Jianchao Xu, Pandelakis A. Koni, Peili Wang, Guoyong Li, Leonard Kaczmarek, Yanling Wu, Yanyan Li, Richard A. Flavell, Gary V. Desir, Canalul de potasiu cu tensiune Kv1.3 reglează homeostazia energetică și greutatea corporală, uman Molecular Genetics, volumul 12, numărul 5, 1 martie 2003, paginile 551–559, https://doi.org/10.1093/hmg/ddg049

care reglează

Abstract

Canalele de potasiu cu tensiune (Kv) reglează potențialul membranei celulare și controlează o varietate de procese celulare. Canalele Kv1.3 sunt exprimate în mai multe țesuturi și se consideră că participă la reglarea volumului celular, apoptoză, activarea celulelor T și homeostazia solutului renal. Examinarea șoarecilor cu deficit de Kv1.3 (Kv1.3 -/-), generată de direcționarea genelor, a relevat un rol nerecunoscut anterior pentru Kv1.3 în reglarea greutății corporale. Într-adevăr, șoarecii Kv1.3 -/- cântăresc semnificativ mai puțin decât colegii de control. Mai mult decât atât, șoarecii knockout sunt protejați de obezitatea indusă de dietă și câștigă în mod semnificativ mai puțină greutate decât martorii pentru colegii atunci când sunt plasați pe o dietă bogată în grăsimi. În timp ce aportul de alimente nu a diferit semnificativ între Kv1.3 -/- și martori, rata metabolică bazală, măsurată în repaus prin calorimetrie indirectă, a fost semnificativ mai mare la animalele knockout. Aceste date indică faptul că canalele Kv1.3 pot participa la căile care reglează greutatea corporală și că inhibarea canalului crește rata metabolică bazală.

INTRODUCERE

Canalele de potasiu cu tensiune (Kv) sunt un grup divers de proteine ​​de membrană care reglează potențialul membranei celulare. Kv1.3, un membru al familiei Shaker a canalelor Kv, se găsește în multe țesuturi, inclusiv în rinichi (1), limfocite (2-6), SNC (7), ficat, mușchi scheletic, testicul și spermatozoizi (8), și osteoclaste (9, 10). Poate participa la o varietate de funcții celulare, inclusiv apoptoza, reglarea volumului celular și stimularea celulelor T (3, 4, 11, 12). Activitatea canalului este reglată în sus de kinaza activată cu glucocorticoizi serici (SGK), unul dintre principalii mediatori ai acțiunii aldosteronului la nivelul tubului distal renal (13). Protein kinaza C (PKC) crește (14) și tirozin kinaza (TK) inhibă activitatea canalului Kv1.3 (15). În neuronii cu bulb olfactiv, unde Kv1.3 mediază o proporție mare din curentul exterior măsurat, activitatea sa este reglată în jos de insulină prin activarea receptorului TK (15, 16). Experimentele de mutageneză direcționate la fața locului indică faptul că insulina determină fosforilarea mai multor reziduuri de tirozină în Kv1.3.

Rolul semnalizării insulinei în creier nu este bine înțeles (17). Receptorii insulinei cerebrale se găsesc nu numai în bulbul olfactiv, ci și în plexul coroid, hipocampul și nucleul arcuat al hipotalamusului. Hipotalamusul exprimă GLUT4, un transportor de glucoză sensibil la insulină și este un domeniu important în ceea ce privește controlul apetitului și cheltuielile de energie (18). Acesta integrează o varietate de semnale periferice, inclusiv leptină și insulină, și transmite mesaje adecvate către neuroni specifici, fie pentru a crește, fie pentru a reduce consumul de alimente. În mod optim, aportul de energie este egal cu cheltuielile de energie, iar organismul este capabil să mențină o greutate corporală constantă. Producția de energie poate varia foarte mult, deoarece constă nu numai dintr-o porțiune obligatorie care susține funcțiile celulare și organice (rata metabolică bazală), ci și din două componente variabile, adică termogeneza adaptivă și activitatea fizică (19). Există date care sugerează că hipotalamusul modulează și termogeneza adaptativă. Detaliile moleculare ale acestor interacțiuni sunt în curs de investigare intensă, deoarece incidența obezității a atins proporții epidemice în țările dezvoltate.

În ciuda datelor extinse referitoare la proprietățile cinetice și farmacologice și la reglarea Kv1.3, rolul sau rolurile sale fiziologice nu sunt bine înțelese. Cu toate acestea, știm că canalul este exprimat în hipotalamus (20) și că este reglat de insulină și, prin urmare, poate fi considerat unul dintre substraturile receptorilor de insulină (IRS). Interesant, șoarecii cu o perturbare specifică neuronului a genei IR (șoareci NIRKO) au dezvoltat obezitate sensibilă la dietă, cu creșteri ale nivelului de grăsime corporală și de leptină plasmatică, rezistență ușoară la insulină, niveluri crescute de insulină plasmatică și hipertrigliceridemie, sugerând semnalizarea IR în jocurile SNC un rol important în reglementarea eliminării energiei, a metabolismului combustibilului (21). Pentru a examina rolul fiziologic al Kv1.3 in vivo, în special pentru a testa dacă Kv1.3 servește ca IRS în controlul greutății corporale și în homeostazia energetică, am generat șoareci cu deficit de Kv1.3 (Kv1.3 -/-) prin întreruperea Kv1.3 .3 locus folosind recombinarea omoloagă și le-a examinat fenotipul.

REZULTATE

Scăderea greutății corporale la șoarecii Kv1.3 -/-

Figura 1A descrie strategia utilizată pentru a perturba locusul Kv1.3. Perturbarea genelor a fost confirmată prin PCR și western blot (Fig. 1B și C). Raportul Mendelian așteptat a fost observat la șoarecii născuți din împerecherea părinților heterozigoți. Șoarecii nou-născuți Kv1.3 -/- au apărut normali, nu au necesitat precauții specifice pentru supraviețuire și creștere și nu s-au putut distinge de colegii de așternut de tip sălbatic (WT) (Kv1.3 +/+) în ceea ce privește aspectul și comportamentul.

Kv1.3 -/- animalele au cântărit în mod constant mai puțin decât martorii colegilor, așa cum este ilustrat în Figura 2A, unde șoarecii femele au fost observați în cuști metabolice timp de până la 35 de zile începând cu vârsta de 50 de zile. Diferența de greutate a fost observată și la șoarecii masculi hrăniți în perechi (Fig. 2B). Lungimile corpului nu s-au putut distinge, la fel ca și structura osoasă evaluată prin scanare cu absorptiometrie cu raze X cu energie duală (DEXA). Deși conținutul total de grăsime corporală estimat de DEXA a fost mai mic la șoarecii Kv1.3 -/-, diferența nu a atins semnificația statistică (Tabelul 1).

Creșterea ratei metabolice bazale la șoareci Kv1.3 -/-

Greutatea corporală este controlată de diferența netă dintre consumul și consumul de energie. Prin urmare, am măsurat aportul de energie, rata metabolică și nivelurile de activitate la șoareci Kv1.3 -/-, pentru a elucida în continuare rolul Kv1.3 în reglarea greutății corporale. Nu au existat diferențe semnificative în aportul de alimente între șoarecii Kv1.3 -/- și colegii de control. În schimb, rata metabolică bazală (măsurată prin calorimetrie indirectă între orele 11:00 și 16:00) a fost semnificativ mai mare la șoarecii Kv1.3 -/- (Tabelul 1). Cea mai mare rată metabolică a șoarecilor Kv1.3 -/- nu a putut fi explicată prin modificări ale nivelului de activitate fizică, deoarece atât șoarecii knockout, cât și colegii de control au fost la fel de activi în timpul perioadei de observare (Tabelul 1).

Șoarecii Kv1.3 -/- sunt rezistenți la obezitatea indusă de dietă

Am testat apoi dacă întreruperea genei Kv1.3 a oferit o protecție împotriva obezității induse de dietă. Rata metabolică, nivelurile de activitate și aportul caloric au fost măsurate în control și șoarecii Kv1.3 -/- expuși la o dietă bogată în grăsimi. Așa cum se arată în Figura 3A, șoarecii Kv1.3 -/- au câștigat în mod semnificativ mai puțină greutate decât martorii pe o dietă bogată în grăsimi. Diferența de creștere în greutate a fost evidentă în a doua lună, a atins semnificația statistică în a treia lună și a persistat până la sfârșitul perioadei de observare. Diferența de greutate a fost observată atât la șoareci masculi, cât și la femele Kv1.3 -/- (Fig. 3B). În timp ce rata metabolică a fost semnificativ mai mare la șoarecii Kv1.3 -/- pe o dietă bogată în grăsimi, nivelul activității bazale și aportul de alimente nu s-au putut distinge (Tabelul 2). Așa cum ar fi de așteptat pentru animalele obeze, șoarecii Kv1.3 +/+ au dezvoltat hiperglicemie, în ciuda unei creșteri semnificative a nivelului de insulină circulant (Tabelul 2). În schimb, Kv1.3 -/- a menținut zaharurile normale din sânge cu niveluri relativ mici de insulină plasmatică (Tabelul 2).

DISCUŢIE

Principala constatare a acestor studii se referă la faptul că șoarecii care poartă o genă Kv1.3 perturbată cântăresc semnificativ mai puțin decât cei care controlează colegii și sunt protejați împotriva obezității induse de dietă. Scăderea greutății corporale nu poate fi explicată prin efectul sistemic nespecific al eliminării genetice, deoarece animalele Kv1.3 -/- nu au putut fi distinse de colegii de control, prin comportamentul lor, nu au necesitat precauții speciale pentru reproducere și au avut o viață similară speranță (până la 18 luni de observație). Mai mult, din moment ce aportul de alimente de șoareci Kv1.3 -/- a fost similar cu cel al martorilor pentru coșul de gunoi, pierderea în greutate observată la animalele eliminabile nu ar fi putut fi cauzată de o scădere a aportului de energie.

Hipotalamusul este recunoscut ca o componentă importantă a sistemului care reglează echilibrul energetic și greutatea corporală (19, 22). Acesta integrează o serie de semnale periferice, inclusiv leptină și insulină, și neuroni specifici semnalului pentru a crește sau a reduce aportul de energie. Deoarece aportul de alimente nu a fost afectat de întreruperea Kv1.3, este puțin probabil ca activitatea canalului Kv1.3 să contribuie semnificativ la căile de semnal care reglează apetitul.

Este clar că inactivarea genei Kv1.3 duce la o creștere semnificativă a ratei metabolice bazale. Într-o stare stabilă, aportul de energie este egal cu cheltuielile de energie, iar organismul este capabil să mențină o greutate corporală constantă. La fel ca aportul de alimente, producția de energie poate varia foarte mult. Pe lângă cheltuielile de energie necesare funcțiilor celulare și ale organelor (rata metabolică bazală), există două componente variabile - termogeneza adaptivă și activitatea fizică (18) - care reglează producția de energie. Șoarecii Kv1.3 -/- au avut același nivel de activitate fizică ca și tovarășii de control în repaus, perioada în care rata metabolică bazală a fost evaluată prin calorimetrie indirectă. Prin urmare, concluzionăm că este puțin probabil ca o creștere a activității fizice să explice creșterea observată a ratei metabolice a șoarecilor Kv1.3 -/-.

Trebuie remarcat faptul că, deși datele noastre susțin cu tărie noțiunea că canalele Kv1.3 participă la reglarea greutății corporale, ele nu o demonstrează în mod concludent. Deoarece șoarecii Kv1.3 -/- utilizați în studiile noastre au fost crescuți ca congenici B6/129, regiunea vizată poate conține gene suplimentare legate de locusul Kv1.3, care ar putea afecta greutatea corporală și metabolismul energetic. De exemplu, locurile trăsăturilor cantitative au fost mapate folosind tulpini knockout/congenice (23), iar șoarecii șoareci transgenici care exprimă supra enzima 11B hidroxisteroid dehidrogenază tip 1 sunt predispuși la apariția obezității viscerale, în special atunci când sunt puși pe o dietă bogată în grăsimi (24).

În concluzie, rezultatele noastre sugerează că Kv1.3 este o componentă importantă a căilor care reglează greutatea corporală și homeostazia energetică. Kv1.3 -/- animalele cântăresc semnificativ mai puțin decât colegii de control, mai ales pentru că au rate metabolice bazale mai ridicate, probabil datorită creșterii termogenezei. Sunt necesare studii suplimentare pentru a elucida detaliile moleculare exacte care stau la baza efectului Kv1.3 asupra ratei metabolice, deoarece canalul este exprimat în sistemul nervos central, grăsime albă și brună și mușchiul scheletic. Cu toate acestea, studiul actual evidențiază rolul potențial al canalelor Kv1.3 în reglarea greutății corporale și identifică canalul și calea sa de semnalizare ca posibile ținte pentru dezvoltarea medicamentelor utile în gestionarea obezității, o afecțiune care a atins proporții epidemice în țările dezvoltate.

MATERIALE ȘI METODE

Generarea șoarecilor cu deficit de Kv1.3

Gena Kv1.3 a fost izolată dintr-o bibliotecă lambda Fix II 129Sv/J (Stratagene) folosind o regiune de 5 ′ a omologului șobolanului (numărul de acces GenBank m30441) ca sondă. Identitatea clonei a fost confirmată prin maparea și secvențierea restricțiilor. Regiunea vizată se întinde pe o regiune de 8,2 kb între un situs BamHI în amonte și capătul 3 'al clonei genomice lambda Fix II. Situl BamHI a fost ulterior eliminat prin umplerea finală a polimerazei Klenow și re-ligare. Constructul a fost apoi linearizat cu XhoI prin digestie parțială și o casetă de genă timidin kinază a virusului herpes simplex a fost inserată în site-ul vector XhoI la capătul 3 ′ al regiunii vizate după umplerea finală a Klenow. O casetă de rezistență la neomicină XhoI/SalI de la pMC1neopA (Stratagene) a fost apoi inserată în situsul XhoI 5 ′ de Kv1.3 în orientarea opusă față de Kv1.3 Aceasta regenerează situsul XhoI în aval de caseta de rezistență la neomicină. Regiunea XhoI/ScaI de 1,8 kb a Kv1,3 a fost apoi excizată și constructul a fost re-ligat după umplerea finală a Klenow. Brațele stânga și dreapta ale construcției de vizare sunt de 4,5 și respectiv 1,8 kb.

Vectorul de țintire (a se vedea Fig. 1A) a fost liniarizat la un sit NotI și 25 mg au fost utilizate pentru a electropora 107 celule stem embrionare W9.5. Celulele stem embrionare au fost apoi placate pe fibroblaste embrionare tratate cu mitomicină C și selecția medicamentului a cerut 24 de ore mai târziu cu 2 m M ganciclovir (Syntex) și 0,3 mg/ml G418 (GIBCO-BRL). Clonele și șoarecii de celule stem embrionare au fost selectați prin analiza Southern blot cu digestie BamHI cu sondele a și b. Sonda a este o regiune EcoRI de 1,5 kb, iar sonda b este un fragment HincII/SalI de 0,5 kb la capătul 3 ′ al clonei genomice. Celulele stem embrionare recombinate omoloage au fost injectate în blastocisti C57BL/6, iar masculii himerici au fost crescuți la femele C57BL/6. Șoarecii Kv1.3 -/- și colegii de control folosiți în aceste studii au fost descendenți F10 - F12 obținuți din intersecții B6/129. Toți șoarecii au fost găzduiți în condiții specifice fără patogeni, în conformitate cu ghidurile instituționale de îngrijire și utilizare a animalelor.

Western blot

Omogenatele au fost preparate din ficat, mușchi scheletic, grăsime albă și grăsime brună de la șoareci Kv1.3 -/- sau Kv1.3 +/+. Proteina (10 ug) a fost rezolvată cu 10% SDS - PAGE și transferată la o membrană de nitroceluloză, care a fost sondată cu un anticorp policlonal Kv1.3 de iepure anti-uman (1: 200; Santa Cruz Biotechnology Inc.).

ADN-ul genomic a fost amplificat prin reacția în lanț a polimerazei (PCR) folosind primerii specifici Kv1.3 (5 ′ exemplu este ATACTTCGACCCGCTCCGCAATGA, 3 ′ GCAGAAGATGACAATGGAGATGAG), denaturare la 94 ° C timp de 1 min, recoacere la 55 ° C timp de 2 min și extindere la 68 ° C timp de 3 minute, 35 de cicluri.

Scanare absorptiometrie cu raze X cu energie duală

Compoziția întregului corp a fost analizată de DEXA (PIXImus, GE-Lunar, CT, SUA). Șoarecii au fost anesteziați cu ketamină și xilazină. Precizia a fost determinată folosind fantome cu valori cunoscute. Corelația masei țesutului slab al corpului total a fost excelentă (r 2 = 0,99), la fel ca și componentele mai mici ale masei grase și ale masei osoase (r 2 = 0,86 și respectiv r 2 = 0,92). Mașina este precisă cu un coeficient de variație intraindividual mediu de 1,60% pentru conținutul mineral osos și 0,84% pentru densitatea minerală osoasă. Analiza totală a corpului a fost achiziționată în 5 minute, iar datele au fost analizate folosind software-ul furnizat de producător.

Măsurarea ratei metabolice și a nivelurilor de activitate

Șoarecii au fost adăpostiți într-o cameră liniștită la o temperatură ambiantă de 24 ° C. Rata metabolică a fost măsurată prin calorimetrie indirectă utilizând un sistem Oxymax cu patru camere (Columbus Instruments, Columbus, OH, SUA), un calorimetru indirect, cu circuit deschis. Consumul de O2 și producția de CO2 au fost măsurate la fiecare 40 de minute timp de până la 48 de ore. Producția de căldură a fost calculată și exprimată per gram de greutate corporală (cal/h/g BW). Măsurătorile obținute în perioada de 5 ore (11 a.m. - 4 p.m.) în două zile consecutive au fost mediate. Nivelurile de activitate au fost evaluate simultan folosind tehnica fasciculului optic folosind un Opto-Varimex Mini (Columbus Instruments, Columbus, OH, SUA).

Cui îi trebuie adresată corespondența la: Secția de Nefrologie, Departamentul de Medicină, Școala de Medicină Yale, 333 Cedar Street, LMP 2073, PO Box 208029, New Haven, CT 06520-8029, SUA. Tel: +1 2035062500; Fax: +1 5084628950; E-mail: [email protected]

Autorii doresc să se știe că, în opinia lor, primii doi autori ar trebui considerați ca un prim autor comun.