Foaia P. Patkar

1 Departamentul de Științe Nutritive, Colegiul de Științe Umane, Texas Tech University, Lubbock, TX 79409, SUA

Zheng Hao

2 Laborator de neurobiologie a nutriției, Pennington Biomedical Research Center, Louisiana State University System, Baton Rouge, LA 70808, SUA

Michael B. Mumphrey

2 Laborator de neurobiologie a nutriției, Centrul de cercetare biomedicală Pennington, sistemul universitar de stat din Louisiana, Baton Rouge, LA 70808, SUA

R. Leigh Townsend

2 Laborator de neurobiologie a nutriției, Centrul de cercetare biomedicală Pennington, sistemul universitar de stat din Louisiana, Baton Rouge, LA 70808, SUA

Hans-Rudolf Berthoud

2 Laborator de neurobiologie a nutriției, Pennington Biomedical Research Center, Louisiana State University System, Baton Rouge, LA 70808, SUA

Andrew C. Shin

1 Departamentul de Științe Nutritive, Colegiul de Științe Umane, Texas Tech University, Lubbock, TX 79409, SUA

Date asociate

Abstract

Obiective:

Dietele eșuează adesea, deoarece pierderea în greutate declanșează răspunsuri biologice puternice de contrareglare, cum ar fi creșterea foametei și hipometabolismului, despre care se crede că sunt în mod critic dependente de senzorul principal de combustibil din hipotalamusul mediobasal (MBH). Deoarece s-a demonstrat că foamea prelungită crește AgRP și NPY, nivelul de expresie al acestor două gene orexigenice a fost luat ca o citire experimentală pentru prezența sau absența foamei. Operația de by-pass gastric Roux-en-Y (RYGB) duce la o pierdere semnificativă în greutate fără a induce foamea asociată, indicând posibile modificări ale neuropeptidelor hipotalamice și/sau semnalizării. Scopul nostru a fost evaluarea genelor cheie din MBH implicate în reglarea greutății corporale, a poftei de mâncare și a inflamației/stresului oxidativ după intervenția chirurgicală RYGB la șoareci.

Metode:

Șoarecii obezi pe o dietă bogată în grăsimi au fost supuși fie unei intervenții chirurgicale simulate sau RYGB, fie restricției calorice pentru a se potrivi cu greutatea grupului RYGB. Șoarecii hrăniți cu Chow fără intervenție chirurgicală au servit ca un grup de control suplimentar. După 2 sau 12 săptămâni după operație, genele hipotalamice au fost analizate prin qPCR în timp real.

Rezultate:

În timpul fazei de slăbire rapidă la 2 săptămâni după intervenția chirurgicală RYGB, expresia genelor hipotalamice AgRP și NPY nu a fost crescută în comparație cu șoarecii cu intervenție chirurgicală simulată, indicând faptul că șoarecii nu le este foame. În schimb, aceeași pierdere în greutate indusă de restricția calorică a declanșat prompt creșterea expresiei AgRP și NPY. Acest efect diferențial al RYGB și al restricției calorice nu a mai fost observat în timpul fazei de menținere a greutății la 12 săptămâni după operație. Un efect diferențial similar a fost observat pentru ObRb, dar nu și pentru expresia POMC și CART. Mai mult, RAGE și IBA-1, doi markeri pentru inflamație/stres oxidativ, au fost în mod semnificativ suprimate după RYGB comparativ cu restricția calorică la 2 săptămâni după operație.

Concluzii:

Aceste descoperiri sugerează că RYGB previne răspunsul foametei adaptiv biologic declanșat de subnutriție și pierderea în greutate și suprimă markerii inflamației hipotalamice induse de pierderea în greutate.

Introducere

Recent am dezvoltat un model de șoarece cu operație RYGB a cărui greutate corporală și modificări ale compoziției reflectă cele observate la oameni cu rate scăzute de mortalitate și complicații 10. Scopul studiului a fost de a utiliza acest model de șoarece, cu adăugarea grupului important de greutate, pentru a efectua o analiză cuprinzătoare a ARNm a genelor cheie din MBH implicate în reglarea apetitului, greutății corporale, inflamației și stresului oxidativ la două puncte de timp - la 2 săptămâni postoperator în timpul fazei de slăbire rapidă și la 12 săptămâni postoperator când greutatea corporală sa stabilizat la un nivel inferior.

Materiale și metode

Animale

Șoarecii obezi C57BL6J induse de dietă masculină au fost cumpărați de la Jackson Laboratories la vârsta de 18 săptămâni. La sosirea la Centrul de Cercetări Biomedice Pennington, aceștia au continuat aceeași dietă bogată în grăsimi (60% grăsimi; 5,21 kcal/g; Research Diets D12492) și li s-a permis accesul la chow obișnuit (13% grăsime; 3,36 kcal/g; Purina 5001) pentru un total de 14 săptămâni. Animalele au fost ținute în condiții standard de laborator, cu o temperatură a camerei de 21-23 ° C și un ciclu de 12 ore lumină-întuneric (luminile aprinse la 07:00), cu excepțiile detaliate mai jos. Îngrijirea și experimentarea animalelor au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor Pennington Biomedical Center și au respectat cu strictețe regulile și liniile directoare furnizate de Societatea Americană de Fiziologie și NIH.

Prezentare generală experimentală

Chirurgie RYGB

O descriere detaliată a intervenției noastre chirurgicale RYGB la șoarece poate fi găsită în altă parte 11. Pe scurt, un membru Roux lung de 5-6 cm și un membru biliopancreatic lung de 6-7 cm au fost create prin tăierea jejunului lângă ligamentul lui Treitz și anastomozarea capătului distal al jejunului tăiat într-o pungă gastrică mică și capătul proximal cu mijlocul jejunului. S-a avut mare grijă să păstreze vasele gastrice și nervii lângă cardia. Chirurgia simulată a constat în laparotomia liniei medii și mobilizarea ușoară a stomacului și a intestinelor.

PCR cantitativă în timp real (RT)

Exemple de secvențe utilizate sunt după cum urmează: POMC - înainte, AAGAGGTTAAGAGCAGTGA; invers, ACATCTATGGAGGTCTGAAG; CART - forward, GCAAGAAGTCCTGAAGAAG; invers, GTAAAGACCGTGTGTAAGATT; NPY - înainte, CTAGGTAACAAGCGAATGG; invers, GGTGATGAGATTGATGTAGTG; AgRP - forward, ACAAGAGACCAGGACATC; invers, CAACAGCAGAACACAACT; GLP-1R (receptor al peptidei de tip glucagon 1) - înainte, TGGCTACATAAGGACAACT; invers, CAACAAGGATGGCTGAAG; Y2R (receptorul peptidei YY) - înainte, GCAGAGGCAGATGAGAAT; invers, AAGATGATGGAGCAGTAGG; BDNF (factor neurotrofic derivat din creier) - înainte, TTGGAAGCCTGAATGAATG; invers, CCTAAGATGAAGCGATTGTT; ObRb - forward, AGTCACAAGATAATGGAGAATAAG; invers, GGCTCTACTGGAATGGAA; GHSR - înainte, GAGCGTCTTCTTCTTCCT; invers, AGCATCTTCACTGTCTGTT; TNF-α - înainte, CCACCATCAAGGACTCAA; invers, ATCTTATCCAGCCTCATTCT; IL-6 - înainte, ACAGAAGGAGTGGCTAAG; invers, AGAGAACAACATAAGTCAGATAC; IL-1β - înainte, GCAGCACATCAACAAGAG; invers, CAGCAGGTTATCATCATCATC; NF-kB - înainte, AAGAAGGACACGACAGAA; invers, CAGGCTATTGCTCATCAC; GFAP - forward, CGCATCACCATTCCTGTA; invers, GGAGCACGCATCTATCTAA; RAGE - înainte, CTACCGAGTCCGAGTCTA; invers, CCTGGTCTCTTCCTTCAC; ALCAM - înainte, GAGGCAGACGATATAAGTGA; invers, GAGGAGACCAACGACAAT; IBA-1 - înainte, TCTGCCATCTTGAGAATGA; invers, TGACATCCACCTCCAATC.

analize statistice

Experienții au fost orbi față de grupuri în timpul analizei datelor. Abundența de ARNm între 4 grupuri a fost normalizată mai întâi la GAPDH și exprimată ca schimbare de ori de la grupul de control slab hrănit cu chow. Acest lucru a fost analizat de ANOVA urmat de testele de comparație multiple post-hoc ale lui Bonferroni. Datele privind greutatea corporală și aportul caloric au fost analizate prin ANOVA repetate, urmate de testele de comparație multiple post-hoc ale lui Bonferroni. Datele sunt prezentate ca medie ± SEM. Diferența semnificativă statistic a fost stabilită la p 10. În această cohortă, RYGB a redus greutatea corporală cu aproximativ 17% în comparație cu nivelurile pre-chirurgicale și cu 34% în comparație cu șoarecii care au funcționat în mod fals, în principal datorită pierderii de masă grasă. A existat o redresare medie a greutății mici de 5% din nadirul care a avut loc la aproximativ 3 săptămâni. În cohorta de 2 săptămâni, RYGB a redus greutatea corporală cu aproximativ 22% în comparație cu nivelurile pre-chirurgicale și cu 18% în comparație cu șoarecii care au funcționat în mod simulat (Fig. Suplimentară S1). Nivelurile de leptină plasmatică atât la 2, cât și la 12 săptămâni atât la șoareci RYGB, cât și la șoareci WM au fost mult mai mici decât șoarecii fals și nu au fost semnificativ diferite de șoarecii martor hrăniți cu chow și unul de celălalt 10. Aportul de alimente a fost semnificativ mai mic în primele 8 zile după RYGB și apoi sa recuperat la niveluri aproape pre-chirurgicale după 2 săptămâni (Fig. S2 suplimentar).

Efecte asupra expresiei genice spre sfârșitul fazei de slăbire

La 2 săptămâni, expresia ARNm a AgRP și NPY a fost semnificativ mai mare la restrângerea caloriilor, dar nu și la șoarecii cu RYGB, comparativ cu șoarecii acționați (Fig. 1A). A existat o tendință similară cu expresia receptorului de grelină (GHSR) care nu a atins semnificația statistică. Comparativ cu șoarecii martor hrăniți fără intervenție chirurgicală, nivelurile de expresie ale AgRP, NPY și GHSR au fost semnificativ mai scăzute atât la șoarecii RYGB, cât și la șoarecii acționați, dar nu și la șoarecii WM cu restricție calorică.

deosebire

Exprimarea genelor legate de inflamație sau stres oxidativ incluzând TNF-α, RAGE, IL-6, IBA-1 și NFkB (Fig. 2) a fost, în general, cea mai scăzută la șoarecii cu RYGB, dar nu semnificativ mai mică decât la șoarecii acționați. Cu excepția TNF-α, niciuna dintre aceste gene nu a fost reglată în sus la șoarecii obezi care funcționează în mod fals. Cu toate acestea, reglarea în sus de 2,2 ori a TNF-α nu a fost semnificativă statistic din cauza unei variabilități ridicate. Interesant, RAGE și IBA-1 mARN au fost semnificativ mai mari în grupul WM care a pierdut aceeași cantitate de greutate ca șoarecii RYGB.

Dintre genele anorexigenice evaluate, POMC a fost semnificativ crescut în fals vs. Comenzile RYGB și chow (Fig. 1B). De asemenea, a existat o tendință de creștere a BDNF în toate cele trei grupuri cu conținut ridicat de grăsimi comparativ cu martorii chow, opus celor observate la 2 săptămâni.

În mod similar, cu excepția IBA-1 și ALCAM, TNF-α, IL-6, IL-1β și NFkB mRNA nu a mai fost reglat în sus în controalele WM (Fig. 2).

Discuţie

Y2R redus la șoarecii RYGB în comparație cu controalele slabe hrănite cu chow poate fi interpretat ca o reglare descendentă compensatorie datorită supraactivării receptorului de către hormonul intestinal anorexigen PYY. Deși nu au fost măsurate în acest studiu, lucrările noastre 22 și ale celorlalți 23 au demonstrat în mod clar niveluri PYY plasmatice bazale și/sau stimulate de masă substanțial mai mari după intervenția chirurgicală RYGB. Acest lucru poate ajuta, de asemenea, să explice expresia mai mică a ARNm NPY/AgRP, în ciuda scăderii dramatice în greutate la acești șoareci. Același mecanism potențial nu pare să se aplice pentru ObRb mai scăzut la șoareci RYGB, deoarece nivelurile lor de leptină plasmatică au fost scăzute și comparabile cu cele ale grupurilor de control slabe și WM.

Aproximativ jumătate din genele legate de inflamație sau stres oxidativ au fost reduse la șoarecii obezi imitați, comparativ cu controalele slabe hrănite cu chow, deși nu au atins semnificativitate statistică în cea mai mare parte. În timp ce hrănirea cu HF sau obezitatea indusă de dietă este adesea asociată cu inflamația hipotalamică 24, datele noastre sunt de acord cu constatările altora care nu au arătat nici o modificare sau chiar au scăzut markerii inflamatori hipotalamici în obezitatea indusă de dietă 25, 26. Discrepanța poate fi explicată prin durata hrănirii HF și/sau a compoziției dietei HF. Important, mARN-ul acestor markeri a fost redus în mod similar în grupul RYGB, dar nu în grupul WM, sugerând că șoarecii WM ar putea percepe hrănirea restricționată și reducerea ulterioară a greutății ca factori de stres, în timp ce șoarecii RYGB nu. Ar fi esențial să se ia în considerare aceste date cu analize proteomice și metabolomice, printre altele, în viitorul apropiat, pentru a înțelege mai bine dacă intervenția chirurgicală RYGB modifică într-adevăr starea inflamatorie hipotalamică.

Șoarecii Sham și RYGB prezintă curbe de greutate corporală divergente în timpul fazei acute în timp ce împărtășesc niveluri similare de ARNm pentru multe gene examinate aici, sugerând că aceste gene pot îndeplini roluri diferite după operație. Interesant este că majoritatea modificărilor nu mai erau prezente în timpul fazei cronice, când șoarecii RYGB își susțineau cu succes pierderea în greutate. Acest lucru poate indica o sensibilitate redusă la mecanismele de semnalizare induse de RYGB. Alternativ, poate exista un grup de gene importante pentru „scăderea” vs. „Menținerea” greutății corporale și a grăsimii în și/sau în afara MBH. Având în vedere reducerea mRNA BDNF în rândul grupurilor de tratament în faza acută și revenirea concertată la nivelurile pre-chirurgicale în faza cronică, speculăm că BDNF poate fi una dintre genele care ajută la menținerea greutății corporale și a masei grase noi.

În concluzie, oferim dovezi care demonstrează că intervenția chirurgicală RYGB reglează diferențial genele hipotalamice critice pentru pofta de mâncare, greutatea corporală și inflamația/stresul oxidativ în timpul fazei acute de „scădere rapidă în greutate” și a fazei cronice de „menținere a greutății”. Foarte important, descoperirile noastre arată că pierderea în greutate indusă de restricția calorică, dar nu RYGB crește expresia genelor orexigenice și inflamatorii, sugerând că intervenția chirurgicală RYGB suprimă foamea adaptativă și răspunsul la stres la pierderea în greutate. Rezultatele noastre arată în continuare că aceste modificări dispar în timpul fazei de menținere/recuperare a greutății, indicând posibil dezvoltarea toleranței la mecanismele de semnalizare induse de RYGB.