Rezerva cronică de stres imprevizibil și ovariană la șoareci

  • Articol complet
  • Cifre și date
  • Referințe
  • Suplimentar
  • Citații
  • Valori
  • Licențierea
  • Reimprimări și permisiuni
  • PDF

Abstract

（的 心理 压力 被 认为 是 卵巢 储备 减少 OR DOR） 的 重要 原因。 缺乏, 心理 心理 压力 诱发 的 DOR 模型 模型。 我们 旨在 周 8 慢性 慢性 不可 预测 压力 （US CUS 模式 对 57 C57BL/6 小鼠 卵巢储备 US 生殖 生殖 分泌 的 影响。 我们 在, 在 CUS 暴露 8 后 后, CUS 模型 小鼠 的 原始 卵泡 、 前 卵泡 以及 黄 体 的 数量 显 著 减少。 与 对照 组 模型, 模型 小鼠 的 血清 卵泡 刺激素 、 、 更高 酮 水平 更高, 黄 黄 体 生成 素 、 雌二醇 、 雄 激素 和 抗 苗 勒 管 激素 水平 更低。 此外, 我们 发现 FSH 受体 和 AMH 蛋白 在 模型 小鼠 卵巢 中 被 下调。 尽管 两组 之 US 产仔 数 未 发现 明显 但, 但 暴露 于 CUS 6 后 后, 组 组 的 卵巢 储备 量 显 著 降低 这些 结果 结果 证实 以下 假设 ： 我们 采用 周 8 周 CUS 可以 可以 诱导 C57BL/6 小鼠 的 DOR 模型, 可能 可能 对 卵巢 储备 造成 长期 不利 影响。 因此, 我们 的 结果 表明 我们 已经 成功 建立 了 心理 应激 诱导 的 DOR 动物 模型, 可 用于 进一步 研究。

ovariană

Rezumatele chinezești sunt traduse de Prof. Dr. Xiangyan Ruan și echipa ei: Spitalul de obstetrică și ginecologie din Beijing, Universitatea Medicală Capitală, Beijing 100026, China.

Introducere

Rezerva ovariană diminuată (DOR) este definită ca o stare intermediară între fiziologia reproductivă normală și insuficiența ovariană prematură și se caracterizează printr-o scădere a numărului sau a calității stocului de ovocite disponibile. Biomarkerii DOR utilizați în practica clinică includ, dar nu se limitează la AMH mai scăzut, FSH mai mare, FSH/LH și număr de foliculi antrali (AFC) [1]. Literatura existentă indică faptul că factorii psihogeni au apărut ca unul dintre elementele majore asociate cu DOR și cu reproducerea afectată a femeilor [2-5]. Cu toate acestea, din cauza lipsei unui model animal adecvat care să poarte simptomele similare ale DOR, mecanismul cauzalității este încă neclar.

Stresul cronic imprevizibil (CUS) este una dintre paradigmele cele mai frecvent utilizate pentru a induce un comportament anxios în modele animale și pentru a studia bolile asociate stresului cronic. CUS constă în expunerea continuă a animalelor la situații stresante sau stimuli stresanți care imită stresul vieții de zi cu zi. Acest model este aplicat pe scară largă studiului proceselor neurobiologice care mediază efectele stresului cronic [6]. Există doar câteva studii care utilizează acest tip de model pentru a studia modificările biologiei ovariene după expunerea la stres [7-9]. Din câte știm, niciunul dintre aceste studii nu a indus un fenotip tipic DOR sau a explorat atât rezerva foliculului ovarian, cât și modificările hormonilor serici asociate cu DOR.

Prezentul studiu a fost întreprins pentru a dezvălui o schimbare a fenotipului DOR la ​​șoarecii C57BL/6 folosind o paradigmă de stres cronică imprevizibilă. De asemenea, au fost prezentate o serie de modificări ale hormonilor de reproducere și factori legați de dezvoltarea foliculului pentru a valida deteriorarea cronică a stresului asupra funcțiilor biologice ovariene. O scurtă sondă a efectului pe termen lung al CUS asupra morfologiei ovariene a fost efectuată prin experimente de împerechere cu o analiză histologică ovariană.

Materiale și metode

Animale

Șoarecii C57BL/6 de sex feminin supuși paradigmei stresului au avut vârsta cuprinsă între 6 și 8 săptămâni. Treizeci de șoareci au fost împărțiți în mod aleator și în mod egal în grupul model și grupul martor. Experimentul de paradigmă CUS a fost repetat de trei ori. Șoarecii masculi de cincisprezece săptămâni au fost împerecheați cu șoareci femele pentru a evalua rata sarcinii. Experimentul de împerechere a fost repetat de două ori. Toate procedurile experimentale pe animale au fost aprobate de Comitetul Etic Experimental Animal de la Universitatea Fudan. Greutatea corporală a șoarecilor din fiecare grup a fost măsurată în fiecare săptămână. Indicele greutății ovarului a fost calculat folosind următoarea formulă: indicele greutății ovarului = greutatea ovariană/greutatea corporală.

Stres cronic imprevizibil (CUS)

Procedura CUS s-a bazat pe rapoartele anterioare cu câteva modificări [10]. Au fost administrați doi factori de stres la fiecare model de șoarece timp de opt săptămâni. Pentru a evita toleranța, puterea anumitor factori de stres a fost crescută în fiecare săptămână. În mod specific, factorii de stres au fost după cum urmează: stres de reținere, suspensie la coadă, înot epuizant, scuturare orbitală, înclinare a cuștii la 45 °, așternut umed, cușcă goală, stres de zgomot, lumină flash, izolare socială, aglomerare socială, schimbare lumină-întuneric, lipsă de hrană, și privarea de apă. Stresorii au fost programați aleatoriu pe o perioadă de o săptămână și au fost repetați pe parcursul celor 8 săptămâni. Privarea de hrană sau apă și așternutul umed au fost aplicate evitând în a șaptea zi a fiecărei săptămâni pentru a preveni abaterea greutății corporale. Șoarecii martor nestresați au fost adăpostiți în grupuri fără intervenție. Un exemplu al programului CUS săptămânal este furnizat în Tabelul 1 din Materialul suplimentar. Șoarecii au fost sacrificați după CUS de 8 săptămâni. Prelevarea probelor a fost efectuată între orele 8-10, când corticosteronul seric (CORT) a fost la nivelul de bază al fluctuației zilnice.

Ciclism estru

Frotiurile vaginale au fost luate în fiecare dimineață timp de 3 săptămâni înainte de sacrificiu pentru a evalua ciclul estru. Experimentul a fost repetat de trei ori cu fiecare replică conținând 6 șoareci în fiecare grup. Etapa ciclului estru a fost definită printr-o analiză microscopică ușoară a tipului celular predominant în probele de frotiu vaginal [11].

Testul hormonului seric

Hormonul seric a fost măsurat prin test imunosorbent legat de enzime (ELISA) urmând instrucțiunile producătorului. Kituri ELISA comerciale au fost utilizate pentru a evalua CORT, LH, FSH, hormonul anti-Müllerian (AMH), testosteron (T) și E2.Pentru fiecare test, au existat 6-12 probe în fiecare grup cu trei replici. Informațiile despre kiturile ELISA utilizate sunt listate în Tabelul S2 din Materialele suplimentare.

Secțiunea serială a ovarului și numărarea foliculilor

Pentru analiza histologică, ovarele fixe au fost încorporate în parafină, secționate în serie și colorate pentru numărarea foliculilor pe baza metodelor anterioare [12]. Numărul total de foliculi și corp galben per ovar a fost calculat prin adăugarea numărului fiecărei secțiuni a cincea pe întregul ovar. Foliculii au fost clasificați în patru etape în conformitate cu sistemul Oktay modificat [13]. Numărarea a fost repetată de trei ori cu fiecare replică conținând 6-8 ovare stângi de la 6-8 șoareci din fiecare grup.

Experimente de împerechere

După 8 săptămâni de paradigmă a stresului, zece șoareci femele din fiecare grup au fost selectați pentru reproducere pentru a-și evalua fecunditatea. Șoarecii femele au fost împerecheați cu șoareci masculi C57BL/6 la aceeași vârstă timp de 1 săptămână la un raport de 2: 1 pe cușcă. După încheierea perioadei de împerechere, femelele au fost cântărite în serie și examinate pentru semne de sarcină. Au fost numărate numărul de șoareci F1 din două grupuri. După înțărcare, șoarecii materni au fost sacrificați. Ovarele au fost colectate și fixate ca mai sus și examinate pentru modificări histologice. Experimentul a fost repetat de două ori, fiecare replică conținând 5 șoareci în fiecare grup.

Western blot

Ovarele din ambele grupuri au fost omogenizate în tampon de liză. Lizatele au fost fierte timp de 5 minute și supuse la SDS-PAGE. Probele de proteine ​​au fost apoi transferate la o membrană de fluorură de poliviniliden (PVDF) și blocate cu 5% albumină serică bovină în Tween salină tamponată cu Tris (TBST) timp de 1 oră. Membranele PVDF au fost apoi incubate peste noapte la 4 ° C cu anticorpi primari împotriva receptorului hormonal foliculostimulant (FSHR) (1: 1000, PA5-50963, Invitrogen) sau AMH (1: 100, 103233, Abcam), urmat de incubare cu un anticorp secundar (1: 1000, 4414, Cell Signaling Technology) timp de 1 oră la temperatura camerei. Legarea anticorpilor a fost detectată prin metoda ECL utilizând substratul ECL Western Blotting (Millipore, WBKLS0500). Benzile de pe filmul cu raze X au fost apoi scanate. Analiza a fost repetată de două ori cu fiecare replică conținând 5 șoareci din fiecare grup.

Imunohistochimie

Secțiunile ovariene au fost deparafinizate în xilen, rehidratate într-o serie gradată de etanol și fierte în citrat de sodiu 10 mM pentru recuperarea antigenului. După incubare într-o soluție de 0,3% H2O2 și blocarea cu 10% ser normal de capră în 0,1% Triton X-100, secțiunile au fost incubate peste noapte cu anticorp anti-receptor FSH (Abcam, ab150557) sau anticorp anti-AMH (Abcam, ab24542) la 4 ° C. După spălare, secțiunile au fost incubate timp de 2 ore cu IgG anti-iepure de cal conjugat HRP la temperatura camerei, vizualizate cu DAB, deshidratate în etanol și montate cu lamele de acoperire pentru observare. Analiza a fost repetată de trei ori cu fiecare replică conținând 6 felii de 6 ovare de la 6 șoareci din fiecare grup.

analize statistice

Au fost efectuate cel puțin trei replici pentru fiecare tratament, cu excepția experimentelor de împerechere și a numărului de foliculi ovarieni post-travaliu. Toate datele sunt prezentate ca valoare medie ± eroare standard (SEM). Software-ul SPSS 22.0 a fost utilizat pentru analiza statistică. O comparație a distribuțiilor variabilelor continue între cele două grupuri a fost analizată folosind Student’s t-Test. Comparația modificărilor greutății corporale între cele două grupuri a fost făcută utilizând măsurători repetate de analiză a varianței. p valori mai mici de 0,05 au fost considerate semnificative statistic.

Rezultate

Efectele expunerii CUS asupra biomarkerilor de stres la șoareci și a funcției ovariene

Greutatea corporală (Tabelul 1), indicele de greutate ovariană (Figura 1 (A)) și nivelul seric al CORT (Figura 1 (B)) au fost monitorizate pentru a controla eficacitatea factorilor de stres. În grupul model supus protocolului de 8 săptămâni de CUS, greutatea corporală medie a fost semnificativ scăzută în timpul protocolului de 8 săptămâni (p Rezerva ovariană diminuată indusă de stres cronic imprevizibil la șoareci C57BL/6

Publicat online:

Figura 1. Valabilitatea CUS pentru a induce stresul la șoareci și a afecta funcția de reproducere. (A) Indicele greutății ovarului. (B) Concentrațiile serice medii de CORT. (C) Numărul de foliculi în diferite stadii. (D) Durata medie a ciclului diferitelor etape ale ciclului estru în ultimele două săptămâni înainte de sacrificiu. (E-J) Concentrațiile serice de hormoni de reproducere. M = grup model CUS; C = grup de control; primordial: folicul primordial; primar: folicul primar; secundar: folicul secundar; antral: folicul antral; atretic: folicul atretic; *: p Figura 1. Valabilitatea CUS pentru a induce stres la șoareci și a afecta funcția de reproducere. (A) Indicele greutății ovarului. (B) Concentrațiile serice medii de CORT. (C) Numărul de foliculi în diferite stadii. (D) Durata medie a ciclului diferitelor etape ale ciclului estru în ultimele două săptămâni înainte de sacrificiu. (E-J) Concentrațiile serice de hormoni de reproducere. M = grup model CUS; C = grup de control; primordial: folicul primordial; primar: folicul primar; secundar: folicul secundar; antral: folicul antral; atretic: folicul atretic; *: p Rezerva ovariană diminuată indusă de stres cronic imprevizibil la șoareci C57BL/6

Publicat online:

Tabelul 1. Comparația greutății corporale săptămânale la șoareci model și martor.

Șoarecii din grupul model au prezentat o creștere semnificativă a lungimii medii a fazei dieste a ciclului estru (Figura 1 (C)). A existat, de asemenea, o scădere în zilele fazei estro comparativ cu grupul martor. Numărul de foliculi primordiali (p Rezerva ovariană diminuată indusă de stres cronic imprevizibil la șoareci C57BL/6

Publicat online:

Figura 2. Analiza expresiei proteinelor FSHR și AMH în ovare. (A) Imagini Western blot ale FSHR și AMH în cele două grupuri. (B) Rezultatele colorării imunoreactivității care arată expresia proteinelor FSHR și AMH în foliculii antrali și foliculii preantrali. Mărire: × 400. Bară de scară = 12,5 μm.

Figura 2. Analiza expresiei proteinelor FSHR și AMH în ovare. (A) Imagini Western blot ale FSHR și AMH în cele două grupuri. (B) Rezultatele colorării imunoreactivității care arată expresia proteinelor FSHR și AMH în foliculii antrali și foliculii preantrali. Mărire: × 400. Bară de scară = 12,5 μm.

CUS nu afectează în mod semnificativ fecunditatea șoarecilor, dar are un efect pe termen lung asupra epuizării foliculilor

După tratamentul de 8 săptămâni, șoarecii model au prezentat o rată de fertilitate puțin mai mică. Cu toate acestea, numărul puilor a fost similar între cele două grupuri (Figura 3 (A)). După 21 de zile de sarcină și 21 de zile de lactație, efectele de epuizare a foliculilor au fost încă găsite în grupul model. (Figura 3 (B)) Numărul de foliculi primordiali, foliculi primari și foliculi antrali din grupul model au fost încă semnificativ mai mici decât cei din grupul martor. A existat, de asemenea, o creștere a foliculilor atretici în grupul model.

Publicat online:

Figura 3. Fecunditatea șoarecilor în ambele grupuri și efectul stresului pe termen lung la șoareci. (A) Mărimea așternutului și rata fertilității ambelor grupuri. (B) Numărul de foliculi în diferite stadii la șoareci postlabor.

Figura 3. Fecunditatea șoarecilor în ambele grupuri și efectul stresului pe termen lung la șoareci. (A) Mărimea așternutului și rata fertilității ambelor grupuri. (B) Numărul de foliculi în diferite stadii la șoareci postlabor.

Discuţie

Studiile clinice au sugerat diferite legături între declinul accelerat al foliculului și tulburări psihologice [14]. Cu toate acestea, dovezile directe ale epuizării grupului de foliculi în repaus pot fi furnizate în mod fiabil numai printr-o evaluare a numărului total de foliculi din ovarele întregi după ooforectomie. Acest lucru evidențiază importanța dezvoltării unui model animal de DOR indus de stres psihologic cronic. În acest studiu, am adoptat o paradigmă CUS de 8 săptămâni pe șoareci C57BL/6 pentru a imita diferiții factori de stres pe care îi experimentează femeile în fiecare zi și pentru a valida efectele directe ale stresului asupra reproducerii șoarecilor femele.

Fiind cea mai răspândită tulpină consangvinizată a șoarecilor modificați genetic, șoarecii C57BL/6 par a fi mai puțin vulnerabili la stres decât alte tulpini de șoareci [15, 16]. Prin urmare, am observat efectul CUS asupra șoarecilor după o serie de timp de expunere la stres diferit (datele nu sunt date). Și am observat modificări biologice reproductive semnificative sub paradigma stresului de 8 săptămâni, mai lungă decât paradigma tipică de 4 săptămâni; și a ales acest timp de expunere la stres pentru a fi condiția potrivită pentru a induce DOR. Creșterea în greutate corporală și nivelul CORT seric sunt alți biomarkeri ai stresului cronic [17-19]. Am observat o creștere distinctă a greutății corporale în timpul procesului CUS și creșterea nivelului CORT seric după tratamentul CUS de 8 săptămâni.

În studiile anterioare pe animale, cercetătorii au descoperit că un regim CUS de 30 de zile ar putea reduce epuizarea foliculului secundar și antral la șoareci [7]. Cu toate acestea, nu au observat modificări ale foliculului primordial sau primar. În acest studiu, folosind paradigma CUS de 8 săptămâni, am demonstrat că numărul foliculilor primordiali și etapele foliculilor preantrali au scăzut semnificativ.

Studiile clinice anterioare au arătat că femeile cu stres zilnic ridicat prezintă niveluri serice mai ridicate de FSH și niveluri mai scăzute de LH și E2, precum și șanse mai mari de anovulație [2, 20]. Folosind modelul animal CUS, am găsit modificări similare ale FSH și LH și E2 mai mici în serul model de șoareci, ceea ce este în conformitate cu aceste studii clinice. Expresia proteinei FSHR neregulată a confirmat reacția hormonală deteriorată la șoarecii model. AMH este unul dintre cei mai des folosiți markeri ai rezervei ovariene, s-a dovedit că este legat de epuizarea timpurie a foliculilor [21-22]. Un alt hormon cu importanță emergentă este T, precursorul E2. Atât AMH, cât și T s-au dovedit a fi eficiente în îmbunătățirea rezervei ovariene funcționale la femelele cu DOR [23-28]. Studiul nostru a constatat aceeași scădere a nivelului seric de T și AMH la șoarecii model CUS. Aceste rezultate au verificat în continuare că paradigma noastră CUS de 8 săptămâni poate provoca fenotipul DOR la ​​șoareci.

Nu am observat fertilitatea deteriorată semnificativ în experimentul de împerechere. Cu toate acestea, în ciuda ratei de fertilitate, a existat încă un efect de epuizare a foliculilor la șoarecii model la 6 săptămâni după paradigma stresului. Acest rezultat sugerează posibilitatea unor efecte adverse pe termen lung ale stresului cronic asupra rezervei ovariene.

În lumina acestor rezultate, studiul nostru demonstrează că o paradigmă CUS de 8 săptămâni poate induce diminuarea fenotipului rezervei ovariene la șoarecii C57BL/6. CUS poate exercita, de asemenea, un efect nociv pe termen lung asupra DOR la ​​șoareci. Modelul animal DOR stresat oferă oportunități suplimentare de a studia mecanismele, complicațiile și tratamentul DOR induse de factori psihologici.

Tabelul 1. Comparația greutății corporale săptămânale la șoareci model și martor.