A contribuit în mod egal la această lucrare cu: Wenqin Xiao, Weiliang Jiang, Jie Shen

acidul

Departamentul de afiliere pentru gastroenterologie, Spitalul de zece oameni din Shanghai, Facultatea de Medicină a Universității Tongji, Shanghai, China

A contribuit în mod egal la această lucrare cu: Wenqin Xiao, Weiliang Jiang, Jie Shen

Departamentul de afiliere gastroenterologie, primul spital al oamenilor din Shanghai, Facultatea de Medicină a Universității Jiaotong din Shanghai, Shanghai, China

A contribuit în mod egal la această lucrare cu: Wenqin Xiao, Weiliang Jiang, Jie Shen

Departamentul de afiliere pentru gastroenterologie, spitalul Shanghai Changzheng, a doua universitate medicală militară din Shanghai, Shanghai, China

Departamentul de afiliere pentru gastroenterologie, Spitalul de zece oameni din Shanghai, Facultatea de Medicină a Universității Tongji, Shanghai, China

Departamentul de afiliere pentru gastroenterologie, Spitalul de zece oameni din Shanghai, Facultatea de Medicină a Universității Tongji, Shanghai, China

Departamentul de afiliere pentru gastroenterologie, Spitalul de zece oameni din Shanghai, Facultatea de Medicină a Universității Tongji, Shanghai, China

Departamentul de afiliere pentru gastroenterologie, Spitalul de zece oameni din Shanghai, Facultatea de Medicină a Universității Tongji, Shanghai, China

Departamentul de afiliere gastroenterologie, primul spital al oamenilor din Shanghai, Facultatea de Medicină a Universității Jiaotong din Shanghai, Shanghai, China

Departamentul de afiliere gastroenterologie, primul spital al oamenilor din Shanghai, Facultatea de Medicină a Universității Jiaotong din Shanghai, Shanghai, China

Departamentul de afiliere gastroenterologie, primul spital al oamenilor din Shanghai, Facultatea de Medicină a Universității Jiaotong din Shanghai, Shanghai, China

Departamentul de afiliere gastroenterologie, primul spital al oamenilor din Shanghai, Facultatea de Medicină a Universității Jiaotong din Shanghai, Shanghai, China

Departamentul de Gastroenterologie, Spitalul Popular al X-lea din Shanghai, Facultatea de Medicină a Universității Tongji, Shanghai, China, Departamentul de Gastroenterologie, Primul Spital Popular al Shanghai, Școala de Medicină a Universității Jiaotong din Shanghai, China

  • Wenqin Xiao,
  • Weiliang Jiang,
  • Jie Shen,
  • Guojian Yin,
  • Yuting Fan,
  • Deqing Wu,
  • Lei Qiu,
  • Ge Yu,
  • Miao Xing,
  • Guoyong Hu

Cifre

Abstract

Citare: Xiao W, Jiang W, Shen J, Yin G, Fan Y, Wu D și colab. (2015) Acidul retinoic ameliorează fibroza pancreatică și inhibă activarea celulelor stelate pancreatice la șoareci cu pancreatită cronică experimentală prin suprimarea căii de semnalizare Wnt/β-Catenin. PLoS ONE 10 (11): e0141462. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0141462

Editor: Francisco X. Real, Centrul Național pentru Investiții Oncologice (CNIO), SPANIA

Primit: 15 ianuarie 2015; Admis: 8 octombrie 2015; Publicat: 10 noiembrie 2015

Disponibilitatea datelor: Toate datele relevante se găsesc în lucrare.

Finanțarea: Acest studiu a fost susținut parțial de Fundația Națională pentru Științe Naturale din China (nr. 81270543) și parțial susținut de Fundația Comitetului pentru Știință și Tehnologie din Shanghai (nr. 12ZR1423100 și XBR2013082). Finanțatorul a proiectat studiul și a decis să publice manuscrisul.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Aici, am examinat ipoteza că RA poate suplimenta pierderea picăturilor de grăsime în timpul leziunii pancreasului, poate ameliora progresia fibrozei pancreatice în CP experimental și poate inhiba activarea PSC prin suprimarea căii de semnalizare Wnt/β-catenină. Efectele RA au fost investigate atât in vivo cât și in vitro utilizând un model de șoarece de CP indusă de ceruleină și un model celular de PSC de șoarece.

Materiale și metode

Declarație de etică

Toate procedurile legate de animale au fost aprobate de Comitetul de îngrijire și utilizare a animalelor din cadrul Spitalului al zecelea pentru oameni din Shanghai, Universitatea Tongji. Această cercetare a fost, de asemenea, aprobată de Comisia de Știință și Tehnologie a Municipiului Shanghai (ID: SYXK 2007–0006) sub numărul autorizației 2011-RES1. Șoarecii au fost menținuți sub un ciclu de lumină - întuneric de 12 ore la 22 ° C, au furnizat apă ad libitum, au fost hrăniți cu chow de laborator standard și au fost lăsați să se aclimatizeze timp de cel puțin o săptămână. Mediul a fost menținut la o umiditate relativă de 30-70%. Șoarecii cu pancreatită indusă de ceruleină au fost monitorizați așa cum s-a descris mai sus.

Animale și design experimental

(A) Structura chimică a acidului retinoic, un retinoid, cu o greutate moleculară mică de 300,4. (B) Au fost analizate cinci grupuri de șoareci (n = 8). Grupul de control a primit doar 6 injecții cu soluție salină, în timp ce grupul cu Cerulein a primit 6 injecții de ceruleină la o doză de 50 μg/kg, 3 zile pe săptămână. Grupului RA i s-au administrat 6 injecții cu soluție salină și RA (20 mg/kg) 3 zile pe săptămână. Grupului Cer + RA-A i s-au administrat 6 injecții de ceruleină și RA din prima zi a perioadei experimentale pentru un total de 6 săptămâni, în timp ce grupul Cer + RA-B a primit aceleași injecții cu ceruleină ca și grupul Cer + RA-A, dar a administrat RA din prima zi a săptămânii 4 până la sfârșitul experimentului pe o perioadă totală de 3 săptămâni.

Analize serice de amilază și lipază

Nivelurile serice de amilază și lipază au fost măsurate prin chimia dinamicii enzimatice utilizând truse comerciale pe un sistem de analiză modulară Roche/Hitachi (Roche, Mannheim, Germania), conform protocolului producătorului.

Examen histologic

Histologia pancreasului de șoarece a fost examinată prin hematoxilină-eozină (H&E) și colorarea cu tricrom Masson. O proporție de țesut pancreatic a fost fixată în formaldehidă tamponată cu fosfat 4% în 24 de ore, deshidratată printr-o serie de etanol gradată și încorporată în blocuri de parafină. Secțiunile de pancreas (5 μm) au fost depilate în xilen, hidratate printr-o serie de etanol îmbunătățită și supuse la colorare H&E și tricrom Masson. Modificările morfologice au fost examinate la microscopul luminos de către trei patologi care nu știau despre originea specimenelor. Pe scurt, severitatea CP a fost evaluată utilizând un scor semiquantitativ gradat: atrofie glandulară gradată (0-3), fibroză intralobulară, interlobulară și periductală (0-3) și infiltrate inflamatorii mononucleare (0-3) [44].

Studiu imunohistochimic al α-SMA și al β-cateninei

Probele încorporate în parafină fixate pe formalin au fost tăiate în secțiuni groase de 5 μm. Secțiunile de țesut au fost deparafinizate și rehidratate cu etanol îmbunătățit. Pentru recuperarea antigenului, lamele au fost fierte în EDTA (1 mmol/L, pH 8,0) timp de 15 minute într-un cuptor cu microunde. Activitatea de peroxidază endogenă a fost stinsă cu soluție de peroxid de hidrogen 0,3% timp de 10 minute la temperatura camerei. După clătire cu PBS, lamele au fost blocate cu ser albumină bovină (BSA) în PBS timp de 30 de minute. Secțiunile au fost ulterior incubate cu anticorpi monoclonali de șoarece α-SMA (diluție 1: 800, Santa Cruz, California, SUA) și β-catenină policlonală de iepure (diluție 1: 800, CST, Danvers, MA, SUA) anticorpi peste noapte la 4 ° C. Legarea anticorpilor a fost detectată cu un kit de detectare Envision, Peroxidază/DAB, iepure/șoarece (Gene Tech, Shanghai, China). Apoi, secțiunile au fost contracolorate cu hematoxilină. Ca martor negativ, PBS a înlocuit anticorpul primar. Zonele cu colorare pozitivă pentru α-SMA și β-catenină au fost observate la toate specimenele la microscop de către trei patologi care nu erau conștienți de originea specimenului (CTR 6000; Leica, Wetzlar, Germania).

Cultură celulară și tratament cu acid retinoic

PSC-urile au fost izolate de la șoareci masculi Balb/c prin digestia țesutului pancreatic și centrifugarea cu gradient de densitate Nycodenz, așa cum s-a descris anterior [45-46]. Șoarecii proaspăt izolați PSC au fost cultivați în DMEM/F12 (Gibco BRL, SUA) suplimentat cu 10% ser fetal bovin (FBS; Gibco BRL, SUA) și 1% penicilină-streptomicină (PS; Gibco BRL, SUA) la 37 ° C, 5% CO2. A doua zi și la fiecare 2 zile după aceea, mediul de cultură a fost schimbat și tratat cu doze diferite de RA (0, 0,5, 1, 2 μmol/L) sau lăsat netratat. Linia celulară acinară pancreatică murină 266-6 (Cobioer ATCC, SUA) a fost cultivată în DMEM/HIGH GLUCOSE (Gibco BRL, SUA) suplimentată cu 10% FBS și 1% PS la 37 ° C, 5% CO2, mediul de cultură a fost schimbat la fiecare 2 zile și administrat cu sau fără 100 nmol/L ceruleină timp de 5 zile [16], apoi tratat cu sau fără 1 μmol/L RA.

Colorarea imunofluorescentă

PCR cantitativ în timp real

ARN-ul total a fost extras din pancreas, PSC de șoarece și celule 266-6 folosind reactiv TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, SUA) urmând instrucțiunile producătorului și supus transcrierii inverse folosind kitul de reactivi PrimeScript RT (TaKaRa, Japonia). PCR cantitativă în timp real (qRT-PCR) a fost efectuată în triplicat pentru fiecare genă de interes folosind ABI Prism 7900 HT Sequence Detection System (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, SUA), conform manualului SYBR Premix EX Taq (TaKaRa) . GAPDH a fost utilizat ca un control endogen separat la care gena de interes a fost normalizată și modificările de ori pentru expresia genei au fost calculate folosind metoda comparativă CT (2 - ΔΔCT). Exemple de secvențe pentru biomarkeri au fost proiectate cu software-ul sunt prezentate în Tabelul 1.