailon (Hybond N +; Amersham Pharmacia). Bloturile au fost hibridizate secvențial cu 32 CYP3A4 marcate cu P [bazele 790 până la 1.322 din secvența publicată de ADNc (nr. Acces GenBank> M18907)] și sondele ADNc β-actină (CLONTECH).

Rezultate

Pentru că se acumulează dovezi că St. Sunătoarea interacționează cu o varietate de medicamente, am folosit un test standard de reporter bazat pe celule pentru a investiga dacă extractele de hiperic ar activa receptorul nuclear orfan PXR, un regulator transcripțional cheie al CYP3A4. Celulele CV-1 au fost cotransfectate cu un vector de expresie pentru PXR uman și o plasmidă reporter conținând două copii ale unui situs de legare CYP3A PXR în amonte de promotorul timidin kinazei și gena CAT. Trei preparate comerciale diferite ale St. Sunătoarea a fost extrasă cu etanol, iar extractele au fost utilizate pentru a trata celulele transfectate. Diluțiile seriale au fost testate mai întâi, deoarece fiecare extract a fost toxic pentru celule la concentrații mai mari (datele nu sunt prezentate). Toate cele trei extracte la diluție optimă au dus la activarea PXR comparabilă cu cea realizată cu rifampicina, un activator stabilit al expresiei PXR și CYP3A4 (Fig. (Fig. 1 1 A).

prin

Hiperforina este un puternic activator al PXR. (A) Celulele CV-1 au fost transfectate cu plasmide de expresie pentru PXR uman și reporterul (CYP3A1) 2-tk-CAT. Celulele au fost tratate cu extracte preparate din trei preparate comerciale diferite de St. Sunătoare [extract 1, Nature's Way (9 μg/ml); extract 2, Nature's Plus (75 μg/ml); extract 3, Solaray (7 μg/ml)] sau cu 10 μM din compușii puri indicați, cu excepția hiperforinei, care a fost testată la 1 μM. Hiperforina a fost toxică pentru celule la concentrații> 1 μM. Extractele celulare au fost ulterior testate pentru activitatea CAT. Datele reprezintă media testelor efectuate în cvadruplicat ± SE și sunt reprezentate grafic ca activare de mai multe ori în raport cu celulele transfectate tratate numai cu vehicul. (B) Structura chimică a hiperforinei. (C) Celulele CV-1 au fost transfectate ca în A și tratate cu concentrații crescânde de hiperforină (pătrate) sau rifampicină (cercuri). Punctele de date reprezintă media testelor efectuate în triplicat.

Extractele de Hypericum conțin peste două duzini de constituenți bioactivi, inclusiv naftodiantroni, flavonoizi, floroglucinoli, proantocianidine și tanini. Am testat o serie de componente izolate ale extractelor de hypericum pentru activitate în testul de transfecție PXR. Majoritatea acestor compuși au avut o activitate PXR mică sau deloc (Fig. 1 Fig. A). În special, hiperforina (Fig. 1 B), care are activitate antidepresivă, a fost un activator eficient al PXR (Fig. (Fig.1 1 A). Analiza completă a dozei - răspuns a arătat că hiperforina a activat PXR cu o concentrație efectivă jumătate maximă (EC50) de 23 nM (Fig. (Fig.1 1 C). Astfel, hiperforina este cea mai puternică Activatorul PXR trebuie raportat până în prezent. Concentrațiile de hiperforină necesare pentru activarea PXR sunt mult sub cele obținute la om: Nivelurile plasmatice ale vârfului de hiperforină la ~ 380 nM la persoanele care iau regimul standard de sunătoare (3 × 300) mg zilnic), cu niveluri plasmatice stabile de echilibru estimate la ~ 200 nM (22). Astfel, este probabil ca sunătoarea să activeze PXR la om.

Am testat apoi dacă hiperforina îi mediază efectele prin legarea directă la PXR. Un test stabilit de legare a competiției de proximitate a scintilației a fost utilizat cu domeniul de legare purificat al ligandului PXR și radioligandul PXR cu afinitate ridicată [3 H] SR12813 (21). Hiperforina a concurat eficient cu [3 H] SR12813 pentru legarea la PXR cu o concentrație inhibitoare jumătate maximă (IC50) de 27 nM (Fig. (Fig.2). 2). Aceste date sunt în acord cu rezultatele testului de transfecție tranzitorie (Fig. 1 Fig. C. Umbelliferone, o componentă a sunătoarei care are doar activitate slabă în testul de activare PXR (Fig. Fig. 1 1 A), a concurat doar slab pentru legarea radioligandului la PXR (Fig. (Fig.2). 2). Aceste date stabilesc hiperforina ca un ligand PXR cu afinitate ridicată.

Hiperforina se leagă de PXR cu afinitate ridicată. Testele de legare a competiției au fost efectuate cu PXR LBD uman purificat și 10 nM de radioligand PXR cu afinitate ridicată [3 H] SR12813 în prezența concentrațiilor indicate de hiperforină (pătrate), SR12813 (cercuri) sau umbelliferonă (triunghiuri). Fiecare punct de date reprezintă media testelor efectuate în triplicat. Valoarea Ki a hiperforinei a fost calculată la 27 nM prin analiza de regresie neliniară.

Deoarece PXR reglează expresia CYP3A4, am examinat dacă extractele de hypericum și hiperforina ar induce expresia CYP3A4 în celulele hepatice. Hepatocitele umane primare au fost tratate cu fiecare dintre cele trei St. Extractele de sunătoare sau cu hiperforină și ARN total au fost preparate din celule și analizate prin analiza Northern blot. După cum s-a prezis prin testul de activare PXR, fiecare dintre tratamente a dus la o creștere semnificativă a nivelurilor de ARNm CYP3A4 (Fig. (Fig.3). 3). Hiperforina este un compus labil, care poate explica eficacitatea sa redusă față de rifampicină. Aceste date demonstrează că St. Sunătoarea induce expresia CYP3A4 în hepatocite și că hiperforina este responsabilă pentru o mare parte, dacă nu pentru toate, a acestei activități.

Sf. Extractele de sunătoare și hiperforina induc expresia CYP3A4 în hepatocitele umane. Analiza Northern blot a fost efectuată cu ARN total (10 μg) preparat din culturi primare de hepatocite umane tratate timp de 30 de ore cu extracte preparate din trei preparate comerciale diferite de St. Sunătoare [extract 1, Nature's Way (9 μg/ml); extract 2, Nature's Plus (75 μg/ml); extract 3, Solaray (7 μg/ml)], 1 μM hiperforină sau vehicul singur (0,1% etanol). Blotul a fost testat secvențial cu 32 de fragmente marcate cu P de CYP3A4 și β-actină.

Concluzii

Mulțumiri

Mulțumim Dr. Steve Strom și Kelli Plunket pentru asistență cu hepatocitele umane primare și Jennifer Lorenz pentru asistență cu testele de transfecție.