Afiliere Centro i∼mar, Universitatea din Los Lagos, Puerto Montt, Chile

acvacultura

Departamentul de afiliere pentru microbiologie și imunologie, New York Medical College, Valhalla, New York, Statele Unite ale Americii

Afiliere Centro i∼mar, Universitatea din Los Lagos, Puerto Montt, Chile

Afiliere Centro i∼mar, Universitatea din Los Lagos, Puerto Montt, Chile

Afiliere Centro i∼mar, Universitatea din Los Lagos, Puerto Montt, Chile

Departamentul de afiliere pentru microbiologie și imunologie, New York Medical College, Valhalla, New York, Statele Unite ale Americii

Departamentul de afiliere pentru patologie, New York Medical College, Valhalla, New York, Statele Unite ale Americii

Departamentul de afiliere pentru patologie, New York Medical College, Valhalla, New York, Statele Unite ale Americii

Departamentul de afiliere pentru microbiologie și imunologie, New York Medical College, Valhalla, New York, Statele Unite ale Americii

  • Alejandro H. Buschmann,
  • Alexandra Tomova,
  • Alejandra López,
  • Miguel A. Maldonado,
  • Luis A. Henríquez,
  • Larisa Ivanova,
  • Fred Moy,
  • Henry P. Godfrey,
  • Felipe C. Cabello

Cifre

Abstract

Citare: Buschmann AH, Tomova A, López A, Maldonado MA, Henríquez LA, Ivanova L, și colab. (2012) Salmon Aquaculture and Antimicrobial Resistance in the Marine Environment. PLoS ONE 7 (8): e42724. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0042724

Editor: Martin Krkosek, Universitatea din Otago, Noua Zeelandă

Primit: 3 aprilie 2012; Admis: 11 iulie 2012; Publicat: 8 august 2012

Finanțarea: Această cercetare a fost susținută de un grant acordat de Lenfest Ocean Program/Pew Charitable Trusts către F.C.C. și A.H.B. Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Se crede că acvacultura va constitui sursa a peste peste jumătate din fructele de mare consumate în lume în următorii ani, din cauza prăbușirii pescuitului natural [1]. Cu toate acestea, această viziune optimistă trebuie temperată prin creșterea informațiilor care sugerează că o astfel de extindere poate fi nesustenabilă, deoarece acvacultura generează efecte nefastă, cum ar fi distrugerea habitatului, eutrofizarea și contaminarea mediului cu substanțe chimice și antimicrobiene [2]. Utilizarea terapeutică, care promovează creșterea și profilactica antimicrobienilor a fost introdusă în practica agricolă în anii 1940 și a devenit răspândită în Europa și Statele Unite [3] - [6]. S-a observat curând rezistența antimicrobiană la animalele hrănite cu antimicrobiene [7], îngrijorările cu privire la posibilitățile de transmitere a acestei rezistențe la agenții patogeni umani au urmat la scurt timp după aceea [6], [8], [9] și, într-adevăr, s-a demonstrat că există [ 6]. 10], [11]. Interdicțiile voluntare și legislația privind utilizarea antimicrobienelor ca promotori de creștere în statele membre ale Uniunii Europene începând cu anii 1990 au fost asociate cu o scădere semnificativă a utilizării antimicrobiene fără efecte negative asupra productivității la păsări și porcine [8], [12], [13].

Acvacultura somonului este o industrie în creștere exponențială la nivel mondial, în special în două țări - Norvegia și Chile [14], [15]. În Chile, această creștere a fost însoțită de mortalitate majoră a somonului crescut în țarcuri nete. Acestea pot atinge 50% din producție în anumite condiții, cu pierderi economice mari care rezultă [16], [17]. Această creștere a declanșat îngrijorări cu privire la numeroase probleme de mediu, în special deoarece cantități mari de chimioterapice și antimicrobiene din furaje trec ușor în mediul marin și pot modifica biodiversitatea bacteriană [2], [18] - [22]. Deoarece utilizarea vaccinurilor pentru prevenirea bolilor bacteriene la pești este limitată [16], acest lucru, la rândul său, a condus la utilizarea crescută a antimicrobienelor terapeutice și profilactice [23] - [25]. Estimările conservatoare sugerează că aproximativ 950 de tone metrice de chinolone au fost utilizate în acvacultura somonului în Chile între 2000 și 2008 și aproximativ 1500 de tone de tetraciclină și 478 de tone de florfenicol au fost utilizate în acest scop între 2000 și 2007 [23] - [25 ].

Agenții antimicrobieni sunt de obicei administrați somonului amestecat cu alimente [19], [22]. Mâncărurile nedorite și fecalele de pește care conțin antimicrobieni neabsorbiți și metaboliți antimicrobieni secretați în apă și în sedimentele din mediul siturilor de creștere a somonului își păstrează adesea activitatea antimicrobiană și pot rămâne în mediul acvatic pentru perioade variabile de timp în funcție de concentrațiile inițiale, biodegradabilitatea și caracteristici fizice și chimice [19], [26] - [28]. Astfel de materiale pot selecta bacteriile rezistente la antimicrobiene din coloana de sedimente și apă și pot influența adesea diversitatea microbiană nu numai prin eliminarea bacteriilor sensibile, ci și prin acționarea asupra altor microorganisme sensibile, cum ar fi microalge [22], [26], [29], [ 30].

Selecția bacteriilor rezistente la antimicrobiene în mediul marin ar putea avea efecte nocive asupra piscinei și a sănătății umane prin facilitarea transferului factorilor determinanți genetici ai rezistenței antimicrobiene de la microbii mediului marin la agenții patogeni ai peștilor și bacteriile terestre, inclusiv agenții patogeni umani și animale [19], [22], [23], [31]. Este clar că bacteriile din ecosistemele marine și terestre pot împărtăși genele de rezistență antimicrobiană și că unele gene emergente de rezistență antimicrobiană la agenții patogeni umani pot avea o origine bacteriană acvatică [32] - [35]. De exemplu, patogenul peștilor Yersinia ruckerii, cauza bolii enterice a gurii roșii, împarte o plasmidă de rezistență antimicrobiană și gene de rezistență antimicrobiană cu bacilul ciumei, Yersinia pestis [36]. Această împărțire a elementelor genetice mobile și a genelor de rezistență antimicrobiană între bacteriile de diferite nișe ecologice pune în pericol tratamentul pacienților umani [22], [32] - [34], [36]. Astfel de descoperiri genetice și epidemiologice sugerează cu tărie că ecosistemele acvatice și terestre nu sunt izolate în ceea ce privește diseminarea genelor de rezistență antimicrobiană între populațiile lor bacteriene, probabil ca urmare a transferului orizontal de gene [22], [37].

Nivelul ridicat de utilizare antimicrobiană în acvacultura somonului din Chile ar putea avea impact negativ asupra biodiversității mediului și asupra sănătății terestre a animalelor și a oamenilor prin selectarea bacteriilor din mediul marin care conțin gene de rezistență antimicrobiană. Prin urmare, am comparat numărul de bacterii cultivabile și bacterii rezistente la antimicrobiene pentru trei antimicrobiene utilizate pe scară largă în acvacultura somonului chilian (oxitetraciclină, acid oxolinic și florfenicol) în sedimentul marin adiacent la țarcurile de acvacultură a somonului și la un loc de control la 8 km distanță, fără acvacultură observată sau alte activități umane.

Rezultate

Antimicrobieni în probe de sedimente din acvacultură și situri de control

Urme de flumequină, un antimicrobian al fluorochinolonelor, au fost prezente în patru probe de sedimente la situl de acvacultură (Fig. 1): două în decembrie 2008 și două în ianuarie 2009. Flumequine a fost prezentă și în patru probe de sedimente de la locul de control, 8 km de situl de acvacultură (Fig. 1): unul în decembrie 2008, doi în ianuarie 2009 și unul în aprilie 2009. Oxitetraciclină, acid oxolinic și florfenicol nu au fost detectate în niciunul dintre cele 36 de eșantioane examinate (date nereprezentat).

Siturile de cultivare a somonului sunt indicate de stele. „Situl de acvacultură” eșantionat în prezentul studiu (vârf de săgeată, inserție) a fost la 20 m de ferma de somon indicată de săgeată. Alte situri eșantionate în prezentul studiu au fost situate la 0,5 km (triunghi solid), 1 km (diamant solid) și 8 km (cerc solid) de la situl de acvacultură. Ultimul sit se afla în largul coastei insulei Tabón, o insulă fără activități acvaculturale sau alte activități umane și este denumit „site-ul de control” în text.

Bacterii cultivabile în probe de sedimente din acvacultură și situri de control

Numărul total de bacterii cultivabile din sedimentele din acvacultură și locurile de control a variat semnificativ pe parcursul unui an (P 3 și 1 × 10 5 unități formatoare de colonii (cfu) g -1 (Fig. 2A). Au existat diferențe foarte semnificative în numere bacteriene cultivabile între acvacultură și situri de control pe întreaga perioadă de studiu (P Figura 2. Bacterii cultivabile în probe de sedimente la acvacultură și situri de control luate în diferite puncte de timp.

A. Unitățile de formare a coloniilor (ufc) g −1 sediment (medie ± SE) în probele prelevate din septembrie 2008 până în septembrie 2009 au fost semnificativ mai mari la situl de acvacultură (cercuri închise) decât la locul de control (cercuri deschise) în toate punctele de timp (sediment P −1 (medie ± SE) luate în noiembrie 2008, la situl de acvacultură (0,0 km) și la siturile aflate la 0,5, 1,0 și 8,0 km (situl de control) distanță de acesta. Siturile de acvacultură și de control corespund 2A pentru această dată; cinci probe au fost prelevate din fiecare sit suplimentar studiat. Diferite litere mici indică diferențe semnificative (P Figura 3. Bacteriile rezistente la antimicrobiene în probele de sedimente din acvacultură și siturile de control.

Fracția de rezistență antimicrobiană (ARF) (medie ± SE) a bacteriilor cultivabile la (A) oxitetraciclină și (B) acid oxolinic în sedimente din acvacultură (bare solide) și zone de control (bare deschise) din septembrie 2008 până în septembrie 2009, au fost semnificativ diferite între acvacultură și siturile de control pe întreaga perioadă de studiu (P Figura 4. Variația ARF la antimicrobieni selectați cu distanță de situl de acvacultură.

ARF (medie ± SE) în noiembrie 2008, până la (A) oxitetraciclină, (B) acid oxolinic și (C) florfenicol în sedimente la situl de acvacultură (0,0 km) și la siturile 0,5, 1,0 și 8,0 km (locul de control) îndepărtată de ea. ARF pentru acvacultură și siturile de control corespund ARF prezentat în Fig. 3 pentru această dată. Au fost prelevate cinci probe din fiecare sit suplimentar studiat. ARF pentru fiecare antimicrobian a fost semnificativ mai mare la acvacultură decât la locul de control (probabilități indicate pentru fiecare antimicrobian). Diferite litere mici în cadrul fiecărui panou indică diferențe semnificative între ARF (P Figura 5. Gene de rezistență antimicrobiană în izolatele și controalele bacteriene marine neselectate.

Detectarea genelor de rezistență antimicrobiană la bacteriile cultivate din sedimente marine obținute din decembrie 2008 până în ianuarie 2009. Genele qnr, tet și floR au fost detectate prin PCR așa cum este descris în Material și metode cu primerii din tabelul 3. D15, J12, DC5, J19, DC12, D14 și D17 sunt izolate bacteriene din sedimente. -, control negativ (E. coli DH5α). +, controale pozitive (Tabelul 3). M, markeri de greutate moleculară.

Identificarea speciilor de bacterii care conțin gene de rezistență antimicrobiană din acvacultură și situri de control

Amplificarea PCR a genelor ARNr 16S în opt izolate bacteriene din situl de acvacultură a identificat două izolate de Sporosarcina sp., Două izolate de Arthrobacter sp. și unul izolat Vibrio sp. Izolatele bacteriene de la locul de control au inclus un Pseudoalteromonas sp. izolat și două izolate de Vibrio sp. (Masa 2). Secvențele 16S rADN ale acestor ampliconi au fost> 99% identice cu cele din GenBank (valoarea E de 0,0) (Tabelul 2). Aceste observații nu sunt în concordanță cu posibilitatea ca bacteriile în care au fost prezente genele de rezistență antimicrobiană să fie agenți patogeni umani și terestri care contaminează apele costiere din Chile [46], [47].

Discuţie

Obținerea unui număr precis de bacterii cultivabile în sedimentele marine este complicată de dispersarea incompletă a particulelor și a bacteriilor atașate ale acestora. Această dispersie incompletă duce la valori neregulate în seriile de diluție. Deși studiile clinice utilizează frecvent diverse criterii pentru a asigura calitatea datelor care urmează să fie analizate [53], [54], studiul nostru este unul dintre primele, dacă nu chiar primele din acest domeniu care utilizează criterii explicite pentru a asigura calitatea datelor de analizat. Faptul că concluzii similare au fost obținute în analize de sensibilitate multiple confirmă validitatea acestei abordări.

S-a sugerat că un număr semnificativ mai mare de bacterii rezistente la antimicrobiene cultivabile demonstrabile în sedimentele siturilor de acvacultură în raport cu siturile de control pot fi rezultatul modificărilor produse de excesul de materie organică care trece în mediu din hrana și fecalele de pește neingestate, mai degrabă decât din antimicrobiene utilizare în sine [55] - [57]. Din păcate, nu există dovezi experimentale care să susțină această ipoteză. Este dificil să se dezvolte un scenariu bazat pe conceptele actuale de genetică și fiziologie microbiană care ar putea explica stimularea preferențială a creșterii bacteriilor rezistente la antimicrobiene numai prin materia organică, cu excepția cazului în care această materie conține și alte entități chimice, cum ar fi ioni metalici, dezinfectanți sau metaboliți co-selectare pentru utilizarea metabolitului și gene omniprezente de rezistență antimicrobiană integrate liniar în unități genetice mobile, cum ar fi plasmide, transpozoni și integroni în toate bacteriile și Archea [58], [59].

Aproximativ jumătate din speciile de bacterii marine cultivabile neselectate, atât din acvacultură, cât și din locurile de control, adăposteau gene de rezistență antimicrobiană (Tabelul 1); rezistențele antimicrobiene detectate la aceste bacterii sunt probabil mediate de aceste gene. Deoarece gena de rezistență la tetraciclină tetM și alte gene de rezistență antimicrobiană au fost demonstrate în ADN-ul bacterian antic (30.000 de ani înainte de prezent) extras din permafrost terestru din Alaska [62], efectul utilizării antimicrobiene în acvacultura de somon asupra sedimentelor marine este cel mai probabil limitat la selectând acele bacterii capabile să supraviețuiască în prezența lor. Cu toate acestea, frecvențele similare numerice ale genelor de rezistență antimicrobiană la ambele situri sunt cu siguranță în concordanță cu prezența reziduurilor antimicrobiene la ambele situri și sugerează din nou că locul de control nu a fost atât de curat pe cât se credea inițial că este.

Există mai multe avertismente cu privire la fenotipurile și genotipurile de rezistență bacteriană observate. Deoarece am secvențiat doar trei ampliconi pentru gena aac (6 ′) - Ib-cr, nu putem fi siguri că cei cinci ampliconi detectați au mutația care mediază acetilarea chinolonelor [63]. Mai mult, fenotipurile de rezistență la oxitetraciclină, acid oxolinic și florfenicol pot fi codificate de o multitudine de gene cromozomiale și plasmidice și nu numai de cele studiate în lucrarea de față [40], [64] - [66]. Deoarece nu am efectuat o investigație exhaustivă a genelor alternative de rezistență antimicrobiană pentru chinolonă, tetracicline și cloramfenicol, nu am căutat prezența genelor care mediază rezistența la alți antimicrobieni și am studiat numai bacteriile cultivabile, probabil că subestimăm rezistența prezentă în bacteriile marine la siturile de acvacultură și control. Această subestimare ar putea reduce șansa de a detecta orice diferențe cu privire la aceste gene între aceste site-uri. În mod interesant, câteva dintre tulpinile studiate adăposteau și un integron de tip 1, un element genetic asociat de obicei cu casete multiple de rezistență antimicrobiană și cunoscut ca fiind prezent în bacteriile din sedimentele acvatice afectate de activitatea umană [41] - [44].

Materiale și metode

Amplasarea acvaculturii și a locurilor de prelevare a probelor

Probele de sedimente au fost prelevate dintr-o zonă circumscrisă a sedimentului superficial de la acvacultură și locurile de control de către scafandri, folosind eșantioane de miez din plastic cu diametrul de 15 cm. După obținerea sedimentului, proba a fost închisă de scafandru cu un capac de plastic pentru a evita contaminarea. Nu au fost capturate organisme pe cale de dispariție sau protejate în timpul obținerii acestor probe de sedimente. Datele pentru eșantionare au fost alese în mod arbitrar pentru a cuprinde un an întreg, cu accent pe eșantionare în timpul primăverii/verii australe, când sunt concentrate activitățile acvaculturale. Eșantionarea a fost efectuată de șapte ori pe o perioadă de 12 luni: septembrie, noiembrie și decembrie 2008; și ianuarie, aprilie, iulie și septembrie 2009. Trei probe au fost prelevate în septembrie 2008; cinci probe au fost prelevate la fiecare dintre celelalte ori, rezultând 33 de probe de la situl de acvacultură și 33 de probe de la locul de control pentru un total de 66 de probe de la ambele situri. În noiembrie 2008, cinci eșantioane au fost, de asemenea, prelevate la situri la 0,5 km și 1 km de situl de acvacultură pentru un total de 10 eșantioane din aceste situri suplimentare (Fig. 1).

Măsurarea antimicrobienelor în probele de sedimente

Prezența în probe de sedimente de oxitetraciclină, acid oxolinic, flumequină și florfenicol a fost determinată la Instituto de Farmacia, Universidad Austral, Valdivia, Chile, prin HPLC utilizând protocoale standard la lungimi de undă fixe UV/Vis [60], [76], [ 77]. Aceste teste au fost efectuate pe patru probe de sedimente prelevate de la situl de acvacultură și patru probe de sedimente prelevate de la locul de control la fiecare dintre cele patru date: decembrie 2008, ianuarie 2009, aprilie 2009 și iulie 2009. Două probe de sediment prelevate fiecare 0,5 și 1 km de situl de acvacultură în noiembrie 2008, au fost, de asemenea, testați pentru aceste antimicrobiene. Un total de 36 de probe au fost testate pentru antimicrobieni.

Culturi bacteriene

Detectarea genelor de rezistență antimicrobiană mediate de plasmide

Identificarea speciilor bacteriilor marine care conțin gene de rezistență antimicrobiană

Identificarea bacteriilor marine care conțin gene de rezistență antimicrobiană s-a făcut prin amplificarea PCR a genelor ribosomale 16S [87], [88] folosind primerii 16S rRNAf și 16S rRNAr1 (Tabelul 3). Ampliconii obținuți au fost de aproximativ 1500 pb și au acoperit 99% din genele ARNr 16S. Ampliconii au fost secvențați și au fost identificați prin analiza BLAST față de baza de date de secvențe de nucleotide non-redundante la GenBank.