REZUMAT

INTRODUCERE

Strategiile ecologice și fiziologice prin care animalele fac față stresului adaptiv sau stresului de foame sunt subiecte de interes permanent pentru ecologia fiziologică (Mrosovsky și Sherry, 1980; Castellini și Rea, 1992; McCue, 2010). Unele animale, inclusiv mamifere hibernante, migranți la distanță lungă și păsări care incubează ouă în mod continuu, suferă un post prelungit ca parte a ciclului lor anual. Aceste animale anticipează postul prin construirea unor depozite mari de grăsimi pentru a susține costurile metabolice, dar pot, de asemenea, să catabolizeze cantități semnificative de masă slabă în timpul postului (Hobson și colab., 1993; Buck și Barnes, 1999). Alte animale expuse la scăderi neprevăzute ale disponibilității alimentelor pot avea stocuri insuficiente de grăsimi și se bazează pe catabolismul masei slabe pentru energie într-o măsură și mai mare. Pierderea masei slabe în timpul postului sau a foamei poate afecta supraviețuirea sau succesul reproductiv ulterior al animalelor, dar importanța și consecințele utilizării țesutului slab sunt dificil de investigat fără capturi și analize repetate ale stării corpului.

alternative

O creștere a raportului izotop stabil azotat (± 15 N) al țesuturilor poate servi ca indicator al pierderii de masă slabă în timpul lipsei de nutrienți. Aici ne concentrăm asupra postului și, având în vedere că răspunsurile fiziologice la postul anticipat și la foamea neprevăzută sunt similare, folosim termenul de post pentru a cuprinde aceste și alte forme de privare de nutrienți, inclusiv deficiența de proteine. Mai multe studii au arătat creșteri ale valorilor δ 15 N în țesuturi în timpul postului sau al stresului nutrițional (Hobson și colab., 1993; Scrimgeour și colab., 1995; Fuller și colab., 2005; Boag și colab., 2006; Alamaru și colab. al., 2009). Cu toate acestea, un număr tot mai mare de studii nu au reușit să observe o creștere (Castillo și Hatch, 2007; Kempster și colab., 2007; McCue și Pollock, 2008; McFarlane Tranquilla și colab., 2010; Mayor și colab., 2011) sau l-a detectat numai în țesuturi specifice (Doucett și colab., 1999; Gloutney și colab., 1999; Cherel și colab., 2005; Guelinckx și colab., 2007). Concilierea acestor rezultate aparent contradictorii va necesita o înțelegere mai completă a mecanismelor care stau la baza modificărilor valorilor δ 15 N la animalele de post (Gannes și colab., 1997; Martínez del Rio și colab., 2009).

Catabolismul și anabolismul proteinelor sunt considerate, în general, echilibrate în timpul transformării proteinelor în stări de echilibru la hrănirea animalelor (Waterlow, 2006). Cu toate acestea, în timpul postului, catabolismul și anabolismul se dezechilibrează într-o măsură care diferă între țesuturi. La nivelul mușchilor, de exemplu, catabolismul depășește cu mult anabolismul în timpul postului, iar sinteza proteinelor încetează efectiv (Cherel și colab., 1991; Waterlow, 2006). În schimb, sinteza proteinelor în ficat continuă la niveluri sub nivelul normal sau crește odată cu catabolismul, impunând o cerere de aminoacizi (Garlick și colab., 1975; Cherel și colab., 1991; Waterlow, 2006). Aceste diferențe în rotația proteinelor în mușchi și ficat în timpul postului conduc la diferite predicții ale modificării izotopice de către modelele catabolice și anabolice în aceste țesuturi. Mai exact, dacă catabolismul este mecanismul apropiat pentru creșterea valorilor δ 15 N în țesut în timpul postului, ne-am aștepta să vedem valori crescute de δ 15 N atât în ​​mușchi, cât și în ficat, care au fost proporționale cu pierderea de masă slabă. În schimb, dacă anabolismul este mecanismul pentru creșterea valorilor de δ 15 N în țesut în timpul postului, ne-am aștepta să o vedem numai în ficat.

Veverițele solare arctice (Urocitellus parryii, Richardson 1825) prezintă un model util de post natural pentru a distinge între modelele anabolice și catabolice. Aceste mamifere mici (

800 g) hibernează timp de 7-8 luni în fiecare an fără să mănânce sau să bea, dar deseori excretă azot ca uree în timpul excitării periodice de la corp la temperatura corporală ridicată. Veverițele solare arctice libere pierd o fracțiune semnificativă din masa slabă atunci când hibernează la temperaturi ambientale scăzute (Buck și Barnes, 1999). Deși veverițele solare arctice tolerează cu ușurință temperaturile corpului sub 0 ° C în timpul corpului în condiții naturale (Buck și colab., 2008), ele trebuie să mărească metabolismul pentru a preveni înghețarea pe măsură ce temperaturile ambientale scad în continuare (Buck și Barnes, 2000). Termogeneza la temperaturi ambiante sub zero pare să se bazeze pe o schimbare a combustibililor metabolici de la strict grăsime la utilizarea crescută a glucidelor generate de gluconeogeneză, ale căror substraturi sunt considerate a fi derivate în parte din descompunerea proteinelor (Buck și Barnes, 2000). Variabilitatea pierderii de masă slabă în condițiile în care veverițele solare arctice sunt expuse în mod natural și periodic generează o gamă de catabolism care ar trebui să fie suficientă pentru a face diferența între modelele catabolice și cele anabolice.

Am evaluat validitatea modelelor anabolice și catabolice comparând predicțiile lor diferite ale modificării valorilor δ 15 N în ficat și mușchi cu modificările măsurate la veverițele solare arctice hibernante. Pentru a genera variabilitate în pierderea de masă slabă, am expus veverițele la două tratamente de temperatură care au indus rate metabolice diferențiale și consumul de combustibil pentru diferite durate de hibernare (Buck și Barnes, 2000). Apoi am colectat probe de ficat, mușchi, urină, plasmă și alte țesuturi. Am folosit modelele modificării δ 15 N odată cu creșterea pierderii de masă slabă în mușchi și ficat pentru a distinge dacă procesele catabolice sau anabolice sunt responsabile de modificarea izotopică a țesutului în timpul postului. Pe baza acestor rezultate, am folosit modelul susținut pentru a interpreta modificările valorilor δ 15 N în alte țesuturi de interes în timpul hibernării (inimă, intestin subțire și țesut adipos brun).

MATERIALE ȘI METODE

Animale

Design de studiu

Pe măsură ce animalele au început să hiberneze, le-am alocat în mod aleatoriu grupurilor de tratament. Animalele martor (N = 5) au fost prelevate după 3-8 zile de hibernare la + 2 ° C. Animalelor experimentale li s-au atribuit două tratamente de temperatură (+2 sau -10 ° C) și trei durate de hibernare la fiecare temperatură (45, 68 sau 90 de zile) pentru un total de șase grupuri de tratament (N = 5 per grup, N = 30 total ). Deoarece veverițele aflate în captivitate în condiții constante pot scurta ciclul lor anual, ducând la scăderea duratei de hibernare (Pengelley și colab., 1976), am selectat durate relativ scurte și am atribuit veverițe suplimentare fiecărui tratament de temperatură. Unul dintre aceste animale suplimentare a fost lăsat să hiberneze timp de 115 zile la -10 ° C și patru veverițe la + 2 ° C au fost prelevate după terminarea naturală a hibernării după 82, 139, 177 și 232 de zile. Astfel, dimensiunea eșantionului total a fost N = 40.

Estimarea masei slabe prin diluarea izotopilor

Am utilizat diluarea izotopilor pentru a estima masa slabă utilizând o ecuație de calibrare bazată pe analize chimice ale compoziției corpului (Lee și colab., 2011). Am estimat masa slabă inițială a tuturor veverițelor, cu excepția grupului de control în a doua zi de hibernare și masa slabă finală a tuturor animalelor înainte de eutanasie (vezi mai jos). În toate cazurile (cu excepția celor patru veverițe care au terminat în mod natural hibernarea), am indus veverița să trezească la temperatura corpului ridicată prin manipulare. Odată ce animalul a atins temperatura corporală ridicată, a fost anesteziat prin anestezie cu gaz (izofluran, 3-5%) și o gheară a fost tăiată pentru a colecta o probă de fond de sânge în tuburi capilare heparinizate care au fost fie sigilate cu flacără pentru depozitare la rece ( analize de deuteriu) sau sigilate cu argilă și congelate la -20 ° C (analize de carbon și azot). O injecție de deuteriu de 3% a fost administrată intraperitoneal conform ecuației: volumul injecției (ml) = masa (g) × 0,000867, iar animalului i s-a permis să se recupereze după anestezie. După 61,4 ± 2,4 min (medie ± s.d.), animalul a fost din nou anesteziat și o probă de sânge îmbogățit cu deuteriu a fost prelevată prin clemă cu gheare. Veverițele experimentale au fost apoi plasate în cameră la temperatura ambiantă atribuită, unde s-au întors la toropeală în termen de 1-3 zile.

Colectarea probelor de țesut

Animalele au fost mutate într-o cameră caldă (18-22 ° C) și induse să se trezească. Am monitorizat temperatura rectală în timpul excitării printr-un termocuplu cu vârf de ceară introdus aproximativ 2,5 cm în rect; La 9 ore după ce temperatura rectală a atins 30 ° C, am anesteziat animalul și am repetat diluarea izotopului ca mai sus pentru a estima masa slabă. După 1 oră, animalul a fost din nou anesteziat și a doua probă de izotop îmbogățit a fost prelevată prin puncție cardiacă, timp în care am colectat sânge (2 ml) în Vacutainers heparinizați pentru analiza izotopilor de carbon și azot a plasmei și a globulelor roșii din sânge. Animalul a fost apoi eutanasiat în timp ce era încă sub anestezie printr-o supradoză de pentobarbital de sodiu injectat în inimă. Țesuturile (inimă; ficat; intestin subțire; țesut adipos maro; țesut adipos alb subcutanat și abdominal; și gastrocnemie, cvadriceps, mușchi scheletici abdominali și scapulari) au fost îndepărtate și înghețate la -20 ° C pentru analiza izotopului. Probele de urină au fost colectate direct din vezică cu o seringă atunci când este posibil (N = 33) și congelate în crioviale la -20 ° C. Veverițele care au terminat hibernarea au fost anesteziate în mod natural și prelevate ca mai sus în a treia zi la temperatura corpului ridicată.

Analiza izotopului stabil

Rapoartele izotopului probei au fost analizate la instalația de izotopi stabili din Alaska prin spectrometrie de masă a raportului izotopului cu flux continuu. Rapoartele izotopului de carbon și azot al probelor solide au fost analizate folosind un analizor elementar Costech ECS4010 (Costech Scientific Inc., Valencia, CA, SUA) interfațat cu un spectrometru de masă de masă isotop (IRMS) Finnigan Delta Plus XP prin intermediul interfeței Conflo III (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germania). Raportul izotopului de hidrogen al plasmei a fost analizat folosind un analizor elementar ThermoElectron de conversie a temperaturii ridicate interfațat cu un IRMS Finnigan Delta V Plus prin interfața Conflo III (ambele instrumente de la Thermo Fisher Scientific). Toate valorile izotopului sunt exprimate în notație delta ca δX = [(Rsample - Rstandard)/Rstandard] × 1000%, unde X este izotopul greu, R este raportul dintre izotopul greu și ușor și standardele sunt următoarele: N, azot atmosferic (Nair); C, Vienna PeeDee alb (V-PDB); și H, standardul Vienei înseamnă apă oceanică (V-SMOW). Materialele de referință de laborator (δ 15 N = 7,0%, δ 13 C = −15,8%) rulate concomitent cu probele au avut valori de δ 15 N și δ 13 C de 7,0 ± 0,2% și respectiv −15,8 ± 0,1% (N = 104). Am corectat valorile δ 2 H pe baza calibrării standard.

analize statistice

Estimările masei slabe au fost calculate din valorile δ 2 H conform unei ecuații de calibrare specifice speciei (vezi Lee și colab., 2011), iar pierderea a putut fi calculată numai la indivizii cu toate cele patru probe de diluție a izotopilor intacte (N = 32 din 35). Animalelor de control (N = 5) li s-au atribuit 0 g pierdere de masă slabă pentru analize. Am comparat valorile δ 15 N și δ 13 C ale diferitelor țesuturi folosind ANOVA și am folosit un test t pentru a compara toate lungimile luptei corporale între tratamentele de temperatură. Am folosit regresia liniară simplă pentru a determina modul în care valorile țesuturilor δ 15 N și δ 13 C au variat în funcție de pierderea masei slabe (% din masa totală slabă pierdută în timpul experimentului) după eliminarea valorilor aberante identificate prin distanțele Mahalonobis (δ 15 N: ≤3 pe țesut din 7 din 13 țesuturi pentru un total de 10 din 424 măsurători; δ 13 C: ≤2 pe țesut din 10 din 13 țesuturi pentru un total de 14 din 478 măsurători). Am efectuat toate analizele statistice cu JMP 8.0 (SAS Institute, Cary, NC, SUA) folosind α de 0,05 și am raportat toate mediile ± s.d.

REZULTATE

Pierderea de masă slabă în funcție de durata hibernării la veverițele solare arctice. Relația a fost semnificativă pentru animalele care hibernează la -10 ° C (N = 16), dar nu a existat nicio relație pentru animalele care hibernează la + 2 ° C (N = 16).

DISCUŢIE

Rezultatele noastre susțin modelul anabolic ca mecanism principal prin care semnăturile izotopului stabil cu azot se schimbă în țesuturile animale în timpul postului. Modelul anabolic necesită ca sinteza ureei să îndepărteze în mod selectiv izotopii ușori din grupul de aminoacizi din plasmă, determinând creșterea grupului rezidual de aminoacizi în valoarea de δ 15 N. Rezultatele noastre în veverițele de pământ arctice în post au susținut această așteptare: valorile urinei δ 15 N au fost în medie cu 3,8% mai ușoare decât cele ale plasmei, iar atât valorile urinei cât și cele ale plasmei plasma 15 N au crescut liniar odată cu creșterea pierderii de masă slabă. Mai esențial, am observat creșterea valorilor de δ 15 N în ficat, care se așteaptă să continue sintetizarea proteinelor chiar și în timpul postului extrem, dar nu în patru țesuturi musculare scheletice diferite, despre care se așteaptă să se descompună proteinele, dar puțin, dacă este cazul, sinteză. Rezultatele din mușchiul scheletic contrazic modelul catabolic, care prezice că țesuturile care sunt defalcate în timpul postului ar trebui să crească cu valori de ~ 15 N. FIG. 5 rezumă cerințele cheie ale modelului anabolic, care sunt cruciale pentru înțelegerea noastră a fiziologiei care determină modificări ale valorilor δ 15 N în țesuturi în timpul postului.

Valori de δ 15 N, δ 13 C și C: N din toate țesuturile din veverițele solului arctic prelevate la începutul hibernării