Afiliații Unitatea de cercetare pentru producția de păsări de curte și siguranța produselor, Serviciul de cercetare agricolă, USDA, Fayetteville, Arkansas, Statele Unite ale Americii, Departamentul de științe avicole, Universitatea din Arkansas, Fayetteville, Arkansas, Statele Unite ale Americii

suplimentul

Afiliere Unitate de cercetare pentru producția de păsări de curte și siguranța produselor, Serviciul de cercetare agricolă, USDA, Fayetteville, Arkansas, Statele Unite ale Americii

Departamentul de afiliere pentru știința păsărilor, Universitatea din Arkansas, Fayetteville, Arkansas, Statele Unite ale Americii

Departamentul de afiliere pentru medicină veterinară, campusul Rongchang al Universității Southwest, județul Rongchang, China

Unitatea de cercetare pentru producția de păsări de curte și siguranța produselor, Serviciul de cercetare agricolă, USDA, Fayetteville, Arkansas, Statele Unite ale Americii

Afiliere Unitate de cercetare pentru producția de păsări de curte și siguranța produselor, Serviciul de cercetare agricolă, USDA, Fayetteville, Arkansas, Statele Unite ale Americii

  • S. K. Makkar,
  • N. C. Rath,
  • B. Packialakshmi,
  • Z. Y. Zhou,
  • G. R. Huff,
  • A. M. Donoghue

Cifre

Abstract

Citare: Makkar SK, Rath NC, Packialakshmi B, Zhou ZY, Huff GR, Donoghue AM (2016) Supliment nutrițional de membrană cu coajă de ouă pentru incubație Îmbunătățește performanța păsărilor de curte și oferă rezistență împotriva stresului endotoxinic. PLoS ONE 11 (7): e0159433. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0159433

Editor: Cristoforo Scavone, Universitatea din São Paulo, BRAZILIA

Primit: 1 aprilie 2016; Admis: 1 iulie 2016; Publicat: 27 iulie 2016

Acesta este un articol cu ​​acces liber, fără drepturi de autor și poate fi reprodus, distribuit, transmis, modificat, construit sau utilizat în orice mod de către oricine în orice scop legal. Lucrarea este pusă la dispoziție sub dedicarea domeniului public Creative Commons CC0.

Disponibilitatea datelor: Toate datele relevante se află în hârtie și în fișierele sale de informații de suport.

Finanțarea: Acest studiu a fost realizat ca parte a cercetării intramurale a USDA. Nu s-au primit finanțări suplimentare pentru acest studiu.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Materiale și metodă

Pregătirea HESM și sterilizarea acestuia

Program experimental

Protocoalele de studiu pe animale au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor (IACUC) al Universității din Arkansas. Puii masculi Cobb 500 nou-eclozați au fost crescuți pe creioane la o densitate aproximativă de 0,8 metri pătrați/pasăre cu 23: 1 lumină: program întunecat și hrană furnizată formulată de specificațiile Consiliului Național de Cercetare [21] și apă ad libitum. HESM a fost adăugat la un nivel de 0,5% la dieta de pornire pentru puii de carne pe baza experimentelor anterioare. În studiul 1, efectele HESM brut și a unui nivel comparabil de pulbere de proteine ​​din zer au fost testate asupra performanței de creștere și a altor parametri fiziologici ai puilor de 5 săptămâni, după cum este descris mai târziu. În studiile 2 și 3, pulberea HESM a fost sterilizată cu etanol și utilizată ca supliment furajer în care au fost evaluate efectele lipopolizaharidei (LPS) de Salmonella typhimurium după 4 și 24 de ore de administrare. În toate experimentele, puii au fost hrăniți mai întâi cu dietele care conțin suplimente timp de 14 zile după eclozare, apoi au trecut la dietele lor obișnuite pentru restul timpului până la necropsie. Păsările au fost monitorizate zilnic pentru mortalitate, bunăstare și evaluate săptămânal pentru greutatea corporală (BW) și consumul de furaje. BW-ul păsărilor a fost măsurat înainte de injectarea LPS și înainte de necropsie în studiile 2 și 3.

În studiul 1, 72 de pui de o zi au fost împărțiți în 3 grupuri fiecare cu 24 de păsări în două pixuri replicate. Cele trei grupuri au primit diete după cum urmează: 1) furaje de control fără supliment, 2) furaje care conțin 0,5% pulbere de proteine ​​din zer ca un control secundar pentru a afla dacă efectul se datorează numai suplimentului de proteine ​​și 3) furaje care conțin 0,5% HESM. Înainte de necropsie, 6 păsări din fiecare stilou (12/grup) sângerate prin puncție cardiacă, sânge colectat în EDTA conținând tuburi Vacutainer pentru hematologie și tuburi serice rapide (BD Falcon) pentru teste de chimie clinică, respectiv [14]. Păsările au fost ucise prin dislocarea colului uterin.

În studiile 2 și 3, performanța de creștere a păsărilor a fost măsurată împreună cu alte modificări fiziologice, inclusiv efectele Salmonella typhimurium LPS (pisica # HC4060 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). În studiul 2, puii de cincizeci de zile au fost repartizați în 2 grupe și li s-au administrat furaje cu și fără supliment steril de 0,5% HESM timp de 2 săptămâni după eclozare, după cum s-a descris mai sus, apoi au trecut la furaje obișnuite pentru restul timpului până la vârsta de 5 săptămâni. În ziua 34, 12 păsări din fiecare grup au fost injectate LPS la o concentrație de 1 mg/kg BW în ser fiziologic, intramuscular în coapsă, în timp ce restul au primit volume egale de injecție salină. Efectul LPS a fost monitorizat vizual timp de 5 ore după injecții cu BW măsurate după 24 ore de injecție. Înainte de necropsie, toate găinile (n = 12/tratament) au fost sângerate pentru teste de hematologie și chimie clinică. La necropsie, au fost înregistrate greutățile organelor selective de la toate păsările.

În studiul 3, s-a determinat efectul LPS asupra expresiei splenice a genelor selective cu asociere cunoscută cu funcții imune diferite. Puii din grupurile de control și HESM au primit fie injecție salină, fie LPS, așa cum s-a descris anterior. La patru ore după injecție, 6 pui din fiecare grup au fost uciși, iar splinele au fost plasate în azot lichid pentru extracția ARN, iar restul au fost uciși după 24 de ore pentru a înregistra greutatea BW și, respectiv, a organelor.

Necropsie

Greutățile ficatului, inimii, splinei și bursei de la toate păsările au fost utilizate pentru a calcula procentul în raport cu BW. În studiul 2, o lungime de cm de ileon sub ansa pancreatică a fost excizată de la fiecare dintre cele 6 păsări martor și alimentate cu HESM și fixată în fluidul Carnoy pentru

5 h, transferat la 70% alcool, apoi procesat pentru histologie. Sase secțiuni de parafină de microni au fost colorate cu colorare periodică a acidului Schiff (PAS) cu hematoxilină și examinate pentru sănătatea vilozității, secreția mucoasă și anomalia brută prin observare vizuală. Secțiunile au fost fotografiate cu microscopul BX Olympus.

Hematologie

Numărul de celule sanguine împreună cu conținutul de hemoglobină, volumul corpuscular mediu (MCV), hematocrit, microhematocrit (MCH), lățimea distribuției globulelor roșii (RDW), valorile au fost măsurate folosind sânge anticoagulat EDTA utilizând sistemul de analiză a sângelui Cell-Dyn 3500 Abbott Park, IL) standardizat pentru sângele aviar.

Analize serice

Parametrii metabolici serici au fost testați utilizând un analizor de chimie clinică (Ciba Corning Diagnostics Corp., Medfield, MA). Concentrațiile de corticosteron au fost măsurate folosind Detect X enzima imunoassay kit ™ (Arbor Assays, Ann Arbor, MI) și diluții predeterminate de ser [14]. Concentrațiile de IgM, IgG și IgA au fost similare, determinate folosind seturile de testare respective de la Bethyl Laboratory (Montgomery, TX) cu serul diluat la 1: 1000 cu tampon furnizat de producător pentru IgA, 1: 50.000 pentru IgG și 1: 20.000 pentru IgM, respectiv. Concentrațiile de anticorpi din ser au fost calculate din curbele lor standard respective.

Expresia genelor

Expresiile genelor de reglare a inflamației, proinflamatorii (IL-1β, IL-6, IFN-γ), antiinflamatorii (IL-4, IL-10, IL-12) și factori de susținere a reparării plăgilor imunosupresoare (TGF) -β3 și factorul de creștere endotelial vascular (VEGF) [22-24] au fost determinate folosind extract de ARN de țesut splenic din tratamentele respective și RT-PCR cantitativ. Șase spline înghețate din fiecare grup de tratament au fost împărțite în 4 sferturi și

100 mg de țesuturi din regiunea echivalentă a fiecărei spline au fost extrase cu Tri Reagent (Sigma-Aldrich) pentru a prepara ARN. ADN-ul complementar (ADNc) a fost sintetizat din ARN utilizând qScript ™ cDNA SuperMix (Quanta Biosciences) urmând protocolul sugerat de producător. PCR cantitativă în timp real a fost efectuată utilizând SYBR ® green PCR master mix (tehnologii Life) într-un sistem ABI 7500 Real-Time PCR (Applied Biosystems, Carlsbad, CA). O reacție de 25 μl conținând 5 μl ADNc (1 μg echivalent ARN) și primeri specifici împotriva IL-1β, IL-4, IL-6, IL-10, IFN-γ, TGF-β3, VEGF și IL-12 de pui ( S1 Tabel), au fost supuși la PCR cu o denaturare inițială la 95 ° C timp de 10 minute urmată de 40 de cicluri de PCR după cum urmează: 95 ° C timp de 15 secunde și 58 ° C timp de 1 min. Expresiile genelor țintă au fost analizate prin metoda 2-Ct [25] cu ARN 18S ca referință.

Analize statistice

Rezultatele comparative au fost evaluate utilizând testul t al studenților 2way și testele cu interval multiplu ale lui Duncan utilizând software-ul SAS [26] și o valoare P de ≤0,05 considerată a fi semnificativă. Rezultatele sunt prezentate ca medie ± SEM.

Rezultate

Conținutul mediu de azot proteic al HESM a fost determinat a fi de aproximativ 88% (greutate/greutate), a cărui adăugare nu a modificat semnificativ conținutul de proteine ​​din furaje (martor: 25,1% și HESM: 25,3%, n = 2 probe/grup). Numărul de colonii bacteriene a arătat o reducere semnificativă de la 30.000/ml în extractul HESM netratat la mai puțin de 5 colonii în extractul HESM tratat cu etanol. Tratamentul cu etanol a redus, de asemenea, conținutul de endotoxine din HESM, evaluat de un nivel semnificativ scăzut de producție de nitriți de către celulele HTC (Fig 1).

Barele cu alfabete diferite sunt statistice diferite (P ≤ 0,05).

Efect asupra BW și a mortalității

În studiul 1, nu au existat diferențe semnificative în greutatea corporală (BW) sau în greutatea organelor relative ale păsărilor, care au primit dieta suplimentară HESM, comparativ cu grupurile de control sau de suplimente de proteine ​​din zer (tabelul S2). Datele referitoare la greutatea corporală, combinate atât din studiile 2, cât și din cele 3, au arătat creșteri semnificative ale păsărilor hrănite cu supliment suplimentar HESM măsurate în ambele zile 28 și 34 înainte de divizarea lor pentru tratamentul LPS (Fig 2). Cu toate acestea, diferențele nu au fost discernibile statistic, deși păsările din grupul HESM care au primit ser fiziologic au avut BW numeric mai mari în ziua 35 (Tabelul 1). Rata cumulativă a mortalității în toate cele 3 experimente, combinate, nu a arătat diferențe semnificative între pui de control și pui hrăniți cu HESM.

Rezultatele sunt combinate din studiile 2 și 3 (n = 32-36).

Efect LPS

Puii tratați cu LPS au prezentat simptome de boală indicate de lipsa de activitate, închiderea pleoapelor și evitarea hranei în 3 ore de tratament și scăderea BW la 24 ore. Greutățile hepatice relative au crescut semnificativ, iar greutatea burselor a scăzut la puii tratați cu LPS, deși nu au existat modificări ale greutății inimii și splinei. Puii care au primit HESM au prezentat pierderi mai mici (p≤ 0,05) BW comparativ cu păsările hrănite de control (Tabelul 1).

Hematologie și chimia serului

Rezultatele studiului 2 și efectul LPS sunt prezentate în tabelul 2. Tratamentul HESM în sine nu a avut niciun efect asupra procentelor de limfocite (L), monocite (M), heterofile (H) sau bazofile (B) și H/Rapoarte L. La tratamentul cu LPS, a existat o creștere a procentului de heterofili, monocite și bazofile și o reducere a numărului de limfocite în ambele grupuri, având tendința de a crește raporturile H/L. Scăderea relativă a heterofilului și creșterea numărului de limfocite la păsările hrănite cu HESM, provocate cu LPS, au dus la o scădere semnificativă a raporturilor H/L comparativ cu puii hrăniți cu dietă martor tratați în mod similar (Tabelul 2). Au existat alte modificări minore, inclusiv hematocrit crescut al păsărilor HESM tratate cu LPS. HESM a produs, de asemenea, o scădere moderată a concentrațiilor serice de proteine, calciu și magneziu, dintre care unele au crescut la tratamentul cu LPS. LPS a cauzat o scădere a fierului seric și o creștere a concentrațiilor de trigliceride în ambele grupuri de hrană (Tabelul 3). Nivelurile de colesterol și HDL au fost reglementate în jos la serul păsărilor de control comparativ cu păsările hrănite cu supliment HESM și provocate cu LPS. Nici nivelurile de alanină, nici aspartat de amino transferază nu au fost afectate de HESM, indicând lipsa de toxicitate hepatică.

Imunoglobuline serice și corticosteron

În studiul 1 nu au existat modificări ale nivelurilor serice de IgM la puii hrăniți fie cu proteină din zer, fie cu supliment HESM intact, dar nivelurile de IgG au arătat o scădere cu HESM (tabelul S3). O tendință similară a fost observată în cel de-al doilea studiu care, la tratamentul cu LPS, a crescut nivelul IgM seric, în timp ce IgG a rămas neschimbată la păsările hrănite cu HESM. Niciunul dintre tratamente nu a avut efect asupra IgA serului (Tabelul 4). Concentrațiile serice de corticosteron au fost în mod constant mai mici atât în ​​studiile 1, cât și în cele 2 la păsările hrănite cu HESM care, cu tratament LPS, au crescut moderat, ajungând la aceleași niveluri ca la păsările martor tratate cu soluție salină (Tabelul 4).

Expresia genelor

Rezultatele expresiei genei splenice sunt prezentate în Tabelul 5. Puii hrăniți cu dietă regulată și provocați cu LPS au avut o creștere semnificativă a expresiei genei IL-6 în comparație cu păsările hrănite cu HESM (Fig 3). Gena anti-inflamatorie IL-10 a arătat o creștere semnificativă a grupului HESM provocat cu LPS comparativ cu puii hrăniți cu control provocat cu LPS (Fig. 4). Gena IL-4 a fost reglată în jos la păsările HESM, dar la tratamentul cu LPS expresia sa a fost semnificativ mai mare comparativ cu martorii (Fig. 5). Nu au existat modificări în expresiile IFN-ᵧ sau IL-12. Expresia TGF-β a arătat o scădere semnificativă prin tratamentul cu LPS atât în ​​grupurile de control, cât și în cele alimentate cu supliment HESM, în timp ce VEGF a fost reglat în jos la păsările HESM, indiferent de tratamentul LPS.

Expresia genelor splenice cuantificate prin RT-PCR la păsările hrănite cu sau fără HESM și tratate cu LPS sau soluție salină timp de 4 ore (n = 6).

Barele cu alfabete diferite sunt semnificativ diferite (p≤0,05).

Barele cu alfabete diferite sunt statistice diferite (P ≤ 0,05).

Barele cu alfabete diferite sunt statistice diferite (P ≤ 0,05).

Histologie

Nu au existat diferențe în sănătatea intestinală generală între păsările de control și dieta HESM alimentate cu păsările judecate în funcție de morfologia villusului, muscularis și depunerea de mucus (S1 Fig).

Discuţie

Rezultatele noastre arată că hrănirea cu HESM poate fi benefică pentru pui, în special scăderea stresului și îmbunătățirea rezistenței la modificările induse de LPS. Aceste rezultate sunt în concordanță cu raportul nostru anterior, în care membranele cu coajă de ou (ESM) de la ouă proaspete nefertilizate au îmbunătățit performanța puilor de 3 săptămâni în ceea ce privește greutatea corporală, corticosteronul reglat în jos și alți parametri de stres [14]. În studiul anterior cu ESM proaspăt ca supliment, am observat o creștere a nivelurilor serice atât de IgG, cât și de IgM la 3 săptămâni după hrănire, dar în studiul actual nivelurile de IgM nu păreau să fie afectate, ceea ce se poate datora timpului de prelevare ulterior de 5 săptămâni în care răspunsul timpuriu la antigeni s-a potolit [27-29]. Cu toate acestea, cauza reglării descendente a IgG la păsările tratate cu HESM nu este înțeleasă.

Pierderea în greutate este un semn distinctiv al endotoxemiei atât la mamifere, cât și la păsări, care este mediată prin mai multe citokine pro inflamatorii, cum ar fi IL-1, IL-6 și TNF-α [30-33]. Aceste citokine nu numai că provoacă hipofagie, dar promovează și catabolismul proteinelor, ducând la pierderea BW [34]. HESM pare să reducă efectul pierderii în greutate indusă de endotoxină, modificând expresia genelor citokinei splenice care sunt asociate cu inflamația [35-39]. Nu a existat doar reglarea descendentă a corticosteronului seric, ci și un alt raport de stres heterofil la limfocite [40] la păsările hrănite cu HESM, care ar putea explica performanța îmbunătățită și rezistența lor la endotoxină. Glucocorticoizii sunt nu numai anti-anabolizanți, ci și imunosupresori [41]. Stresul mai scăzut poate îmbunătăți hrănirea și reduce sensibilitatea la agenții patogeni la păsările de curte [42]. Cu toate acestea, mecanismul prin care ESM reduce parametrii de stres nu este înțeles, deoarece efectul pare să persiste dincolo de întreruperea alimentării cu HESM. În mod ipotetic, un nivel seric scăzut de steroizi suprarenali poate fi de așteptat la epuizarea endocrină în condiții precum endotoxemia cronică. Cu toate acestea, puii hrăniți cu HESM nu au prezentat niciun semn de boală judecat din BW, patologia intestinală și profilurile sanguine.

Din discuția de mai sus, este evident că suplimentul HESM de hrănire după trapă este benefic pentru găini, deoarece le poate îmbunătăți bunăstarea și rezistența la efectele nocive ale LPS. Nu se cunoaște dacă efectele se datorează proteinelor și peptidelor bioactive sau altor factori. Se știe foarte puțin dacă și cum proteinele bioactive asociate alimentelor influențează imunitatea, deoarece multe păsări și mamifere omnivore se bazează pe surse de proteine ​​proaspete pentru nutriția lor timpurie, care pot asigura condiționarea epigenetică a sistemului imunitar și își pot construi rezistența împotriva contagiunilor comune. Sistemul imunitar postnatal fiind imatur, dar plastic, oferă cu siguranță o oportunitate pentru modularea nutrițională de a construi o imunitate mai bună [58]. În concluzie, rezultatele noastre arată că suplimentul HESM poate fi un aditiv durabil pentru furaje pentru a îmbunătăți imunitatea și fiziologia sănătății păsărilor de curte.