Abstract

fundal

Acizii grași n3-polinesaturați cu lanț lung (LC n3-PUFA) sunt bine cunoscuți pentru activitatea lor antiinflamatorie și impactul lor asupra bolilor cardiovasculare. Uleiul de balenă presat la rece (CWO) are jumătate din cantitatea de LC n3-PUFA în comparație cu uleiul de ficat de cod (CLO). Cu toate acestea, au fost observate efecte benefice mai pronunțate asupra markerilor bolilor cardiovasculare din aportul de CWO comparativ cu aportul de CLO în studiile de intervenție la om. Extractele din CWO private de acizi grași s-au dovedit a avea efecte antioxidante și antiinflamatoare in vitro. Scopul acestui studiu a fost să investigheze dacă aportul unei diete bogate în grăsimi de tip occidental (WD) suplimentată cu CWO ar împiedica dezvoltarea leziunilor aterosclerotice la șoarecii cu deficit de apolipoproteină (ApoE -/-).

Metode

Șaptezeci de șoareci femele ApoE -/- au fost hrăniți cu un WD conținând 1% CWO, CLO sau ulei de porumb (CO). Au fost evaluate formarea leziunilor aterosclerotice, greutățile corpului și țesuturilor, expresia genei hepatice împreună cu nivelurile serice de LDL/VLDL-colesterol, ox-LDL, starea antioxidantă totală și diferiți markeri serici ai bolilor cardiovasculare/proinflamatorii. Analizele statistice au fost efectuate folosind SPSS, iar testul lui Shapiro-Wilk a fost efectuat pentru a determina distribuția variabilelor. Diferența statistică a fost evaluată utilizând ANOVA unidirecțional cu testul post hoc al lui Tukeys sau testul Kruskal-Wallis. Expresia genei relative hepatice a fost analizată cu REST 2009 (V2.0.13).

Rezultate

Șoarecii hrăniți cu CWO au avut mai puține leziuni aterosclerotice în arcada aortică comparativ cu șoarecii hrăniți cu CO. Nivelurile de colesterol LDL/VLDL și ox-LDL-colesterol au fost, de asemenea, reduse semnificativ, în timp ce nivelurile totale de antioxidanți au fost îmbunătățite la șoarecii hrăniți cu CWO comparativ cu șoarecii hrăniți cu CO. În plus, șoarecii hrăniți cu CWO au câștigat mai puțină greutate și mai multe gene hepatice implicate în metabolismul colesterolului au fost reglate în sus comparativ cu șoarecii hrăniți cu CO.

Concluzie

În studiul de față șoarecii hrăniți cu WD suplimentat cu 1% CWO au redus formarea leziunilor aterosclerotice în arcada aortică, au redus colesterolul LDL/VLDL seric și colesterolul ox-LDL, au crescut starea antioxidantă totală a serului și au redus greutatea corporală comparativ cu șoarecii alimentat cu un WD suplimentat cu 1% CO.

fundal

Ateroscleroza se caracterizează prin leziuni lipidice arteriale în intima arterelor mari și boala poate fi tăcută sau fără simptome timp de decenii. Cu toate acestea, ateroscleroza este principala cauză principală a mai multor alte boli cardiovasculare (BCV), cum ar fi angina instabilă, infarctul miocardic și accidentul vascular cerebral. Anii de acumulare de lipide în peretele vascular determină formarea plăcii și îngustarea lumenului. Ruptura plăcii poate duce în cele din urmă la aterotromboză acută, prevenind un flux sanguin adecvat către țesuturile pulmonare, cardiace și cerebrale [1, 2]. Legătura dintre ateroscleroză și inflamație a fost elucidată în mod cuprinzător [3,4,5,6,7], iar mai multe citokine și chimiocine sunt factorii cheie în progresia aterosclerotică [8,9,10,11]. Efectele antiinflamatorii ale acizilor grași n3-polinesaturați cu lanț lung (LC n3-PUFA) sunt bine cunoscute. În special acidul eicosapentaenoic (EPA) și acidul docosahexaenoic (DHA) și modul în care acestea contribuie la atenuarea progresiei aterosclerotice la pacienții coronarieni [12,13,14,15,16,17]. Peștele gras este o bună sursă dietetică de EPA și DHA. Peștele conține, de asemenea, alți constituenți, cum ar fi proteine, aminoacizi, peptide și compuși bioactivi, care pot contribui la efectele benefice observate după consumul de pește [18,19,20].

Balena comună comună (Balaenoptera acutorostrata) se hrănește cu crustacei și pești pelagici în Atlanticul de Nord [21], iar stratul lor gros de grăsime este vital pentru izolația termică, flotabilitatea și stocarea energiei [22]. Grăsimea a fost o parte importantă a dietei pentru indigenii din regiunile arctice și subarctice de secole. În urmă cu două decenii, uleiul de balenă presat la rece (CWO) și uleiul de ficat de cod (CLO) au fost administrate ca suplimente alimentare persoanelor sănătoase ca parte a unui studiu mai amplu [23, 24]. Rezultatele au indicat faptul că grupul CWO a avut un efect benefic asupra markerilor CVD și a îmbunătățit efectul inflamator, de asemenea, în comparație cu grupul CLO. Compoziția acidului gras (FA) a CWO și CLO diferă prin cantitatea de LC n3-PUFA. Grăsimea de balenă are 10,3% LC n3-PUFA, inclusiv 3,3% EPA, 1,7% acizi docosapentaenoici (DPA) și 4,7% DHA în timp ce CLO are 25,1% LC n3-PUFA, inclusiv 9,5% EPA, 1% DPA și 13,5% DHA în CLO [24]. Recent, am demonstrat într-un studiu in vitro cu CWO lipsit de acizi grași, că CWO conținea antioxidanți extractibili și avea activități antiinflamatorii asociate cu compuși (i) neidentificați până acum [25].

În studiul de față, am investigat dacă aportul unei diete bogate în grăsimi de tip occidental (WD) suplimentată cu CWO sau ulei de balenă rafinat (RWO) în combinație cu extracte din grăsimea de balenă ar împiedica dezvoltarea leziunilor aterosclerotice în deficitul de apolipoproteină E (ApoE -/-) șoareci.

Metode

Animale experimentale și adăpostire

Șaptezeci și doi de șoareci femele ApoE -/- fără patogeni (B6.129P2-Apoe tm1 Unc N11) au fost achiziționate de la Taconic (Taconic M&B, Ry, Danemarca). După sosirea la unitatea locală pentru animale, toți șoarecii au fost alocați și alocați în mod aleatoriu în 6 grupuri (n = 12) cu un număr egal de cuști pe intervenție (n = 4 cuști/dietă). Datorită pierderii în greutate în timpul aclimatizării de o săptămână, doi șoareci au fost excluși (n = 11 în grupurile RWO-I și CWO). La începutul experimentului, șoarecii aveau vârsta de 6 săptămâni, cu o greutate corporală cuprinsă între 16 și 21 g. Șoarecii furnizați cu apă și furaje granulate ad libitum timp de 13 săptămâni au fost păstrați în cuști ventilate plasate în aceeași cameră într-o unitate convențională de animale de laborator. Temperatura și umiditatea relativă au fost de 21 ° C și 55% pe un ciclu de 12 zile/noapte (lumină: 0600 până la 1800 h). Cuștile și așternutul erau schimbate o dată pe săptămână. La sfârșitul studiului, toți șoarecii au fost lipsiți de hrană timp de 3 ore înainte de eutanasierea prin inhalare cu dioxid de carbon. Sângele a fost extras prin puncție cardiacă și serul a fost preparat și înghețat la - 80 ° C. Țesuturile cardiace, hepatice, renale, splenice și adipoase au fost disecate, cântărite, congelate și depozitate la - 80 ° C.

Prepararea uleiurilor alimentare

Dulapul proaspăt congelat de la balena comună comună a fost furnizat de Ellingsen Seafood AS (Skrova, Norvegia). Grăsimea a fost măcinată o dată înainte de centrifugare la Tabelul 1 Conținutul dietelor g/kg

Analiza plăcii aterosclerotice

Imediat după drenarea sângelui, toți șoarecii au fost perfuzați prin ventriculul stâng cu soluție salină sterilă (0,9%), până când nu s-a observat sânge rezidual în perfuzat (aproximativ 5 minute perfuzie). Întreaga aortă (ascendentă proximală a aortei până la bifurcația arterelor iliace) a fost curățată in situ de grăsime periadventitială, disecată și fixată în soluție de paraformaldehidă 1%. În cele din urmă, aorta a fost colorată prin colorare Oil Red O, deschisă longitudinal și în persoană-montat pe diapozitive așa cum s-a descris anterior [27]. După 48 de ore de odihnă, diapozitivele au fost scanate cu un scaner de înaltă rezoluție. Zonele leziunilor au fost evaluate utilizând software-ul ImageJ [28], iar extinderea aterosclerozei a fost raportată ca procent din suprafața totală a unei aorte date sau a unei regiuni aortice ocupate de leziuni aterosclerotice.

Extracția totală a ARN-ului

După perfuzarea șoarecilor, ficatul a fost îndepărtat, cântărit și înghețat în azot lichid înainte de depozitare la - 80 ° C până la extracție. O sută de mg de țesut hepatic a fost omogenizat în 1 ml de Trizol (Life Technologies) prin măcinarea mărgelelor (Precellys 24, Bertin Technologies). Probele au fost incubate pe gheață timp de 30 de minute urmate de centrifugare de 20 de minute la 12000 × g la 4 ° C. Probele au fost precipitate peste noapte cu izopropanol și centrifugate timp de 21.000 × g timp de 30 de minute la 4 ° C. Peletele au fost dizolvate în soluții de stocare a ARN-ului și ARN-ul a fost depozitat la - 80 ° C până la prelucrarea ulterioară. Concentrația totală de ARN a fost măsurată utilizând fluorometrul Qubit 1.0 (Life Technologies) și calitatea testată cu Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc). Factorul de integritate al ARN a fost de 7,6-9,3 pentru probele utilizate.

Transcriere inversă și PCR cantitativă în timp real

Setul de transcripție inversă cADN de mare capacitate (4.368.813, Applied Biosystems) a fost utilizat pentru a face 3 triplicați ai transcriptazei inverse (50 ng ARN total în 20 μl). RT-PCR cantitativ a fost utilizat pentru a analiza 4 μl ADNc per 20 μl de reacție folosind TaqMan® Fast Universal PCR Master mix (4.352.042, Applied Biosystems) și cu teste TaqMan® Gene Expression predefinite (Fișier suplimentar 1: Tabel S1). Plăcile cu 96 de godeuri au fost rulate la ciclorul rapid ABI Prism 7500 (Applied Biosystems) utilizând profilul de amplificare prestabilit (95 ° C 20s, 40 × 95 ° C 3 s și 60 ° C 30s). Cele mai stabilizate gene de referință endogene, Hipoxantina-guanina fosforibosiltransferaza 1 (Hprt1) și proteina de legare TATA-Box (Tbp), au fost selectate folosind testul de control endogen al mouse-ului TaqMan Array (4.426.701, Applied Biosystems). Media geometrică a acestor gene de referință a fost utilizată pentru a normaliza expresiile genetice. Calibratorul interplacă și controalele fără șablon au fost incluse în toate testele.

Analize serice

Colesterol seric, colesterol lipoproteic cu densitate scăzută și lipoproteină cu densitate foarte mică (LDL/VLDL), glucoză, triacilglicerol (TAG), concentrații totale de proteine, acid uric, acizi grași nesterificați (NEFA; D07940, Dialab, Austria) și total statusul antioxidant (TAS; NX2332 Randox Total Antioxidant Status, Randox Laboratories Ltd., UK) au fost analizate folosind kituri enzimatice convenționale și un bioanalizator MaxMat PLII (MaxMat PL, Montpellier, Franța). Cu excepția cazului în care se specifică altfel, toate kiturile provin de la MaxMat PL (Montpellier, Franța). LDL oxidat seric (Ox-LDL) a fost cuantificat în duplicat conform instrucțiunilor producătorilor cu un kit ELISA murin (E90527Mu, USCN Life Science Inc., Texas, SUA). Probele de ser au fost analizate în duplicate pentru următoarele citokine: interferon gamma (IFNγ), interleukină 10 (IL-10), interleukină 1 beta (IL-1β), interleukină 2 (IL-2), interleukină 5 (IL-5), interleukina 6 (IL-6), oncogene cu reglare a creșterii keratinocitelor (KC-GRO) și factorul de necroză tumorală alfa (TNF-α). Aceste analize au fost efectuate în conformitate cu instrucțiunile producătorilor folosind un kit MS-Mouse Pro-inflamator pentru panou MSD 1 (MULTI-ARRAY®, Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD).

Analize statistice

Toate analizele statistice au fost efectuate folosind IBM SPSS Statistics pentru Macintosh (versiunea 22.0.0.0, SPSS, Inc., Chicago, IL, SUA). Testul Shapiro-Wilk a fost efectuat pentru a determina distribuția variabilelor, iar variabilele distribuite în mod normal au fost transformate în jurnal înainte de analiza statistică. Diferența statistică a fost evaluată utilizând ANOVA unidirecțional cu testul post hoc al lui Tukeys sau testul Kruskal-Wallis. Expresia genei relative a fost analizată cu REST 2009 (V2.0.13) [29]. O valoare de p

Rezultate

Sănătatea fizică generală și creșterea în greutate au apărut normale pentru toți șoarecii, cu excepția unui șoarece hrănit cu CO (eutanasiat din cauza pierderii în greutate) în timpul celor 13 săptămâni cu diete experimentale. Aportul mediu zilnic de hrană (g/șoareci) a fost egal pentru toate cele 6 grupuri de dietă (Fig. 1). Cu toate acestea, șoarecii hrăniți cu CWO au câștigat mai puțină greutate corporală în comparație cu șoarecii hrăniți cu CO (Fig. 2a). Greutățile hepatice la șoarecii hrăniți cu CWO și RWO-II au fost mai mici decât greutățile hepatice la șoarecii hrăniți cu CO (Fig. 2b). Aceste diferențe semnificative au fost prezente și pentru greutățile hepatice relative. Cantitatea de țesut adipos alb a fost, de asemenea, mai mică la șoarecii hrăniți cu CWO comparativ cu șoarecii hrăniți cu CO (1,44 g ± 0,12 vs 2,24 ± 0,2 respectiv), totuși, nu este semnificativăp = 0,078). Nu au existat diferențe aparente în dimensiunile țesuturilor între grupurile pentru inimă, rinichi sau splină (Tabelul 2). Curbele de creștere pentru toate dietele experimentale sunt prezentate în Fig. 2c.

balenă

Consumul mediu zilnic de furaje (g/șoareci) de șoareci femele cu deficit de apolipoproteină E-hrănite cu diete bogate în grăsimi suplimentate cu uleiuri diferite timp de 13 săptămâni. Rezultatele sunt prezentate ca medie ± SD. CO (n = 11), CLOn = 12), RWOn = 12), RWO-In = 11), RWO-IIn = 12), CWOn = 11)

Leziuni aterosclerotice

Cinci șoareci au fost eliminați din setul de date pentru analize ale leziunilor aterosclerotice datorită artefactelor metodologice sau calcificării severe a aortei abdominale (de la arterele renale până la bifurcația iliacă), în ciuda formării minime a leziunilor în regiunea arcului aortic. Șoarecii omiși erau; trei șoareci hrăniți CLO (n = 9), un mouse a alimentat RWOn = 11) și un șoarece alimentat cu CWOn = 10). Zona leziunii din arcada aortică a fost mai mică la șoarecii hrăniți cu CWO comparativ cu zona leziunii arcului aortic la șoarecii hrăniți cu CO (Fig. 3a). Nu s-au observat diferențe semnificative între grupuri în alte regiuni ale aortei (partea abdominală, partea toracică sau chiar pentru aorta totală) (Fig. 3b-d, respectiv).

Starea antioxidantă serică, nivelurile serice de colesterol LDL/VLDL și nivelurile serice de ox-LDL

TAS seric a fost mai mare la șoarecii hrăniți cu CWO și RWO-II comparativ cu șoarecii hrăniți cu CO (Fig. 4a). TAS a fost, de asemenea, mai mare la șoarecii hrăniți cu RWO-I, RWO-II și CWO în comparație cu TAS la șoarecii hrăniți cu CLO (Fig. 4a). Nivelurile serice de colesterol LDL/VLDL și nivelurile serice de ox-LDL-colesterol au fost mai mici la șoarecii hrăniți cu RWO-I, RWO-II și CWO comparativ cu aceste niveluri la șoarecii hrăniți cu CO (Fig. 4b și c). Colesterolul total (Fig. 4d) și trigliceridele serice nu au diferit între șoarecii hrăniți cu CO și celelalte grupuri de dietă; nici nivelurile serice de glucoză sau citokine (Tabelul 2).

Expresia genelor

Discuţie

Scopul principal al acestui studiu a fost de a investiga dacă consumul alimentar de WD suplimentat cu CWO (dieta F) ar preveni dezvoltarea aterosclerotică la șoarecii ApoE -/-. Recent, grupul nostru a demonstrat că extractele din CWO au activități antioxidante și antiinflamatoare care nu au legătură cu conținutul de LC n3-PUFA prezent [25]. Când CWO a fost administrat ca supliment alimentar voluntarilor sănătoși, s-au observat efecte benefice asupra markerilor BCV și un efect antiinflamator îmbunătățit [23, 24]. Aici, WD a fost suplimentat cu 1% CWO sau 1% RWO îmbogățit cu două extracte diferite din balon de balenă folosind CO (dieta A) și CLO (dieta B) ca diete de control pe baza rezultatelor anterioare [23,24,25].

Datorită conținutului mai scăzut de EPA și DHA în grăsimea de balenă în comparație cu uleiurile de pește, ne-am așteptat și am observat niveluri serice de TAG nealterate. Nivelurile serice de TAG nealterate au fost observate în alte câteva studii în care șoarecilor ApoE -/- li s-au administrat cantități comparabile de EPA, DPA și DHA [38,39,40]. Reducerea eficientă a nivelurilor serice de TAG necesită suplimentarea EPA, DPA și DHA în doze farmaceutice, care poate fi dificil de obținut prin dietă [41]. Se știe că uleiul de balon de balenă conține cantități mari de DPA în comparație cu uleiul de pește, iar unele studii au indicat că DPA poate fi cel mai important LC n3-PUFA când vine vorba de protecția împotriva BCV [42, 43]. Luate împreună aceste constatări pot implica faptul că CWO dietetic promovează eliminarea colesterolului din circulație, clearance-ul crescut al colesterolului în ficat a crescut nivelurile de TAS, a redus oxidarea LDL-colesterolului, toate conducând la atenuarea aterosclerozei.

Concluzie

În studiul de față, am observat că șoarecii hrăniți WD cu 1% CWO aveau formarea redusă a leziunilor aterosclerotice în arcada aortică comparativ cu șoarecii hrăniți WD cu 1% CO. În plus, șoarecii hrăniți cu CWO au redus colesterolul LDL/VLDL seric, colesterolul ox-LDL și greutatea corporală și au crescut starea antioxidantă totală a serului în comparație cu șoarecii hrăniți cu CO. Studiul nostru adaugă o nouă perspectivă asupra mecanismelor de protecție presupuse ale suplimentării dietetice cu CWO în BCV, inclusiv activarea răspunsurilor antioxidante endogene, inhibarea oxidării LDL, atenuarea hipercolesterolemiei induse de dietă și reducerea aterogenezei aortice. Aceste rezultate pot informa viitoarele recomandări dietetice pentru a reduce BCV și pentru a promova sănătatea publică.

Abrevieri

Casetă de legare ATP, membră G a sub-familiei 5

Casetă de legare ATP, membră G a sub-familiei 8