Departamentul de afiliere pentru științe clinice și translaționale, Creighton University School of Medicine, Omaha, NE, Statele Unite ale Americii

vitamina

Departamentul de afiliere pentru științe clinice și translaționale, Creighton University School of Medicine, Omaha, NE, Statele Unite ale Americii

Departamentul de afiliere pentru științe clinice și translaționale, Creighton University School of Medicine, Omaha, NE, Statele Unite ale Americii

Departamentul de afiliere pentru științe clinice și translaționale, Creighton University School of Medicine, Omaha, NE, Statele Unite ale Americii

Departamentul de afiliere pentru științe clinice și translaționale, Creighton University School of Medicine, Omaha, NE, Statele Unite ale Americii

Departamentul de afiliere pentru științe clinice și translaționale, Creighton University School of Medicine, Omaha, NE, Statele Unite ale Americii

  • Gaurav K. Gupta,
  • Tanupriya Agrawal,
  • Vikrant Rai,
  • Michael G. Del Core,
  • William J. Hunter III,
  • Devendra K. Agrawal

Cifre

Abstract

Citare: Gupta GK, Agrawal T, Rai V, Del Core MG, Hunter WJ III, Agrawal DK (2016) Suplimentarea cu vitamina D reduce hiperplazia intimă și restenoza după intervenția coronariană la porcii aterosclerotici. PLOS ONE 11 (6): e0156857. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0156857

Editor: Dinender K. Singla, Universitatea din Florida Centrală, STATELE UNITE

Primit: 10 februarie 2016; Admis: 21 mai 2016; Publicat: 6 iunie 2016

Disponibilitatea datelor: Toate datele relevante se găsesc în lucrare.

Finanțarea: Această cercetare a fost susținută de subvenții de cercetare acordate de Institutul Național de Sănătate numerele R01HL112597 și R01HL116042 de la Oficiul Suplimentelor Dietetice și directorul Institutelor Naționale de Sănătate (OD) și Institutul Național al Inimii, Plămânilor și Sângelui (NHLBI) către DKA . Conținutul acestui articol este exclusiv responsabilitatea autorilor și nu reprezintă neapărat opiniile oficiale ale NIH.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Studii clinice recente susțin o relație între starea serică a vitaminei D și severitatea CAD [30-32]. Cu toate acestea, asocierea nivelurilor endogene de 25 (OH) D cu evenimente de boli cardiovasculare după intervenția coronariană este încă necunoscută și sunt necesare studii prospective pentru a investiga dacă suplimentarea cu vitamina D joacă un rol în protecția cardiovasculară intervenția post-coronariană. Proliferarea VSMC și inflamația sunt principalele procese patologice implicate în dezvoltarea restenozei coronare. Am raportat recent o expresie scăzută a VDR în leziunile neointimale după intervenția coronariană, sugerând un rol potențial al vitaminei D în patogeneza hiperplaziei intime [33]. Nu a existat niciun studiu prospectiv care să investigheze efectul stării, deficienței, suficientei și suplimentelor de vitamina D asupra restenozei coronare. În acest studiu, am proiectat experimente pentru a examina efectul suplimentării cu vitamina D asupra inflamației și permeabilității arterelor coronare după intervenția coronariană într-un model de restenoză coronariană porcină aterosclerotică bine controlat.

Material si metode

Animale și diete

Înainte de inițierea studiului, o aprobare a protocolului de cercetare (IACUC # 0831) a fost obținută de la Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea Creighton. Microswine Yucatan de 30-40 lbs au fost obținute de la Sinclair Laboratories, Columbia, MO, SUA. Pe parcursul studiului, toate animalele au fost adăpostite în Animal Resource Facility din Creighton University, Omaha, NE și standardele NIH și au fost respectate orientările USDA pentru îngrijirea lor și protocolul experimental. Animalele au fost hrănite cu 1-1,5 lb/animal/zi de dietă experimentală.

Protocol experimental

Angiografie coronariană, angioplastie și tomografie cu coerență optică

Imaginea OCT este utilă pentru a vizualiza în mod clar apoziția stentului și acoperirea neointimală a stenturilor. Imagistica completă a fost efectuată și înregistrată utilizând sistemul de imagistică intravasculară C7-XR OCT (St. Jude Medical, St. Paul, MN). S-au calculat diametrul luminos minim, diametrul de referință și diametrul procentului de stenoză.

Extragere de sânge

Sângele a fost extras din vena urechii la momentul inițial, 6 luni și 12 luni pentru măsurarea profilului lipidic complet, a profilului metabolic complet, a numărului complet de sânge (CBC), a proteinei C reactive (CRP) și a nivelului seric de 25 (OH) D. Nivelurile serice de IL-6, IL-10, TNF-α și IFN-γ au fost cuantificate folosind kituri ELISA.

Analiza histomorfometrică

Inimile au fost îndepărtate chirurgical, iar arterele coronare au fost disecate cu atenție, urmate de încorporarea în parafină. S-au tăiat secțiuni subțiri și s-au obținut secțiuni seriale pentru fiecare segment de 200 μm pe toată lungimea vasului. Secțiunile de țesut au fost colorate cu hematoxilină și eozină (H&E), Verhoeff-Van Gieson (VVG) și colorare tricromă Mason. Procentul de restenoză a fost cuantificat prin analiză morfometrică prin calcularea ariei de restenoză și formare neointimală în suprafața luminală, lamina elastică internă (IEL) și lamina elastică externă (EEL). Analizele morfometrice au fost efectuate utilizând software-ul ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/) și procentul de stenoză a ariei a fost cuantificat în lumen (LA) și IEL folosind formula:% suprafață stenoză = [ 1- (zona luminală/zona IEL)] x 100.

Imunohistochimie și imunofluorescență

Secțiunile subțiri fixate cu parafină ale arterelor coronare porcine post-angioplastie au fost utilizate pentru studii de imunohistochimie și imunofluorescență prin metodele stabilite în laboratorul nostru [37]. Deparafinizarea și rehidratarea s-au făcut înainte de colorarea lamelelor. Pe scurt, secțiunile de țesut au fost incubate peste noapte la 4 ° C cu anticorpi primari împotriva actin-alfa (α-SMA) a mușchiului neted (α-SMA) (Sc-58669) și a antigenului nuclear celular anti-proliferativ (PCNA) (sc-25280; achiziționat de la Santa Cruz Biotechnology ). Apoi, secțiunile de țesut au fost incubate timp de 1 oră cu anticorp secundar biotinilat (sistemul VECTASTAIN Elite ABC) sau anticorpi secundari purificați cu afinitate de capră anti-șoarece 3 (cy3) de șoarece (Jackson ImmunoResearch, Westgrove, PA). Secțiunile de țesut incubate cu izotipul anticorpului primar au fost procesate în paralel pentru a servi drept martori negativi. Imunopozitivitatea la proteinele de interes din secțiunile de țesut a fost vizualizată la microscop și fotografiată cu o cameră Olympus DP71.

Test imunosorbent legat de enzime (ELISA)

Kituri ELISA pentru IFN-γ porcine, IL-6 porcine și TNF-α porcine (Ray Biotech, Inc., Norcross, GA) și IL-10 porcine (eBioscience, San Diego, CA) au fost utilizate pentru a măsura concentrațiile serice ale IFN-γ, IL-6, TNF-α și IL-10, conform protocolului producătorului. Pe scurt, plăcile cu 96 de godeuri au fost pre-acoperite cu IFN-y anti-porcine, IL-6 anti-porcine, TNF-α anti-porcine și IL-10 anti-porcine de către producător. După adăugarea a 100 pl de ser în fiecare godeu, plăcile cu 96 de godeuri au fost incubate la temperatura camerei timp de 2½ ore, urmate de spălare de patru ori cu tampon de spălare. Apoi, s-au adăugat anticorpi monoclonali biotinilați la porcine IFN-γ, IL-6, TNF-α și IL-10 și plăcile au fost păstrate pentru incubare cu anticorpii timp de o oră la temperatura camerei urmate de adăugarea de peroxidază de hrean conjugată streptavidină și incubare pentru încă 45 de minute la temperatura camerei. Pentru a cuantifica nivelurile citokinelor din fiecare probă de ser, a fost construită o curbă standard pentru porcină recombinantă IFN-γ, IL-6, TNF-α și IL-10 folosind curba de patru parametri generată de computer pentru fiecare citokină pentru a determina nivelul citokinei din fiecare probă.

analize statistice

Valorile măsurătorilor rezultate sunt prezentate ca medie ± SEM. Pentru a determina semnificația statistică dintre grupurile experimentale, analiza statistică a fost efectuată folosind GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). Semnificația statistică dintre grupurile experimentale a fost determinată prin utilizarea testului t student cu două cozi nepereche sau ANOVA unidirecțional cu testele de comparație multiple ale lui Bonferroni. Fig. 1. Efectele dietelor experimentale asupra parametrilor biochimici.

Datele sunt prezentate pe 25-hidroxi vitamina D serică (Fig. 1A), calciu seric (Fig. 1B), colesterol seric total (Fig. 1C), lipoproteine ​​cu densitate mică (LDL) (Fig. 1D) și lipoproteine ​​cu densitate mare (Fig. HDL). 1E) nivelurile microswinei feminine Yucatan după administrarea în total de 12 luni a dietei. Grupa 1: Dieta cu colesterol ridicat cu deficit de vitamina D; Grupa 2: Dieta cu colesterol ridicat suficient de vitamina D + 1.000 UI/zi vitamina D după intervenția coronariană; Grupa 3: Dieta cu colesterol ridicat suficient de vitamina D + 3.000 UI/zi vitamina D după intervenția coronariană; Datele sunt prezentate ca medie ± SEM (N = 4 în fiecare grup experimental); ** p Fig 2. Examinarea OCT a șase luni după intervenția arterelor coronare porcine - imagini reprezentative.

Arterele coronare la locul angioplastiei cu balon (A-C) (E-G) și arterele coronare după stentarea metalului gol (E-G). Analiza cantitativă a fost efectuată pentru a calcula% restenoza suprafeței în arterele coronare post-angioplastie (D) și post-stenting (H) (N = 12). Grupa 1: Dieta cu colesterol ridicat cu deficit de vitamina D; Grupa 2: Dieta cu colesterol ridicat suficient de vitamina D + 1.000 UI/zi vitamina D după intervenția coronariană; Grupa 3: Dieta cu colesterol ridicat suficient de vitamina D + 3.000 UI/zi vitamina D după intervenția coronariană; Datele sunt prezentate ca medie ± SEM (N = 4 în fiecare grup experimental); * p Fig 3. Efectul suplimentării cu vitamina D asupra dezvoltării restenozei în urma angioplastiei cu balon.

Dieta cu colesterol ridicat cu deficit de vitamina D (panouri AC), dieta cu colesterol ridicat cu vitamina D + 1000 UI grupa de vitamina D (panouri EG) și () Dieta cu colesterol ridicat cu vitamina D + 3000 UI grup suplimentar de vitamina D (panouri HJ) . Secțiunile au fost colorate folosind anticorp anti-actin (α-SMA) al mușchiului neted al șoarecului și anti-capră cy3 șoarece ca anticorp secundar (panourile A, E, D). DAPI a fost folosit pentru a colora nucleele (panourile B, F, I. Suprapunerea DAPI cu anticorp anti-α-SMA de șoarece și anti-capră cy3 de șoarece ca anticorp secundar (panouri C, G, J). Expresia puternică a α-SMA a fost găsit în zona neointimală, precum și în medii Scală bară 100 μm, L: lumen, M: strat medial, NI: neointima (N = 4).

Efectul suplimentării cu vitamina D asupra formării neointimale și proliferării celulare

Efectul suplimentării cu vitamina D asupra proliferării VSMC în arterele coronare post-angioplastie a fost examinat prin imunofluorescența secțiunilor de țesut de arteră coronariană pentru α-SMA (Fig. 4), un marker pentru VSMC și colorarea imunohistochimică a secțiunilor de țesut de arteră coronariană pentru PCNA ( Fig. 4). 5), un marker al proliferării celulare. Țesutul neointimal compus în principal din celule care exprimă α-SMA indicând faptul că VSMC sunt componenta majoră a îngroșării neointimale dezvoltate în urma angioplastiei cu balon (Fig 4).

Fotomicrografii care prezintă expresia imunohistochimică a antigenului nuclear celular proliferant (PCNA) în secțiuni subțiri de angioplastie post-balon arterele coronare din dieta cu colesterol ridicat cu deficit de vitamina D (panouri AB) și dietă cu colesterol ridicat cu vitamina D suficientă + porcine suplimentare de vitamina D orală CF). Secțiunile au fost colorate cu DAB ca cromogen și contracolorate folosind hematoxilină. Săgețile indică celulele care exprimă PCNA. Bara de scalare 100 μm; L: lumen, M: strat medial, NI: neointima; Datele sunt prezentate ca medie ± SEM (N = 4); * p Fig 6. Efectul vitaminei D asupra expresiei citokinelor serice.