1 Departamentul de chirurgie, secția de oncologie chirurgicală, Universitatea din California de Sud, Los Angeles, CA 90033, SUA

răspunsului

2 Hoag Memorial Hospital Presbyterian, Newport Beach, CA 92663, SUA

3 Departamentul de Oncologie Medicală a Melanomului, Universitatea din Texas MD Anderson Cancer Center, Houston, TX 77030, SUA

4 Departamentul de Biostatistică, Universitatea din Texas MD Anderson Cancer Center, Houston, TX 77030, SUA

5 Departamentul de Biologie al Cancerului, Universitatea din Texas MD Anderson Cancer Center, Houston, TX 77030, SUA

6 Departamentul de oncologie medicală a sarcomului, Universitatea din Texas MD Anderson Cancer Center, Houston, TX 77030, SUA

7 Division of Surgical Oncology, James Comprehensive Cancer Center, Ohio State University Medical Center, Columbus, OH 43210, SUA

8 Lion Biotechnologies, Woodland Hills, CA 91637, SUA

9 Departamentul de Imunologie, H. Lee Moffitt Cancer Center, Tampa, FL 33612, SUA

Abstract

1. Introducere

Deși majoritatea sarcoamelor țesuturilor moi apar la extremitățile superioare și inferioare, aproximativ 20% se găsesc în retroperitoneu, unde tumorile pot provoca adesea morbiditate și mortalitate semnificative [1]. Liposarcomul bine diferențiat (WD) și diferențiat (DD) sunt tumori maligne de origine adipocitară și cel mai frecvent subtip histologic întâlnit în retroperitoneu. Tumorile WD constau în cea mai mare parte adipocite atipice, în timp ce tumorile DD au o porțiune celulară suplimentară, de înaltă calitate [2, 3]. Liposarcomul DD poate apărea din liposarcomul WD; cu toate acestea, relația precisă este încă nedovedită.

În liposarcomul retroperitoneal WD/DD, chirurgia este pilonul principal al tratamentului; cu toate acestea, deoarece tumorile sunt de obicei masive ca dimensiune (medie = 30 cm) și pot invada organele viscerale adiacente și structurile critice, rezecția este adesea destul de dificilă [4, 5]. Recurența locoregională apare frecvent, iar pacienții sunt supuși mai multor intervenții chirurgicale cu potențialul unor rate crescute de complicații [4]. În afară de intervenția chirurgicală, există puține alte opțiuni de tratament eficiente. Rolul radioterapiei nu este bine stabilit [5]. Chimioterapia citotoxică pe bază de doxorubicină este administrată frecvent, în special pentru boala DD; cu toate acestea, o analiză retrospectivă mare și recentă a raportat o rată de răspuns obiectivă de numai 12% [6].

În ultimul deceniu, s-au făcut progrese semnificative în înțelegerea biologiei moleculare a liposarcomului WD/DD. Schimbarea genetică distinctivă a acestei boli pare să fie amplificarea cromozomială la 12q13-15 [2, 3, 5]. Această regiune include câteva sute până la mii de gene, inclusiv MDM2 și CDK4. Amplificarea MDM2 are loc în aproape toate tumorile și detectarea prin fluorescență hibridizare in situ este adesea utilizată în diagnosticul liposarcomului WD/DD [2, 3]. Mai multe terapii noi, conduse de biologia bolii, au apărut recent și sunt în prezent evaluate în faza incipientă a studiilor clinice [7]. Datele preliminare publicate cu o serie mică de pacienți sugerează că se poate realiza stabilizarea bolii; cu toate acestea, ratele de răspuns obiective sunt încă extrem de scăzute: 5% pentru inhibitorul MDM2, RG7112 și 3% pentru inhibitorul CDK4/6, PD-0332991 [8, 9].

În melanom, blocarea punctului de control imun este o strategie imunoterapeutică care sa dovedit recent a avea rate de răspuns obiective impresionante și chiar prelungirea supraviețuirii, în ciuda stadiului avansat al bolii și al sarcinii tumorale severe [10-13]. Aceste terapii inhibă punctele de control moleculare (CTLA4, PD-1) sau „frânele” care apar în mod natural într-o celulă T activată. Spre deosebire de vaccinuri, blocarea punctului de control imun nu induce țintirea unui antigen tumoral specific, ci menține activarea și funcția citotoxică în celulele T care se infiltrează în tumori, care sunt deja sensibilizate în mod natural la o varietate de antigeni tumorali. Prin blocarea atât a CTLA4, cât și a PD-1 la pacienții cu melanom metastatic, Wolchok și colab. o rată de răspuns obiectivă de 53% cu contracție tumorală de până la 80% la mulți respondenți [12]. Eficacitatea clinică a blocării punctului de control imun este raportată tot mai mult pentru alte tumori solide avansate [14, 15].

Având în vedere opțiunile de tratament limitate și ineficiente disponibile în prezent pacienților cu liposarcom retroperitoneal WD și DD, am căutat să studiem micromediul tumorii naturale din punct de vedere imunologic ca primul pas pentru a explora fezabilitatea potențială a imunoterapiei în această boală. Spre deosebire de liposarcomul mixoid care are o expresie ridicată a cancerului antigenului testiculului NY-ESO-1 [16], după cunoștințele noastre, niciun antigen tumoral consistent și fiabil nu a fost identificat vreodată în liposarcomul WD/DD, ceea ce face ca strategiile de vaccinare să fie mai puțin atrăgătoare. Scopul nostru a fost de a studia răspunsul imun adaptiv și în special celulele T care se infiltrează în tumori și expresia lor a PD-1. Aceste date pot fi apoi utilizate pentru a ghida evaluarea ulterioară a strategiilor de blocare a punctelor de control imune în liposarcomul WD/DD.

2. Material și metode

Aprobarea pentru toate porțiunile acestui studiu a fost obținută de către Institutional Review Board de la Universitatea din Texas, MD Anderson Cancer Center.

2.1. Prelucrarea și analiza tumorilor proaspete prin citometrie în flux
2.2. Imunohistochimia țesutului FFPE
2.3. Corelarea clinicopatologică și metodele statistice

Datele despre rezultatele clinice au fost obținute dintr-o bază de date retrospectivă a sarcomului instituțional pentru pacienții cu și fără TLS identificate în secțiunile tumorale FFPE disponibile. Curbele Kaplan-Meier au fost utilizate pentru a estima supraviețuirea fără recurență și globală (RFS, OS) între grupurile de pacienți. Comparațiile dintre RFS și OS între grupurile de pacienți au fost efectuate utilizând teste log-rank. Toate testele au fost bilaterale și

) incluse în studiu (Tabelul 1). TIL-urile au fost identificate independent de histologie (WD versus DD), starea bolii (primară versus recurentă) sau primirea chimioterapiei sau radioterapiei înainte de rezecție.

TIL-urile au constat dintr-o populație substanțială de celule T CD3 (Figura 1) și prin analiza citometrică în flux, majoritatea acestor celule au fost celule T „helper” CD4 cu un raport CD4 la CD8 de 4,2 (interval 2,0-8,6) (Tabelul 1) . Cu toate acestea, celulele T „citotoxice” CD8 au fost găsite în toate tumorile și au reprezentat în medie 20% (8-31) din populația totală de celule T CD3. Celulele CD19 B și celulele NK CD56 au fost observate în unele tumori, în general cu o frecvență scăzută (datele nu sunt prezentate). Prezența unor populații imune selectate, inclusiv celule T CD8, a fost verificată prin imunohistochimie (Figura 1 (b)).

O analiză suplimentară a expresiei markerului de suprafață pe populația de celule T citotoxice CD8 a demonstrat o frecvență ridicată de exprimare a moleculei punctului de control imun, PD-1, care a fost observată la 65% (57-73) din celule (Tabelul 2, Figura 2). În schimb, a existat o frecvență scăzută a celulelor T CD8 cu expresia moleculei costimulatoare, 4-1BB, observată la 10% (3-19) din celule (Tabelul 2, Figura 2).


3.2. Structuri limfoide terțiare în FFPE și corelație clinică

Secțiuni de țesut din tumoră arhivată, FFPE (

) au fost analizate prin H&E și/sau imunohistochimie pentru prezența structurilor limfoide terțiare intratumorale sau TLS așa cum este descris în liposarcomul WD, anterior [19]. TLS s-au găsit în general în localizări perivasculare; cu toate acestea TLS ar putea fi găsit și în zonele adipocitare ale tumorii. Au fost observate niveluri variate de „maturitate arhitecturală” ale TLS, variind de la simple agregate de celule imune la structuri mai complexe asemănătoare centrelor germinale, de obicei găsite în ganglionii limfatici (Figura 3 (a)). Ocazional, au fost observate chiar TLS intratumorale macroscopice (datele nu sunt prezentate). Nu s-au observat diferențe consistente în caracteristicile TLS (localizarea intratumorală, maturitate/dimensiune) între tumorile WD și DD. Prin imunohistochimie, celulele dendritice mature care exprimă DC-LAMP au fost identificate în TLS (Figura 3 (b)). Costurile pentru CD4 și CD8 au demonstrat juxtapunerea aparentă a acestor celule dendritice mature lângă celulele T CD4, sugestive pentru prezentarea clasică a antigenului.

În total, TLS au fost identificate în secțiunile de țesut disponibile în 12 din 25 (48%) WD și 5 din 10 (50%) din tumorile de liposarcom retroperitoneal DD. Prezența TLS a fost asociată cu o supraviețuire mai scăzută fără recurență la pacienții cu liposarcom WD și o supraviețuire globală mai slabă la cei cu liposarcom DD (Figura 3 (c)). Nu s-au observat diferențe în starea bolii (primar versus recurent) sau tratament anterior (chimioterapie, radioterapie) între pacienții cu sau fără TLS intratumoral pentru nici o histologie.

4. Discuție și concluzii

Prima sugestie a unei componente imune active la liposarcomul WD/DD, cel puțin în unele tumori, a fost făcută la sfârșitul anilor 1990 prin două descrieri independente ale unei variante „inflamatorii” a liposarcomului WD [20, 21]. Propriul nostru grup a raportat o caracterizare mai contemporană bazată pe imunohistochimie, care a dezvăluit potențialul unui răspuns imun adaptiv natural [19]. În studiul actual, ne-am extins asupra lucrărilor noastre anterioare pentru a include toate liposarcomul retroperitoneal WD și DD „neinflamator” și, de asemenea, am folosit citometria de flux pentru a oferi o analiză mai profundă a celulelor imune. Ne-am concentrat asupra celulelor T, o componentă critică a răspunsului imun adaptiv, găsit în microambientul tumoral.

Țesutul tumoral obținut în urma intervenției chirurgicale a fost utilizat pentru studiu, deoarece acest lucru are relevanță directă pentru pacienți și, în mod important, în liposarcomul WD/DD, nu există modele animale imunocompetente validate disponibile. Marea majoritate a modelelor preclinice sunt xenogrefe stabilite la șoareci imunodeficienți [22]. Chiar și în aceste modele de xenogrefă, creșterea in vivo nu este consecventă și, de fapt, absorbția tumorii este în mare măsură limitată la tumorile DD de grad superior (comunicare personală, D. Lev). O excepție este raportul unui model de șoarece modificat genetic, în care liposarcomul WD spontan s-a dezvoltat serendipit la șoareci IL-22 supraexprimați supuși unei diete bogate în grăsimi [23]. S-a arătat că tumorile au amplificare MDM2 care confirmă diagnosticul; cu toate acestea, nu s-a mai făcut o validare independentă a acestui model, din cunoștințele noastre. Interesant, un infiltrat imun proeminent a fost observat în tumorile găsite la acești șoareci, deși caracterizarea ulterioară nu a fost raportată.

Datele din studiul actual confirmă prezența unui răspuns imun adaptiv care apare în mod natural în cadrul tumorilor liposarcomului, inclusiv prezența celulelor T CD8 citotoxice (Figura 1). Frecvența ridicată a expresiei PD-1 și expresia redusă a 4-1BB (Figura 2) implică faptul că aceste celule T CD8 care se infiltrează în tumori au fost sensibilizate la antigenul tumorii, dar nu mai sunt activate [24]. Interesant, nu s-au observat diferențe clare în frecvența celulelor T CD8 sau expresia PD-1/4-1BB la compararea histologiei (WD versus DD, grad superior) sau a stării bolii (primară versus recurentă) (Tabelele 1 și 2) . În experimente separate, am reușit să extindem aceste limfocite sau TIL-uri care se infiltrează în tumori in vitro, de la 300 la aproape 2000 de ori folosind IL-2 și metode standard stabilite pentru melanom (date neprezentate). Luate împreună, datele noastre sugerează că în liposarcomul retroperitoneal WD/DD, celulele T pot circula către microambientul tumorii și au capacitatea de a prolifera, dar lipsesc funcția antitumorală eficientă, probabil din dezactivare.

Deși nu am analizat direct expresia PD-1 prin imunohistochimie, prezența acestui marker pe celulele imune în tumorile liposarcomului WD/DD a fost confirmată într-un raport publicat [25] și recent într-o prezentare abstractă [Pollack și colab., CTOS 2014]. Ambele studii au analizat expresia imunohistochimică a PD-1 într-o varietate de sarcoame ale țesuturilor moi, care au inclus o mică cohortă de cazuri de liposarcom. Studiul nostru este primul, după cunoștințele noastre, care demonstrează expresia acestui marker prin analiza citometrică în flux.

Etiologia pentru dezactivarea citotoxică a celulelor T CD8 este necunoscută și probabil multifactorială. Majoritatea populației de celule T găsite în tumorile liposarcomului sunt de fapt celule T „ajutătoare” CD4. Colorarea intracelulară cu FoxP3 a fost pozitivă doar în câteva celule izolate (datele neprezentate) sugerând că celulele T imunosupresoare, de reglare, sunt de fapt rare în microambientul tumoral pentru liposarcomul retroperitoneal WD/DD. Alte tipuri de celule imunosupresoare, inclusiv celule supresoare derivate mieloide sau MDSC și macrofage asociate tumorii, cu toate acestea, există probabil, de asemenea, în microambientul tumoral și sunt în curs de investigare. O varietate de factori derivați de tumori atât solubili (de exemplu, citokine - IL-10, TGF-beta), cât și pe suprafața celulei (de exemplu, PD-L1) pot duce, de asemenea, la dezactivarea celulelor T CD8 și rămân de definit.

Am rezumat concluziile noastre într-o schemă prezentată în Figura 4. Răspunsurile imune adaptive au fost identificate în alte sarcoame ale țesuturilor moi [33, 34]. Imunoterapia are potențialul de eficacitate în sarcomul țesuturilor moi, dar provocarea va fi identificarea unei strategii adecvate pentru fiecare subtip histologic bazat pe date preclinice și translaționale. Rezultatele noastre oferă cadrul inițial pentru a ghida un studiu imunologic mai detaliat în liposarcomul retroperitoneal WD/DD, care este în prezent în desfășurare în laboratorul nostru. Având în vedere lipsa unor opțiuni de tratament eficiente, imunoterapia și, în special, blocarea punctului de control imun ar trebui să fie evaluate în continuare, deoarece poate oferi o nouă speranță pacienților cu această boală.