Rakesh K. Bijarnia

1 Departamentul de Nefrologie, Hipertensiune și Farmacologie Clinică, Spitalul Universitar și Universitatea din Berna, Inselspital, Berna, Elveția,

tiosulfatul

2 Departamentul de cercetare clinică, Spitalul Universitar și Universitatea din Berna, Inselspital, Berna, Elveția,

Matthias Bachtler

1 Departamentul de Nefrologie, Hipertensiune și Farmacologie Clinică, Spitalul Universitar și Universitatea din Berna, Inselspital, Berna, Elveția,

2 Departamentul de cercetare clinică, Spitalul Universitar și Universitatea din Berna, Inselspital, Berna, Elveția,

Prakash G. Chandak

1 Departamentul de Nefrologie, Hipertensiune și Farmacologie Clinică, Spitalul Universitar și Universitatea din Berna, Inselspital, Berna, Elveția,

2 Departamentul de cercetare clinică, Spitalul Universitar și Universitatea din Berna, Inselspital, Berna, Elveția,

Harry van Goor

3 Departamentul de patologie și biologie medicală, Universitatea din Groningen, Centrul medical universitar Groningen, Groningen, Olanda,

Andreas Pasch

1 Departamentul de Nefrologie, Hipertensiune și Farmacologie Clinică, Spitalul Universitar și Universitatea din Berna, Inselspital, Berna, Elveția,

2 Departamentul de cercetare clinică, Spitalul Universitar și Universitatea din Berna, Inselspital, Berna, Elveția,

Conceput și proiectat experimentele: RB AP. Realizarea experimentelor: RB MB PC. Analiza datelor: RB HvG AP. Reactivi/materiale/instrumente de analiză contribuite: RB HvG MB AP. Am scris lucrarea: RB AP.

Date asociate

Toate datele relevante se află în hârtie și în fișierele sale de informații de suport.

Abstract

fundal

Hiperoxaluria determină depunerea cristalelor în rinichi, ceea ce duce la stres oxidativ și la rănirea și deteriorarea epiteliului renal. Tiosulfatul de sodiu (STS, Na2S2O3) este un anti-oxidant, care a fost utilizat în medicina umană de zeci de ani. Efectul STS asupra leziunilor renale induse de hiperoxalurie nu este cunoscut.

Metode

Hiperoxaluria și leziunile renale au fost induse la șobolani Wistar masculi sănătoși prin expunerea cronică la etilen glicol (EG, 0,75%) în apa de băut timp de 4 săptămâni. Efectele tratamentului ale STS, NaCl sau Na2SO4 au fost comparate. Mai mult, efectele STS asupra stresului oxidativ indus de oxalat au fost investigate in vitro în celulele renale LLC-PK1.

Rezultate

Expunerea cronică la EG a condus la hiperoxalurie, stres oxidativ, cristalurie de oxalat de calciu și depunere de cristal în rinichi. În timp ce toți compușii testați au redus semnificativ încărcătura cristalină, numai tratamentul STS a menținut activitatea superoxidului dismutazei tisulare și nivelurile de 8-izoprostaglandină din urină in vivo și a păstrat funcția renală. În studiile in vitro, STS a arătat capacitatea de a elimina în mod dependent doza de acumulare de ROS indusă de oxalat, reducerea peroxidului de hidrogen eliberat de celule și activitatea conservată de superoxid dismutază. Ca mecanism care explică această constatare, STS a reușit să inactiveze în mod direct peroxidul de hidrogen în experimente fără celule.

Concluzii

STS este un antioxidant, care păstrează funcția renală într-un model de șobolan EG cronic. Trebuie luată în considerare utilizarea sa terapeutică în insuficiența renală indusă de stresul oxidativ.

Introducere

Oxalatul este un produs final metabolic, care este excretat cu urina. În caz de aport alimentar excesiv sau de supraproducție patologică (de exemplu, datorită hiperoxaluriei primare, hiperoxaluriei enterice, toxicității EG sau ingestiei excesive de vitamina C), cristalele de oxalat de calciu precipită pe tot corpul. Rinichii sunt cei mai vulnerabili la aceste cristale, care duc la nefrolitiază, nefrocalcinoză și insuficiență renală [1]. Concentrațiile ridicate de oxalat provoacă stres oxidativ, epuizare antioxidantă și leziuni ale epiteliului renal [2, 3]. Oxidanții din hiperoxalurie par a fi în principal derivați din mitocondrii [4] și, prin urmare, afectează sistemele de apărare intracelulară antioxidantă, inclusiv activitatea enzimelor precum superoxidul dismutază (SOD) și catalaza (CAT) [3, 5].

Tiosulfatul de sodiu (Na2S2O3, STS) este o sare de sulf, utilizată de decenii în medicina umană pentru tratamentul intoxicațiilor cu cianură. Mai mult, diverse rapoarte clinice de caz indică faptul că STS prezintă proprietăți de prevenire a calcificării [6, 7] și reduce mineralizarea fosfatului de calciu la oamenii care suferă de calcifilaxie [8], la șobolanii uremici tratați cu adenină [9] și la șobolanii hipercalciurici genetic [10] . Aceste proprietăți anticalcifiante ale STS sunt potențial legate de efectele sale antioxidante [11]. În ciuda acestei capacități de a preveni calcificarea, LaGrange și colegii [12] au raportat că STS nu a avut niciun efect semnificativ asupra cristaluriei și precipitațiilor de oxalat de calciu într-un model de șobolan cu nefropatie acută de oxalat de calciu indusă de EG și NH4Cl. Motivul pentru care nu s-a observat un efect benefic al STS în acest model nu a fost elucidat, dar s-ar fi putut datora naturii acute, severe și ireversibile care dăunează rinichilor acestui model.

Prin urmare, am emis ipoteza că STS ar putea avea efecte benefice într-un model cronic și modest de stres oxidativ indus de oxalat și leziuni renale [3, 13].

Pentru a testa această ipoteză, am expus șobolanii masculi Wistar la 0,75% EG în apa de băut timp de 28 de zile. În aceste 4 săptămâni, șobolanii au primit injecții intraperitoneale (i.p.) fie cu STS, NaCl (SC), fie cu Na2SO4 (SS). Mai mult, efectul STS asupra stresului oxidativ a fost investigat folosind un sistem in vitro de celule LLC-PK1 tubulare proximale.

Material si metode

Studiu pe animale

Animalele au fost achiziționate din Charles River, Germania, iar experimentele au fost efectuate cu toate permisiunile solicitate de autoritățile elvețiene (Sekretariat Tierversuche Herrengasse 1, 3011, Berna, Elveția, numărul permisului BE87/11). Șobolanii masculi Wistar (n = 40) care cântăresc între 100 și 150 g au fost împărțiți în mod aleatoriu în cinci grupuri de câte opt animale fiecare. Grupa I (martor) a primit apă normală de șobolan și apă potabilă și niciun tratament suplimentar. Grupurile II până la V au primit etilen glicol (EG, Fluka) la o doză de 0,75% (v/v) cu apă potabilă. Grupul III (EG + STS) a fost în plus tratat cu tiosulfat de sodiu (Dr. Franz Köhler Chemie GmbH, Bensheim, Germania), la o doză de 0,4 g/kg greutate corporală de trei ori pe săptămână. Grupul IV (EG + SC) și Grupul V (EG + SS) au primit i.p. injecții cu clorură de sodiu și respectiv sulfat de sodiu la doze de 0,4 g/kg greutate corporală de trei ori pe săptămână. Toate tratamentele au fost continuate timp de 28 de zile. Urina de 24 de ore a fost colectată în cuști metabolice în săptămânile 0, 2 și 4. În ziua sacrificiului, sângele a fost extras și ambii rinichi au fost îndepărtați și fixați în formaldehidă tamponată. O parte din țesut a fost înghețat în azot lichid și depozitat la -80 ° C până la utilizare ulterioară. Animalele au fost ucise printr-o injecție intraperitoneală de supradozaj de pentobarbitali de sodiu.

Biochimia urinei și a serului

Calciul și creatinina din urină și ser au fost măsurate folosind kituri de testare a calciului și creatininei (QuantiChrome, DICA-500 și DICT-500). Oxalatul urinar a fost măsurat prin HPLC în unitatea de chimie clinică de la Spitalul Universitar din Berna. Kitul OxiSelect 8-iso-Prostaglandin F2a ELISA (Cell Biolabs, INC., STA 337) a fost utilizat pentru a măsura 8-IP în urină.

Prelucrarea țesutului renal

Pentru a măsura activitățile enzimelor superoxid dismutază (SOD) și catalază (CAT) [15], țesutul renal a fost introdus imediat în PBS conținând 0,5 mg/ml hidroxitoluen butilat (BHT) pentru a evita oxidarea și apoi a fost omogenizat pe gheață uscată. Activitatea SOD și CAT a fost măsurată folosind kituri de la Sigma (nr. Cod 19160) pentru SOD și, respectiv, de la BioVision (nr. K-773) pentru CAT, respectiv.

Cultură de celule

Linia de celule renale tubulare proximale porcine LLC-PK1 a fost obținută din colecția American Type Culture Collection (CL-101). Celulele au fost menținute în baloane T de 75 cm 2 Falcon în DMEM (pH 7,4) conținând 10% ser fetal bovin, mediu esențial minim (1%), piruvat de sodiu (1 mM), streptomicină (0,1 mg/ml) și penicilină (100 UI/ml) la 37 ° C și 5% CO2. Pentru experimente, au fost utilizate monostraturi confluente și toate experimentele au fost efectuate în PBS sau în medii DMEM fără ser și piruvat. Pentru a evita confuziile, interacțiunile potențiale ale STS cu kiturile și substanțele chimice utilizate au fost excluse cu atenție.

Captarea STS în celulele LLC-PK1

Pentru acest experiment, celulele LLC-PK1 au fost păstrate în 100 μM STS pentru diferite perioade de timp și concentrația STS în supernatant a fost măsurată prin HPLC [16].

Studii de toxicitate STS

Celulele confluente LLC-PK1 cultivate în plăci cu 48 de godeuri timp de 24 de ore au fost utilizate pentru studii de toxicitate. STS (20 mM) a fost adăugat la aceste celule timp de 6 și 24 de ore în mediu fără ser. După tratament, celulele au fost fixate (4% formaldehidă timp de 1 oră) și s-a folosit o colorant de proteină colorant-sulforodamină (0,057% sulforodamină în acid acetic 1%) pentru a determina viabilitatea acestora, prin expunerea la celule timp de 30 de minute. Înainte de a măsura absorbanța la 570 nm, celulele au fost spălate cu acid acetic 1% (de 4 ori), uscate la aer, dizolvate în 10 mM bază TRIS (pH 10,5) și au fost puse într-un agitator timp de 5 minute pentru dizolvarea completă a colorantului. Modificarea procentuală a absorbanței în raport cu martorul a fost calculată pentru toate probele.

Impactul STS asupra speciilor reactive de oxigen (ROS)

Pentru a măsura activitatea SOD, celulele LLC-PK1 au fost cultivate în plăci cu 6 godeuri (1x106 celule per godeu în 1 ml DMEM) timp de 24 de ore. Godeurile confluente de 70% au fost spălate cu PBS ușor și pretratate cu STS, SC sau SS (1 mM fiecare) timp de 12 ore. Oxalatul (2 mM) a fost dizolvat în mediu fără ser, fenol roșu și piruvat, amestecat cu STS, SC sau SS (1 mM) și ulterior adăugat la celule timp de 24 de ore. Mediul fără fenol roșu a fost utilizat pentru a evita interferențele cu kitul de testare SOD colorimetric (Sigma, 19160).

ROS au fost măsurate utilizând diacetat de 5- (și-6) -carboxi-2 ', 7'-difluorodihidrofluoresceină (Carboxy-H2DFFDA). Celulele LLC-PK1 au fost cultivate timp de 24 de ore în plăci cu 96 de godeuri (10 3 celule/ml, 200 pl mediu DMEM). Apoi, celulele au fost pretratate cu STS (1 mM), SC (1 mM) sau SS (1 mM) timp de 12 ore. După acest pre-tratament, oxalat (1 mM), STS (sau SC sau SS) și colorant Carboxy-H2DFFDA (10 μM) au fost adăugați simultan la celulele din PBS. După menținerea plăcii în întuneric pentru diferite intervale de timp, fluorescența a fost măsurată folosind un spectrofotometru Fluoroscan la o lungime de undă de excitație de 485 nm și o lungime de undă de emisie de 538 nm la intervale de o oră. Opt replici au fost utilizate pentru fiecare afecțiune.

Ca o abordare alternativă, conținutul de peroxid de hidrogen a fost determinat după expunerea la oxalat în prezența și absența tratamentelor. Celulele LLC-PK1 au fost cultivate în plăci cu 24 de godeuri (5x104 celule per godeu în 500μl DMEM) timp de 24 de ore urmate de pre-tratament cu STS, SC sau SS (1 mM fiecare) timp de 12 ore. Oxalatul (1 mM) a fost dizolvat în mediu fără ser, fenol roșu și piruvat, amestecat cu STS, SC sau SS (1 mM) și ulterior adăugat la celule timp de 72 de ore. Mediul fără fenol roșu a fost utilizat pentru a evita interferențele cu testul colorimetric de peroxid de hidrogen. După perioada de tratament, supernatantul celular a fost centrifugat la 9.500xg și peroxidul de hidrogen a fost determinat folosind un kit disponibil comercial (Biovision, K-265).

În plus față de experimentul de mai sus, interacțiunile directe ale STS, SS sau SC cu peroxid de hidrogen au fost testate într-un sistem fără celule. În acest scop, STS, SC sau SS (1-7 mM fiecare) au fost dizolvate în 10 ml PBS (10 mM) conținând 50 mM H2O2. După 3 ore la temperatura camerei, s-au măsurat modificările concentrației de H2O2.

analize statistice

Diferențele dintre grupurile de animale au fost analizate și toate graficele au fost reprezentate grafic folosind software-ul GraphPad (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, SUA). Toate rezultatele, inclusiv graficele din figuri, sunt date ca mijloace ± s.d. și analiza statistică a fost făcută de Student t-test, analiza Mann Whitney și analiza unică a varianței (ANOVA) cu testele de comparație multiple ale lui Bonferroni, după caz.

Rezultate

Efectele STS într-un model in vivo de stres oxidativ

Folosind un model cronic de stres oxidativ indus de hiperoxalurie de șobolan, s-au studiat efectele tiosulfatului de sodiu (Na2S2O3, STS), clorurii de sodiu (NaCl, SC) și sulfatului de sodiu (Na2SO4, SS) asupra funcției renale, a histologiei renale și a stresului oxidativ. . În acest scop, urina și sângele au fost colectate la 0, 2 și 4 săptămâni de tratament cu 0,75% EG în apa de băut și șobolanii sacrificați și histologia renală analizată la 4 săptămâni. Pe tot parcursul experimentului, toate animalele s-au comportat normal și păreau sănătoase, cu excepția unui animal din grupul SS, care a murit fără un motiv detectabil. Greutatea corporală a fost comparabilă în toate grupurile (Fig. 1A).