Parcul Ji Hun

1 Centrul de cercetare a fluidelor corporale Hanbang, Universitatea Wonkwang, Shinyong-dong, Iksan, Jeonbuk 570-749, Republica Coreea

metabolic

Min Chul Kho

1 Centrul de cercetare a fluidelor corporale Hanbang, Universitatea Wonkwang, Shinyong-dong, Iksan, Jeonbuk 570-749, Republica Coreea

2 Colegiul de Medicină Orientală și Școala Profesională de Medicină Orientală, Universitatea Wonkwang, Shinyong-dong, Iksan, Jeonbuk 570-749, Republica Coreea

Hye Yoom Kim

1 Centrul de cercetare a fluidelor corporale Hanbang, Universitatea Wonkwang, Shinyong-dong, Iksan, Jeonbuk 570-749, Republica Coreea

2 Colegiul de Medicină Orientală și Școala Profesională de Medicină Orientală, Universitatea Wonkwang, Shinyong-dong, Iksan, Jeonbuk 570-749, Republica Coreea

Tu Mee Ahn

1 Centrul de cercetare a fluidelor corporale Hanbang, Universitatea Wonkwang, Shinyong-dong, Iksan, Jeonbuk 570-749, Republica Coreea

2 Colegiul de Medicină Orientală și Școala Profesională de Medicină Orientală, Universitatea Wonkwang, Shinyong-dong, Iksan, Jeonbuk 570-749, Republica Coreea

Yun Jung Lee

1 Centrul de cercetare a fluidelor corporale Hanbang, Universitatea Wonkwang, Shinyong-dong, Iksan, Jeonbuk 570-749, Republica Coreea

2 Colegiul de Medicină Orientală și Școala Profesională de Medicină Orientală, Universitatea Wonkwang, Shinyong-dong, Iksan, Jeonbuk 570-749, Republica Coreea

Dae Gill Kang

1 Centrul de cercetare a fluidelor corporale Hanbang, Universitatea Wonkwang, Shinyong-dong, Iksan, Jeonbuk 570-749, Republica Coreea

2 Colegiul de Medicină Orientală și Școala Profesională de Medicină Orientală, Universitatea Wonkwang, Shinyong-dong, Iksan, Jeonbuk 570-749, Republica Coreea

Echipa 3 Brain Korea (BK) 21 Plus, Școala Profesională de Medicină Orientală, Universitatea Wonkwang, Iksan, Jeonbuk 540-749, Republica Coreea

Ho Sub Lee

1 Centrul de cercetare a fluidelor corporale Hanbang, Universitatea Wonkwang, Shinyong-dong, Iksan, Jeonbuk 570-749, Republica Coreea

2 Colegiul de Medicină Orientală și Școala Profesională de Medicină Orientală, Universitatea Wonkwang, Shinyong-dong, Iksan, Jeonbuk 570-749, Republica Coreea

Echipa 3 Brain Korea (BK) 21 Plus, Școala Profesională de Medicină Orientală, Universitatea Wonkwang, Iksan, Jeonbuk 540-749, Republica Coreea

Abstract

1. Introducere

Sindromul metabolic este o afecțiune caracterizată prin coexistența variabilă a obezității, hiperuricemiei, hiperinsulinemiei, hipertensiunii și dislipidemiei. Patogeneza sindromului metabolic include mai multe organe din sistemul cardiorenal [1]. Pacienții cu sindrom metabolic, așa cum sunt definiți de Programul Național de Educație pentru Colesterol, Panoul de tratament pentru adulți III (NCEP-ATP III), prezintă simultan 3 sau mai multe dintre următoarele trăsături: circumferință crescută a taliei, tensiune arterială crescută, lipoproteine ​​cu densitate ridicată (HDL) nivel trigliceridic crescut și hiperglicemie [2, 3].

Fructoza, prezentă în zaharurile adăugate precum zaharoza și siropul de porumb bogat în fructoză, a fost legată epidemiologic de sindromul metabolic. Consumul crescut de fructoză, utilizat în mod obișnuit în alimentele procesate și băuturile răcoritoare, este unul dintre cei mai importanți factori care contribuie la prevalența crescândă a sindromului metabolic [4]. Descoperirile recente au arătat că fructoza alimentară accelerează tulburările metabolice și induce leziuni oxidative [5]. O dietă bogată în fructoză induce un sindrom metabolic bine caracterizat, rezultând în general hiperinsulinemie, hipertensiune, dislipidemie și un nivel scăzut de HDL [6]. Un studiu recent a sugerat că afectarea renală este asociată cu sindromul metabolic [7]. Expunerea ficatului la niveluri ridicate de fructoză duce la stimularea rapidă a lipogenezei și acumulării de trigliceride, ceea ce duce la reducerea sensibilității la insulină și la rezistența la insulină hepatică/intoleranță la glucoză [8].

Coacăzul negru (Ribes nigrum; BC) este o cultură horticolă valoroasă în Rusia, Polonia, Germania, Scandinavia, Anglia, Noua Zeelandă și în mai multe națiuni din Europa de Est. Producția anuală mondială de BC este de aproximativ 500.000 până la 600.000 de tone [9]. BC conține numeroase componente active fiziologic, inclusiv vitamine, carotenoide și flavonoide, care au efecte antiulcerice, anticonvulsive și antidiareice, precum și efecte protectoare împotriva carcinoamelor, diabetului și a bolilor regresive [10, 11].

Mai multe studii au raportat că BC produce efecte antioxidante. Antocianinele din BC abrogă stresul oxidativ prin mecanisme antioxidante mediate de Nrf2 [12]. În plus, extractul BC are proprietăți citoprotectoare și antiinflamatoare [13]. Mai mult, BC protejează împotriva pietrelor la rinichi [14]. Cu toate acestea, efectele terapeutice ale BC la subiecții cu tulburare metabolică nu au fost raportate. Astfel, acest studiu a fost conceput pentru a identifica efectul extractului de BC asupra sindromului metabolic indus de dietă bogată în fructoză la șobolani.

2. Metode și materiale

2.1. Material vegetal și prepararea extractului BC

BC a fost cumpărat de la ferma Gukmin (Jeongeup, Coreea). Un specimen de voucher (numărul HBF191) a fost depus în Herbariul Școlii Profesionale de Medicină Orientală, Universitatea Wonkwang (Coreea). BC (400 g) a fost fiert cu 3 L de apă distilată la 100 ° C timp de 2 ore. Extractul rezultat a fost filtrat prin Whatman No. 3 hârtie de filtru și centrifugată la 990 × g timp de 20 de minute la 4 ° C. Supernatantul rezultat a fost concentrat folosind un evaporator rotativ, după care extractul rezultat (63,19 g) a fost liofilizat folosind un congelator și a fost depozitat la -70 ° C până când este necesar.

2.2. Experimente și dietă pe animale

Toate procedurile experimentale au fost efectuate în conformitate cu Ghidul Institutului Național de Sănătate pentru Îngrijirea și Utilizarea Animalelor de Laborator și au fost aprobate de Comitetul Instituțional pentru Îngrijirea și Utilizarea Animalelor pentru Științe Medicale din Universitatea Wonkwang (număr de aprobare: WKU 14-50). Șobolani masculi Sprague-Dawley (SD) de șase săptămâni au fost obținuți de la Samtako (Osan, Coreea) și păstrați într-o cameră cu temperatură întreținută automat (23 ° C), umiditate (50-60%) și cicluri de lumină/întuneric (12 ore fiecare) pe parcursul experimentelor. După 1 săptămână de aclimatizare, șobolanii au fost împărțiți în mod aleatoriu în 4 grupuri (10 șobolani per grup). Grupul de control (Continuare) a fost alimentat cu o dietă regulată. Grupul cu dietă bogată în fructoză (HF) a fost hrănit cu o dietă cu fructoză de 60% (Research Diet, SUA). Grupul cu doze mici de BC a fost alimentat cu o dietă de fructoză de 60% cu 100 mg/kg/zi BC administrat pe cale orală de Sonde pentru o perioadă de 4 săptămâni. Grupul cu doze mari de BC a fost hrănit cu o dietă de fructoză de 60% cu 300 mg/kg/zi de BC administrat oral de Sonde pentru o perioadă de 4 săptămâni. Dieta obișnuită a fost compusă din 50% amidon, 21% proteine, 4% grăsimi și un amestec standard de vitamine și minerale. Dieta bogată în fructoză era compusă din 60% fructoză, 20% proteine, 10% grăsimi și un amestec standard de vitamine și minerale.

2.3. Măsurarea tensiunii arteriale

Tensiunea arterială sistolică (SBP) a fost determinată utilizând pletismografie neinvazivă a coșului și înregistrată cu un sfigmograf automat (MK2000; Muromachi Kikai, Tokyo, Japonia). SBP a fost măsurat o dată pe săptămână. Au fost făcute cel puțin 10 determinări ale SBP în timpul fiecărei sesiuni de măsurare. Valorile sunt prezentate ca medie ± SEM a 8 măsurători.

2.4. Estimarea toleranței orale la glucoză

Două teste orale de toleranță la glucoză (OGTT) au fost efectuate la 2 zile distanță după 8 săptămâni de tratament. Pe scurt, concentrațiile bazale de glucoză din sânge au fost măsurate după 10-12 ore de post peste noapte, după care glucoza (2 g/kg greutate corporală) a fost administrată imediat prin gavaj oral. Probele de sânge din vena cozii au fost colectate la 30, 60, 90 și 120 de minute după administrarea glucozei.

2.5. Prelevarea de sânge și țesuturi

La sfârșitul experimentelor, aorta și mușchiul toracic au fost separate, clătite cu soluție salină rece și congelate. Plasma a fost obținută din probe de sânge coagulate prin centrifugare la 3.000 rpm timp de 15 minute la 4 ° C și congelată la -80 ° C.

2.6. Parametrii sângelui

Nivelurile de trigliceride din plasmă au fost măsurate folosind truse comerciale (AM 157S-K, ASAN, Coreea). Nivelurile de HDL, colesterol total și lipoproteine ​​cu densitate mică (LDL) din plasmă au fost măsurate folosind kituri de testare HDL și LDL (E2HL-100, Bio Assay Systems, Germania). Nivelurile de insulină din plasmă au fost măsurate folosind truse comerciale (80-INSRT-E01, ALPCO, Marea Britanie). Nivelurile de proteină C reactivă (CRP) din plasmă au fost măsurate folosind truse comerciale (557825, BD Biosciences, America). Nivelurile de leptină din plasmă au fost măsurate folosind truse comerciale (ab100773, Abcam, Marea Britanie). Nivelurile de T-Bill și BUN în plasmă au fost măsurate folosind kituri comerciale (77184, Arkray, Japonia).

2.7. Pregătirea Aortei și măsurarea reactivității vasculare

Aorta toracică a fost colectată rapid și cu atenție de la fiecare șobolan și plasată în soluție rece Kreb (118 mM NaCI, 4,7 mM KCl, 1,1 mM MgSO4, 1,2 mM KH2PO4, 1,5 mM CaCl, 25 mM NaHCO3, 10 mM glucoză și pH 7,4) . Țesutul conjunctiv și grăsimea au fost îndepărtate din fiecare aortă toracică. Fiecare aortă toracică a fost tăiată în inele de aproximativ 3 mm lungime. S-a avut grijă să se protejeze endoteliul de daune accidentale în timpul procedurii de disecție. Inelele aortice toracice au fost suspendate într-o baie de țesut care conține soluția Kreb la 37 ° C prin intermediul a 2 fire din oțel inoxidabil în formă de L introduse în lumen și aerate cu 95% O2 și 5% CO2. Forțele izometrice ale inelelor au fost măsurate folosind un traductor de deplasare a forței Grass FT 03 conectat la un sistem de înregistrare poligraf Model 7E (Grass Technologies, Quincy, MA, SUA). O întindere pasivă de 1 g în inelele aortice toracice a fost stabilită ca fiind tensiunea optimă pentru o reacție maximă la fenilefrină (10-6 M). Preparatele au fost lăsate să se echilibreze timp de aproximativ 1 oră cu soluția Kreb înlocuită la fiecare 10 minute. Au fost studiate efectele relaxante ale acetilcolinei (ACh, 10 −9 –10 −6 M) și nitroprusidului de sodiu (SNP, 10 −10 –10 −5 M) în inelele de aortă toracică.

2.8. Analiza Western Blot în aorta și mușchiul de șobolan

2.9. Hematoxilină și eozină (H&E) și roșu uleios O colorare a aortei, a grăsimilor epididimale și a ficatului

Țesutul de aortă toracică de la 5 subiecți aleatori din fiecare grup a fost fixat în 10% (v/v) formalină în soluție salină tamponată cu fosfat 0,01 M (PBS) timp de 2 zile, soluția de formalină fiind schimbată în fiecare zi pentru a elimina urmele de sânge. Probele de țesut aortic au fost deshidratate și încorporate în parafină, secționate (6 μm) și colorate cu H & E. Au fost fixate probe de grăsime epididimală (de la 5 subiecți aleatori din fiecare grup) și țesut hepatic (de la 5 subiecți aleatori din fiecare grup) în 4% paraformaldehidă timp de 48 ore la 4 ° C și incubat cu 30% zaharoză timp de 2 zile. Fiecare probă de grăsime și ficat a fost încorporată în compusul OCT (Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance, CA, SUA), congelat în azot lichid și depozitat la -80 ° C. Secțiunile înghețate au fost tăiate cu un SME Cryotome Shandon (Thermo Electron Corporation, Pittsburg, PA, SUA) și montate pe lamele acoperite cu polilizilină. Secțiunile de grăsime epididimale au fost colorate cu H&E, în timp ce secțiunile hepatice au fost colorate cu ulei roșu O. Pentru comparații histopatologice cantitative, fiecare secțiune a fost analizată folosind software-ul Axiovision 4 Imaging/Archiving.

2.10. Imunohistochimia țesutului toracic aortic

Înainte de colorarea imunohistochimică, secțiunile de țesut din parafină au fost montate pe lamele acoperite cu polilizilină (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, SUA). Țesutul de pe fiecare lamă a fost imunotratat folosind kituri Invitrogen HISOTO-STAIN-SP cu metoda marcată cu streptavidină-biotină (LAB-SA). După recuperarea antigenului, lamelele au fost scufundate în peroxid de hidrogen 3% timp de 10 minute la temperatura camerei pentru a bloca activitatea peroxidazei endogene și au fost clătite cu PBS. Apoi, lamele au fost incubate cu 10% ser de capră neimun timp de 10 minute la temperatura camerei și incubate cu anticorpi primari împotriva ICAM-1, VCAM-1, ET-1 și eNOS (1: 200; Santa Cruz, CA, SUA) în camere umidificate peste noapte la 4 ° C. Apoi, lamele au fost incubate cu anticorpi secundari biotinilați timp de 20 min la temperatura camerei, urmată de incubare cu streptavidină conjugată cu peroxidază de hrean timp de 20 min la temperatura camerei. Activitatea peroxidazei a fost vizualizată utilizând un sistem substrat-cromogen 3,3'-diaminobenzidină (DAB; Novex, CA) cu contracolorare a hematoxilinei (Zymed, CA, SUA). Pentru analiza cantitativă, scorul mediu de 10-20 de zone selectate aleatoriu a fost calculat utilizând software-ul de analiză a imaginii NIH, ImageJ (NIH, Bethesda, MD, SUA).

2.11. Analize statistice

tabelul 1

Efectele BC asupra greutății corporale, a greutății ficatului, a greutății ficatului% din greutate corporală, a greutății epididimale a grăsimii și a greutăților epididimale în greutate% din greutate corporală.

Cont. HFBC1BC2
Greutate corporală (g)
start227,62 ± 1,96221,75 ± 2,64233,79 ± 1,99224,27 ± 2,31
Final466,15 ± 10,75455,14 ± 8,15427,14 ± 10,97 # 419,73 ± 6,6 #
Greutatea ficatului (g)10,9 ± 0,5213,2 ± 0,76 ∗ 11,18 ± 0,21 # 10,8 ± 0,23 ##
Greutate hepatică% din BW2,49 ± 0,072,8 ± 0,03 ∗ 2,52 ± 0,03 # 2,54 ± 0,04 #
Plăcuțele de grăsime epididimale cântăresc (g)6,64 ± 0,47,47 ± 0,46 ∗ 6,42 ± 0,55 # 5,15 ± 0,42 #
Tampoane de grăsime epididimale% în greutate din BW1,45 ± 0,051,74 ± 0,06 ∗ 1,38 ± 0,14 # 1,19 ± 0,08 #

masa 2

Efectele BC asupra CRP, T-Bil, leptină și insulină.