Laura J den Hartigh

1 Divizia Metabolism, Endocrinologie și Nutriție, Departamentul de Medicină, Facultatea de Medicină a Universității din Washington, Seattle, WA

care

Zhan Gao

2 Departamentul de Medicină, Școala de Medicină a Universității din New York, New York, NY

Leela Goodspeed

1 Divizia Metabolism, Endocrinologie și Nutriție, Departamentul de Medicină, Facultatea de Medicină a Universității din Washington, Seattle, WA

Shari Wang

1 Divizia Metabolism, Endocrinologie și Nutriție, Departamentul de Medicină, Facultatea de Medicină a Universității din Washington, Seattle, WA

Arun K Das

3 Departamentul de Medicină Internă, Universitatea din Michigan, Ann Arbor, MI

Charles F Burant

3 Departamentul de Medicină Internă, Universitatea din Michigan, Ann Arbor, MI

Alan Chait

1 Divizia Metabolism, Endocrinologie și Nutriție, Departamentul de Medicină, Facultatea de Medicină a Universității din Washington, Seattle, WA

Martin J Blaser

2 Departamentul de Medicină, Școala de Medicină a Universității New York, New York, NY

Date asociate

Abstract

fundal

trans-10, cis-12 Acidul linoleic conjugat (t10, c12-CLA) este un supliment alimentar care promovează pierderea în greutate prin creșterea oxidării grăsimilor și a consumului de energie. Am raportat anterior că, în absența t10, c12-CLA, șoarecii forțați să piardă greutatea corporală echivalentă prin restricție alimentară (FR) nu prezintă creșteri ale oxidării grăsimilor sau ale cheltuielilor energetice, ci au îmbunătățit metabolismul glucozei, în concordanță cu FR ca un metoda de slăbit.

Obiectiv

Deoarece dieta este un factor determinant principal al populațiilor bacteriene intestinale, am emis ipoteza că efectele metabolice disparate care însoțesc pierderea în greutate de la t10, c12-CLA sau FR ar putea fi legate de alterarea microbiotei intestinale.

Metode

Șoarecii masculi cu deficit de receptor LDL (Ldlr -/-) în vârstă de zece săptămâni au fost hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi, bogată în zaharoză (HFHS; 36% grăsime de untură, 36,2% zaharoză + 0,15% colesterol) timp de 12 săptămâni (linia de bază), apoi a trecut doar la dieta HFHS (control obez), HFHS + 1% c9, t11-CLA (control acid gras obez), HFHS + 1% t10, c12-CLA (acid gras care induce pierderea în greutate) sau HFHS + FR (grup de control al pierderii în greutate cu aport alimentar HFHS de 75-85% ad libitum) pentru încă 8 săptămâni. Au fost cuantificate conținutul microbian fecal, acizii grași cu lanț scurt (butirat, acetat), concentrațiile de CLA tisulare și expresia transportorului de nutrienți intestinali.

Rezultate

Șoarecii hrăniți cu t10, c12-CLA sau atribuiți FR au pierdut 14,5% din greutatea corporală inițială. Șoarecii hrăniți cu t10, c12-CLA au avut concentrații crescute de butirat fecal (de 2 ori) și acetat de plasmă (de 1,5 ori) comparativ cu martorii alimentați cu HFHS. Diversitatea α fecală a scăzut cu 7,6-14% în toate grupurile. Butyrivibrio și Roseburia, microbi producători de butirat, au fost îmbogățiți în timp cu t10, c12-CLA. Prin compararea cu fiecare grup de control, am identificat, de asemenea, genuri bacteriene îmbogățite semnificativ în receptorii t10, c12-CLA, inclusiv Lactobacillus, Actinobacteria și noul Ileibacterium valens din genul Allobaculum, în timp ce alte taxe au fost îmbogățite de FR, inclusiv Clostridiales și Bacteroides.

Concluzie

Modalitățile care duc la pierderea în greutate echivalentă, dar cu efecte metabolice divergente sunt asociate cu diferențe compoziționale în microbiota intestinală a șoarecelui.

Introducere

Este din ce în ce mai recunoscut faptul că o microbiotă intestinală modificată poate contribui la obezitate (8-10), potențial prin modificarea metabolismului energiei gazdei (11-13). Microbiota intestinală a animalelor obeze prezintă o capacitate crescută de recoltare a energiei din dieta gazdei, cu absorbție parțială de către gazdă; atunci când este transplantată în șoareci fără germeni, astfel de microbiote pot promova adipozitatea sporită (14). Alte mecanisme potențiale prin care microbii intestinali ar putea afecta obezitatea sunt după cum urmează: 1) prin creșterea permeabilității intestinale pentru LPS, contribuind astfel la inflamația persistentă de grad scăzut care a fost asociată cu obezitatea (15) sau 2) prin perturbarea hormonilor intestinali care influențează axa intestin-creier-ficat-țesut adipos pentru a modifica aportul, stocarea și utilizarea energiei (16, 17). Deși este clar că microbiota intestinală este intim implicată în metabolismul energiei gazdei, contribuția sa la pierderea în greutate este mai puțin bine definită.

Modificările dietei gazdei afectează microbiota intestinală, modificând atât diversitatea cât și abundența speciilor (18, 19). Microbiota de la subiecții obezi a fost caracterizată, în general, ca având o diversitate filogenetică bacteriană mai mică, cu proporții mai mari și mai mici de Firmicutes și, respectiv, de Bacteroidete (9). În studiul nostru anterior, înlocuirea a 1% din grăsimea totală dintr-o dietă HFHS cu t10, c12-CLA a avut efecte profunde asupra grăsimii corporale și a cheltuielilor de energie, care nu au fost observate la șoarecii supuși FR (6). Acest lucru ridică posibilitatea ca micile modificări ale componentelor dietetice specifice să afecteze în mod disproporționat microbiota intestinală. Acest concept ar putea explica de ce efectele asupra țesutului adipos și asupra metabolismului întregului corp ar putea diferi după grade echivalente de pierdere în greutate rezultate din diferite abordări dietetice.

Am examinat acum diversitatea microbiană intestinală și structura comunității la șoarecii obezi hrăniți cu o dietă HFHS cu sau fără t10, c12-CLA, c9, t11-CLA (izomerul inert metabolic al CLA) sau FR. Rezultatele acestui studiu de urmărire al investigației noastre anterioare (6) arată că pierderea în greutate cu t10, c12-CLA sau FR duce la microbiomi intestinali diferiți. Diversitatea speciilor fecale și SCFA au fost, de asemenea, modificate diferențial de FR sau t10, c12-CLA. Aceste rezultate leagă populațiile microbiene intestinale specifice cu scăderea în greutate și indică diferențe în compozițiile microbiene și structura comunității ca răspuns la diferite metode de scădere în greutate.

Metode

Proiectarea studiului mouse-ului

Cuantificarea țesutului CLA

Expresia genelor și a proteinelor

ARN-ul a fost extras din intestinul subțire înghețat cu utilizarea unui kit de extracție a ARN-ului (RNEasy Mini Kit; Qiagen), transcris invers și ADNc amplificat prin qRT-PCR cu utilizarea unui instrument ABI 7900HT. Seturile de primer/sondă Taqman pentru gene individuale au fost obținute de la Thermo Fisher Scientific (Tabelul suplimentar 3), cu Gapdh utilizat ca genă de referință. Expresia relativă a genelor țintă a fost calculată cu utilizarea formulei ΔΔCt și exprimată ca schimbare de ori de la șoareci de control alimentați cu HFHS. Pentru cuantificarea proteinelor prin Western blot, 10 μg proteine ​​totale din intestinul subțire au fost electroforezate pe un SDS-PAGE nativ și transferate în nitroceluloză, iar occludina a fost detectată cu utilizarea unui anticorp occludin (nr. Ab167161; AbCam), rezolvată cu utilizarea unui sistem digital LICOR Odyssey și normalizat la β-actină (nr. ab8227; AbCam). Densitometria a fost efectuată cu utilizarea software-ului Image J (National Institutes of Health), așa cum este descris (22).

Analiza SCFA a peletelor fecale și a plasmei

Analize microbiene fecale. Secvențierea ADN-ului de mare viteză

ADN-ul total a fost izolat din pelete fecale congelate rapid cu utilizarea unui set de extracție ADN PowerFecal (MoBio), conform instrucțiunilor producătorului. Pentru fiecare probă, regiunea V4 a genelor de ARN ribozomal bacterian 16S a fost amplificată în reacții triplicate cu utilizarea setului de primer universal bacterian 515F/806R, care amplifică atât genele 16S bacteriene, cât și cele arhaeale (23, 24), cu PCR și preparate de bibliotecă. efectuat conform descrierii (25). Secvențierea ADN a fost efectuată cu utilizarea platformei Illumina MiSeq de la Universitatea din New York Langone Medical Center Genome Technology Center. Secvențele primare au fost depuse în Arhivele de citire a secvențelor, nr. SRP119909.

Analiza datelor secvențiale

Datele secvențiale din probele fecale au fost prelucrate cu QIIME v1.9.0, așa cum este descris (26, 27). Pe scurt, secvențele au fost demultiplexate și filtrate de calitate cu utilizarea parametrilor QIIME impliciți și grupați în unități taxonomice operaționale (OTU) cu un prag de similaritate a secvenței de 97% cu utilizarea UCLUST (28) în QIIME; OTU-urile cu ARN ribozomal 16S au fost selectate cu utilizarea unui protocol OTU cu referință deschisă cu următorii parametri: max acceptă: 1; max respinge: 8; cuvinte pas: 8; lungimea cuvântului: 8. Citirea secvenței, cu o lungime medie de 253 bp, a fost grupată cu utilizarea setului de date de referință Greengenes 97% (29, 30) (http://greengenes.secondgenome.com; versiunea din august 2013) . α Diversitatea (adică numărul de specii unice pe eșantion) a fost determinată cu utilizarea indicelui de distanță filogenetică, reprezentat ca curbe de rarefacție. β Diversitatea (adică diferențele în diversitatea speciilor într-un habitat localizat) a fost determinată cu utilizarea analizei UniFrac neponderate (31), iar rezultatele au fost prezentate ca grafice principale ale axelor de coordonate. Mărimea efectului de analiză discriminantă liniară a fost utilizată pentru a detecta diferențe semnificative în abundența relativă a taxonilor microbieni între grupurile experimentale, cu praguri de semnificație efectuate la setările implicite (32).

analize statistice

Măsurătorile țesutului și CLA fecale, SCFA fecale și expresia genelor fecale au fost analizate cu ajutorul software-ului GraphPad Prism 6 și reprezentate ca mijloace ± SEM. ANOVA cu un singur factor a fost utilizat pentru a compara diferențele dintre șoarecii hrăniți cu diferite diete, cu un test Sidak post hoc pentru a detecta diferențele dintre grupuri. Analizele Adonis (ANOVA permutational multivariat folosind matrici de distanță) și Anosim (analiza asemănărilor: metodă nonparametrică fără distribuție a analizei datelor multivariante care operează pe o matrice de diferențiere clasificată, permițând compararea variației abundenței speciilor și a compoziției între unitățile eșantionate) au fost efectuate secvențe fecale, compararea grupurilor și în timp, așa cum este descris (a se vedea tabelul 1 ) (33). O valoare P 1

Comparații în timp (0, 4 și 8 săptămâni)AdonisAnosim
Dieta 2
HFHS0,02 * 0,01 *
c9, t11-CLA0,01 * 0,01 *
t10, c12-CLA0,210,11
HFHS + FR0,04 * 0,19
Grupa 3
HFHS vs. t10, c12-CLA0,2690,498
c9, t11-CLA vs. t10, c12-CLA0,030 * 0,019 *
FR vs. t10, c12-CLA0,007 * 0,006 *

1 * P 2 Compară șoarecii hrăniți cu dieta specificată în timp, de la 0 la 8 săptămâni.