Conceptualizare roluri, curatare date, analiză formală, investigație, metodologie, administrare proiect, supraveghere, scriere - proiect original

recombinant

Colegiul de afiliere pentru științe ale vieții, Universitatea Agricolă Anhui, Hefei, provincia Anhui, Republica Populară Chineză

Roluri Arhivarea datelor, Analiza formală, Metodologie

Afiliere Centru de cercetare științifică, Colegiul medical Benbu, Benbu, provincia Anhui, Republica Populară Chineză

Roluri Curarea datelor

Colegiul de afiliere pentru științe ale vieții, Universitatea Agricolă Anhui, Hefei, provincia Anhui, Republica Populară Chineză

Roluri Conceptualizare, resurse

Afiliere AnHui Anke Biotechnology (Group) Co., Ltd. Hefei, provincia Anhui, Republica Populară Chineză

Roluri Conceptualizare, achiziție de fonduri, resurse

Afiliații Colegiul de Științe ale Vieții, Anhui Agricultural University, Hefei, provincia Anhui, Republica Populară Chineză, AnHui Anke Biotechnology (Group) Co., Ltd. Hefei, provincia Anhui, Republica Populară Chineză

  • Lianping Wei,
  • Jianrong Chang,
  • Zhen Han,
  • Ronghai Wang,
  • Lihua Song

Cifre

Abstract

Citare: Wei L, Chang J, Han Z, Wang R, Song L (2019) Tratamentul cu hormon de creștere uman recombinant (rhGH) al șoarecilor cu xenogrefă MKN-45 îmbunătățește starea nutrițională și întărește funcția imună fără a promova creșterea tumorii. PLoS ONE 14 (1): e0210613. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0210613

Editor: Aamir Ahmad, Universitatea din South Alabama Mitchell Cancer Institute, STATELE UNITE

Primit: 7 mai 2018; Admis: 30 decembrie 2018; Publicat: 23 ianuarie 2019

Disponibilitatea datelor: Toate datele relevante se găsesc în lucrare.

Finanțarea: Această lucrare a fost susținută de Proiectul de cercetare în științe naturale al universităților din Anhui (http://202.38.95.119/srmis), numărul de atribuire KJ2017A148 pentru L.W.; și proiectul Laboratorului cheie de stat de biologie a culturilor de la Universitatea Agricolă din Anhui (https://kjc.ahau.edu.cn), numărul de atribuire 2014KQJ007 către L.W. Autorii Ronghai Wang și Lihua Song sunt angajați de An Hui Anke Biotechnology (Group) Co., Ltd. An Hui Anke Biotechnology (Group) Co., Ltd a oferit asistență sub formă de salarii autorilor R.W. și L.S., dar nu au avut niciun rol suplimentar în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului. Rolurile specifice ale acestor autori sunt articulate în secțiunea „contribuțiile autorului”.

Interese concurente: Autorii R.W. și L.S. sunt angajați ai An Hui Anke Biotechnology (Group) Co., Ltd. Ceilalți autori nu au interese concurente de declarat. Acest lucru nu modifică aderarea noastră la politicile PLOS ONE privind schimbul de date și materiale.

Introducere

Cașexia cancerului este un sindrom metabolic complex caracterizat prin scăderea în greutate, consum redus de alimente și malnutriție severă [1-3]. În plus, acest sindrom este întotdeauna asociat cu afectarea funcției fizice, capacitatea redusă de reacție la terapiile antineoplazice, scăderea calității vieții și creșterea ratelor de morbiditate și mortalitate [4-5]. Aproximativ 60% până la 80% dintre pacienții cu cancer avansat suferă de cașexie canceroasă, iar acest raport este mai mare la pacienții cu cancer gastric [6-7]. Cu toate acestea, terapia anticachectică convențională cu suport nutrițional nu este eficientă, prin urmare, este important ca pacienții cu cancer gastric să identifice noi modalități de a depăși cașexia cancerului [8-9].

Hormonul de creștere (GH) este o peptidă de 191-aminoacizi eliberată în mod natural de glanda pituitară anterioară, care joacă un rol semnificativ în reglarea metabolismului substratului și a compoziției corpului la om [10]. GH este un agent anabolic puternic care poate inversa multe anomalii nutriționale și metabolice asociate cu stări catabolice severe [11-12]. Similar cu GH, GH recombinant uman (rhGH), care este produs prin tehnologia ADN-ului recombinant, s-a dovedit că stimulează sinteza proteinelor musculare, îmbunătățește echilibrul azotului, promovează vindecarea rănilor și întărește sistemul imunitar. În prezent, rhGH a fost aprobat de Administrația SUA pentru Alimente și Medicamente pentru utilizarea în risipa HIV/SIDA și sindromul de intestin scurt dependent de nutriția parenterală [13]. Cu toate acestea, rhGH nu este utilizat la pacienții cu cancer avansat, deoarece rhGH a fost asociat cu un risc crescut de cancer [14-18]. Ca mitogen, rhGH poate promova reînnoirea celulelor și crește transformarea malignă prin legarea la receptorul GH (GHR) de pe suprafața celulei tumorale, rezultând activarea diferitelor căi de semnalizare [19-22]. Prin urmare, este necesar să se evalueze riscurile și beneficiile tratamentului cu rhGH la pacienții cu cancer gastric.

Scopul acestui studiu a fost de a clarifica efectele combinate ale rhGH asupra creșterii tumorii, stării nutriționale și funcției imune la șoarecii purtători de tumori MKN-45. În același timp, relațiile doză-efect au fost investigate în mod cuprinzător. Pe baza acestor rezultate, am evaluat beneficiile și riscurile tratamentului cu rhGH la șoarecii purtători de tumori MKN-45.

Materiale și metode

Liniile celulare și cultura

Celulele liniilor celulare ale cancerului gastric uman SGC-7901, MGC-803 și MKN-45 au fost achiziționate de la Academia Chineză de Științe Medicale. Celulele au fost cultivate în RPMI 1640 (HyClone Laboratories, Logan, SUA) suplimentat cu 10% ser fetal bovin (FBS; HyClone Laboratories, Logan, SUA) și 1% soluție de penicilină-streptomicină (HyClone Laboratories, Logan, SUA). Celulele au fost incubate în condiții de umidificare la 37 ° C și 5% CO2.

Experiment pe animale

Șoareci femele BALB/c nud (SPF, greutate: 16-18 g) au fost achiziționați de la Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Beijing, China; SCXK2012-0001). Toți șoarecii au fost menținuți cu alimente și apă sterilizate și au fost adăpostiți la șase șoareci pe cușcă în cuști standard din policarbonat cu temperatură și umiditate controlate și un ciclu de lumină și întuneric de 12 ore. Șoarecii au fost lăsați să se acomodeze cu condițiile de laborator timp de 7 zile înainte de experimentare. Toate procedurile au fost efectuate în strictă conformitate cu recomandările din Ghidul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator ale Anhui Anke Biotechnology (Group) Co., Ltd. Aceste linii directoare au îndeplinit standardele etice referitoare la animalele experimentale din China, așa cum prevede legea. Protocolul a fost aprobat de Comitetul pentru etica experimentelor pe animale din Anhui Anke Biotechnology (Group) Co., Ltd. (Număr protocol: AK-20151225). S-au făcut toate eforturile pentru a minimiza suferința.

Test de tumoră xenogrefă la șoarece nud

Celulele MKN-45 (1 × 107 in 100 μLof mediu) au fost inoculate subcutanat în axila din față dreaptă a șoarecilor goi. Când volumele tumorale au atins aproximativ 100-200mm 3, șoarecii au fost randomizați în patru grupuri cu șase șoareci per grup: grupul cu doză mică a primit 2 UI/kg (0,67 mg/kg) greutate corporală rhGH (Anhui Anke Biotechnology (Group) Co., Ltd. Anhui, China) zilnic; grupul cu doză medie a primit 10 UI/kg (3,35 mg/kg) greutate corporală rhGH zilnic; grupul cu doză mare a primit 50 UI/kg (16,75 mg/kg) greutate corporală rhGH zilnic; iar grupul de control a primit ser fiziologic zilnic. Volumul tumorii, greutatea corporală și aportul alimentar au fost măsurate la fiecare două sau trei zile. Volumele tumorale au fost determinate folosind următoarea formulă: volum = lungime × lățime 2 × 0,5. După 14 zile, șoarecii au fost anesteziați prin inhalarea a 1,0-2,5% izofluran și sângele a fost colectat din inimă. Șoarecii anesteziați au fost sacrificați prin asfixierea cu dioxid de carbon. Tumorile au fost izolate, cântărite și congelate imediat în azot lichid. Greutatea corporală fără tumori la ultimul moment a fost calculată folosind următoarea formulă: greutatea corporală fără tumoră = (greutatea corporală cu tumoră) - (greutatea tumorii).

Colorarea HE și testul IHC pentru țesuturile tumorale

După ce țesuturile tumorale au fost izolate de la șoareci, acestea au fost fixate în paraformaldehidă 4%, încorporate în parafină și tăiate în secțiuni de 4 μm. Secțiunile au fost apoi parafinizate și colorate cu hematoxilină și eozină (HE). Pentru analiza imunohistochimiei (IHC), secțiunile tumorale (4 μm grosime) au fost blocate și incubate cu anticorpi împotriva Ki-67 (Abcam, Massachusetts, SUA), factor de creștere endotelială vasculară (VEGF: Boster Biological Company of China, Wuhan, China) și CD31 (Boster Biological Company of China, Wuhan, China) peste noapte la 4 ° C. Ulterior, imunocolorarea a fost realizată conform protocolului standard al kitului de substrat DAB (ZhongshanJinqiao Corp. Beijing, China). Secțiunile au fost contracolorate cu HE și analizate la microscopul de fluorescență Nikon80i (Tokyo, Japonia). Celulele pozitive au fost colorate maro în membrană sau citoplasmă. Procentul de celule pozitive a fost cuantificat utilizând sistemul de analiză morfologică a imaginii JEOR 801D (versiunea 6.0).

Western blot

Au fost măsurate nivelurile de expresie ale GHR și ale liniilor celulare SGC-7901, MGC-803 și MKN-45 și ale proteinelor JAK2, pJAK2, STAT3, pSTAT3, ERK, pERK, AKT și pAKT în celulele de control sau celule tratate cu rhGH. prin Western Blot. Metoda Western Blot este efectuată conform lui Jiang et al [26]. Densitățile optice relative ale benzilor au fost cuantificate utilizând software-ul Quantity One. Toate analizele Western blot au fost efectuate de cel puțin trei ori.

Analiza FACS a activității celulelor NK

Activitatea celulelor NK a celulelor mononucleare din sângele periferic (PBMCs) la șoarecii xenogrefă MKN-45 a fost detectată prin sortarea celulelor activate prin fluorescență (FACS). La sfârșitul experimentului, șoarecii au fost sacrificați și sângele periferic a fost colectat. Globulele roșii din sânge au fost îndepărtate din sângele periferic folosind un reactiv de lizare a globulelor roșii din sânge întreg, iar PBMC-urile au fost colectate. PBMC-urile au fost incubate cu anticorpi monoclonali conjugați cu fluorocrom, inclusiv CD314 APC anti-șoarece (eBioscience, CA, SUA) și anti-mouse pan-NK Cells PE (eBioscience, CA, SUA), timp de 30 de minute în întuneric la 4 ° C. Procentul de celule NK active ale PBMC a fost evaluat prin citometrie în flux (Beckman FC 500, CA, SUA) și analizat utilizând Flow Jo Software (versiunea 7.6).

analize statistice

Datele sunt prezentate ca medie ± SEM. Semnificația statistică a diferenței dintre grupurile de control și de tratament cu rhGH a fost determinată de testul t Student. Valori ale p Fig 1. Efectul rhGH asupra creșterii tumorilor xenogrefei MKN-45.

(A) Expresia GHR în trei linii celulare de carcinom gastric. (B) Imagini reprezentative ale tumorilor din fiecare grup. (C) Curba de creștere a volumului tumorii în fiecare grup. (D) Greutatea tumorii în fiecare grup. Volumele tumorale au fost măsurate în fiecare grup la momentele indicate cu diferite tratamente. Datele sunt prezentate ca medie ± SEM (n = 6 șoareci/grup). * p Fig 2. Analiza HE și IHC a tumorilor cu xenogrefă MKN-45.

(A) Fotomicrografii reprezentative ale secțiunilor tumorale de xenogrefă MKN-45 colorate de HE (200 × măriri originale: săgețile verzi reprezintă mitozele celulelor tumorale; săgețile roșii reprezintă vasele de sânge din interiorul tumorii). (B) Fotomicografii reprezentative ale expresiei Ki-67, VEGF și CD31 în secțiuni tumorale MKN-45 xenogrefă (mărire originală 200 ×; săgețile roșii reprezintă expresia VEGF-pozitivă; săgețile roșii reprezintă expresia CD31-pozitivă) (C) Cuantificarea Ki- 67, expresia VEGF și CD31 în țesutul tumoral. Datele sunt exprimate ca o histogramă a mediei ± SEM a trei experimente independente.

Efectul rhGH asupra căilor legate de GHR la șoarecii xenogrefa MKN-45

Pentru a confirma în continuare dacă rhGH poate activa căile legate de GHR in vivo, țesuturile tumorale cu xenogrefă MKN-45 au fost omogenizate, lizate și analizate prin Western blot (Fig. 3A). Similar cu rezultatele noastre in vitro, nu s-au găsit diferențe semnificative în expresia relativă a pJAK2/JAK2, pSTAT/STAT, pAKT/AKT și pERK/ERK între grupurile tratate cu rhGH și grupul de control (Fig 3B), sugerând că rhGH poate să nu activeze căile legate de GHR la șoarecii xenogrefă MKN-45, inclusiv căile de semnalizare pJAK2-STAT, MAPK-ERK și AKT-PI3K.

(A) Analiza Western blot a p-JAK2, JAK2, p-STAT3, STAT3, p-AKT, AKT, p-ERK și ERK în țesuturile tumorale cu xenogrefă MKN-45. (B) Analiza cantitativă a expresiei relative. Datele sunt exprimate ca o histogramă a mediei ± SEM a trei experimente independente.

Efectul rhGH asupra aportului alimentar și greutății corporale la șoarecii MKN-45 xenogrefă

Consumul redus de alimente și pierderea în greutate sunt cele mai proeminente caracteristici clinice ale cașexiei cancerului. Așa cum se arată în figura 4A, aportul de alimente la fiecare 48 de ore a scăzut treptat la șoarecii cu xenogrefă MKN-45. Cu toate acestea, comparativ cu cel din grupul de control NS, aportul de alimente în grupurile tratate cu rhGH a crescut. Aportul total de alimente timp de 14 zile în grupurile tratate cu rhGH la 2, 10 și 50 UI/kg greutate corporală a crescut cu 10,8%, 8,38% și, respectiv, 7,73%, comparativ cu cel din grupul de control NS (fig. 4B). Având în vedere consumul redus de alimente, greutatea corporală a șoarecilor cu xenogrefă MKN-45 din grupul de control NS a tins să scadă în timp. Cu toate acestea, șoarecii cu xenogrefă MKN-45 tratați cu rhGH au arătat o creștere semnificativă a greutății corporale comparativ cu cea din grupul de control NS (Fig 4C). Greutatea corporală fără tumori a șoarecilor tratați cu 2, 10 și 50 UI/kg corp greutatea rhGH după 14 zile de la prima administrare a crescut cu 13,1% (p Fig 4. Efectul rhGH asupra aportului de alimente și greutatea corporală la șoarecii cu xenogrefă MKN-45.

(A) Curba de aport alimentar la fiecare 48 de ore în fiecare grup. (B) Aportul alimentar timp de 14 zile în fiecare grup după prima administrare de rhGH. (C) Curba greutății corporale în fiecare grup. (D) Greutatea corporală fără tumori în fiecare grup. Datele sunt exprimate ca medie ± SEM (n = 6 șoareci/grup). * p Fig 5. Efectul rhGH asupra activității NK a PBMCs la șoarecii xenogrefă MKN-45.