Școala de afiliere a științelor sănătății umane, Universitatea din Kyoto Școala de Medicină, Kyoto, Japonia

necesară

Departamentul de Neurologie, Facultatea de Medicină a Universității din Kyoto, Kyoto, Japonia, Spitalul Ishiki, Kagoshima, Japonia

Școala de afiliere a științelor sănătății umane, Universitatea din Kyoto Școala de Medicină, Kyoto, Japonia

Școala de afiliere a științelor sănătății umane, Universitatea din Kyoto Școala de Medicină, Kyoto, Japonia

Departamentul de Neurologie pentru Afiliere, Școala de Medicină a Universității din Kyoto, Kyoto, Japonia

Departamentul de Neurologie pentru Afiliere, Școala de Medicină a Universității din Kyoto, Kyoto, Japonia

Școala de afiliere a științelor sănătății umane, Universitatea din Kyoto Școala de Medicină, Kyoto, Japonia

Școala de afiliere a științelor sănătății umane, Universitatea din Kyoto Școala de Medicină, Kyoto, Japonia

Școala de afiliere a științelor sănătății umane, Universitatea din Kyoto Școala de Medicină, Kyoto, Japonia

Departamentul de Neurologie pentru Afiliere, Școala de Medicină a Universității din Kyoto, Kyoto, Japonia

Departamentul de afiliere pentru neurologie, Universitatea de Medicină Sapporo, Sapporo, Japonia

Școala de afiliere a științelor sănătății umane, Universitatea din Kyoto Școala de Medicină, Kyoto, Japonia

  • Masato Maesako,
  • Kengo Uemura,
  • Ayana Iwata,
  • Masakazu Kubota,
  • Kiwamu Watanabe,
  • Maiko Uemura,
  • Yasuha Noda,
  • Megumi Asada-Utsugi,
  • Takeshi Kihara,
  • Ryosuke Takahashi

Cifre

Abstract

Citare: Maesako M, Uemura K, Iwata A, Kubota M, Watanabe K, Uemura M, și colab. (2013) Continuarea exercițiului este necesară pentru a inhiba depunerea β-amiloidă indusă de dietă bogată în grăsimi și deficitul de memorie la șoarecii transgenici ai proteinei precursoare amiloide. PLoS ONE 8 (9): e72796. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0072796

Editor: Mark P. Mattson, Institutul Național pentru îmbătrânirea programului de cercetare intramurală, Statele Unite ale Americii

Primit: 29 mai 2013; Admis: 12 iulie 2013; Publicat: 4 septembrie 2013

Finanțarea: Lucrarea a fost susținută financiar de Grant-in-Aid de la Ministerul Educației, Culturii, Sportului, Științei și Tehnologiei (24111524 (AK), 23591243 (KU)) și Grantul de cercetare de la Takeda Science Foundation (KU). Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Boala Alzheimer (AD), a cărei apariție este în mare parte sporadică, se caracterizează prin deficite de memorie și alte funcții cognitive. Placa amiloidă este una dintre caracteristicile patologice ale AD și este compusă din β-amiloid (Aβ). Aβ este derivat din proteina precursor amiloid (APP) prin clivaje proteolitice de β- și γ-secretaze. La rândul său, Aβ este degradat de mai multe enzime care degradează Aβ, inclusiv neprilysin sau enzime care degradează insulina. O ipoteză larg acceptată despre patogeneza AD este ipoteza cascadei amiloide, în care Aβ joacă un rol crucial ca moleculă din amonte în neurodegenerare [1]. Având în vedere că acumularea de Aβ este observată în mod clar cu aproape un deceniu înainte ca afectarea cognitivă să fie observată la pacienții cu AD [2], [3], există un consens din ce în ce mai mare că prevenirea AD în stadiul incipient este de dorit.

Având în vedere că starea metabolică este o problemă în creștere la nivel mondial, ne-am întrebat dacă continuarea tratamentului cu HFD după exercițiu ar elimina efectul benefic al exercițiului asupra funcției de memorie. În studiul de față, am demonstrat că efectul exercițiului asupra funcției de memorie nu a fost abolit la șoarecii WT, chiar dacă au continuat să aibă HFD după terminarea exercițiului. Cu toate acestea, îmbunătățirea memoriei indusă de efort a fost întreruptă în mod clar la șoarecii transgenici APP. Am arătat că consumul de HFD după exerciții a crescut nivelul oligomerului Aβ la șoarecii transgenici APP. În plus, am speculat că dezvoltarea apatologiei ar putea fi cauzată de o creștere a producției de ap datorată HFD. Rezultatele au indicat faptul că HFD după terminarea exercițiului ar putea agrava imediat patologia AD și, mai târziu, poate perturba efectul exercițiului asupra funcției de memorie. Prin urmare, continuarea exercițiului este necesară pentru a inhiba afectarea cognitivă indusă de HFD în cadrul patologic al AD.

Metode

Declarație de etică

Toate experimentele pe animale din acest studiu au fost efectuate cu aprobarea Comitetelor de experimentare a animalelor de la Universitatea Kyoto, Școala de Medicină Absolventă (Număr permis: 09597). Toate experimentele au fost realizate cu respectarea strictă a orientărilor internaționale relevante. S-au făcut toate eforturile pentru a reduce la minimum suferința animalelor.

Animale, condiții alimentare și de exerciții fizice

n (numărul de rotații ale roții de rulare) × 12 (cm/diametru) × 3,14.

După manipulări dietetice și mobile, au fost analizate modificările metabolice la acești șoareci, care a fost urmată de evaluarea funcției memoriei prin testul labirintului de apă Morris, așa cum este descris mai jos. După analiza funcției de memorie, creierele au fost extrase și tăiate sagital în emisfere stânga și dreaptă. Tribromoetanolul a fost utilizat pentru anestezie în procedurile chirurgicale. Emisfera stângă a fost fixată în paraformaldehidă 4% pentru analiză histologică. După îndepărtarea lobului olfactiv și a cerebelului, emisfera dreaptă a fost rapid înghețată în azot lichid pentru analiză biochimică.

Evaluarea modificărilor metabolice

Sângele a fost colectat din vena cozii. Pentru a evalua intoleranța la glucoză la acești șoareci, am efectuat un test de toleranță intra-peritoneală la glucoză (IGTT). Șoarecilor li s-a administrat o singură injecție intra-peritoneală de glucoză (2 g/kg greutate corporală) după 14 ore de post, iar sângele a fost colectat periodic timp de 2 ore (post, 30 min, 60 min și 120 min). Conținutul de glucoză plasmatică a fost măsurat utilizând Glucoza LabAssay (Wako, Japonia). Concentrația de insulină plasmatică a fost măsurată prin setul de test imunosorbent legat de enzime (ELISA) specific insulinei (Morinaga Seikagaku, Japonia).

Testul labirintului de apă Morris

Pentru a evalua învățarea navigației spațiale și păstrarea memoriei, testul labirintului de apă Morris a fost efectuat folosind un bazin de apă (diametru 120 cm, înălțime 25 cm, temperatură 21 ± 1 ° C).

Faza vizuală.

Instruirea vizibilă a platformei a fost efectuată pentru a măsura motivația și viteza de înot a șoarecilor pentru a găsi o platformă. Indicii distali au fost îndepărtați din jurul piscinei, iar platforma a fost etichetată cu un steag și plasată la 1 cm deasupra suprafeței apei în centrul unui cadran. Șoarecii au fost plasați în labirint și li s-a permis să exploreze labirintul timp de 60 sec; dacă au ajuns la platforma vizibilă, li s-a permis să rămână acolo timp de 20 de secunde înainte de a fi readuși în cuști. Dacă nu au găsit platforma în 60 de secunde, experimentatorul i-a condus la platformă și i-a lăsat să rămână acolo timp de 20 de secunde. Antrenamentul a fost finalizat odată ce fiecare animal a primit șase studii. Acest antrenament a fost efectuat timp de 1 zi.

Faza de achiziție.

Am măsurat capacitatea șoarecilor de a înțelege relația spațială dintre o platformă sigură, dar invizibilă, cu un diametru de 10 cm (scufundat la 1 cm sub nivelul apei) și indicii vizuale care înconjoară labirintul. Platforma era situată în centrul unuia dintre cele patru cadrane și mai multe repere extramaze au fost distribuite pe pereții din jurul piscinei. În timpul fazei de achiziție a antrenamentului, fiecare mouse a primit zilnic patru teste ascunse de antrenament pe platformă ascunsă, cu intervale de 12 minute timp de 5 zile consecutive. Animalelor li s-a permis 60 de secunde să localizeze platforma și 20 de secunde să se odihnească pe ea. Șoarecii care nu au reușit să găsească platforma au fost conduși acolo de experimentator și au permis să se odihnească acolo timp de 20 de secunde.

Faza de încercare a sondei.

La o zi după ultimul proces de achiziție, a fost administrat un singur studiu sondă de 60 secunde pentru a evalua reținerea memoriei spațiale. Pentru testul sondei, animalele au fost returnate la piscină fără platforma prezentă, iar parametrii au fost înregistrați pentru a evalua capacitatea mouse-ului de a-și aminti locația anterioară a platformei.

Performanța a fost înregistrată cu un sistem automat de urmărire (ORY-labirint, Brain Science. Idea. Co., Ltd., Japonia) pe parcursul tuturor fazelor de instruire. În timpul fazei vizuale a antrenamentului, viteza la care șoarecii au ajuns pe platformă au fost folosite pentru a compara activitatea de performanță între fiecare grup. În timpul fazei de achiziție, timpul până la atingere (latența pentru a ajunge la platformă) a fost ulterior folosit pentru a analiza și compara performanța între diferitele grupuri de tratament. Timpul necesar pentru a ajunge la poziția în care platforma a fost prezentată și timpul petrecut în cadranul obiectivului au fost analizate în timpul probelor de sondare.

Măsurarea Aβ de către ELISA

Pentru a prepara probele pentru detectarea Aβ, șoarecii cerebrali au fost omogenizați cu soluție salină tampon Tris (TBS) cu cocktail inhibitor de protează (Roche, Germania). Omogenatul a fost centrifugat la 100.000 g timp de 1 oră și supernatantul a fost colectat ca fracție extrasă de TBS. Peleta a fost spălată în TBS și centrifugată la 100.000 g timp de 1 oră. La peletă s-a adăugat șaptezeci la sută acid formic (FA), care a fost omogenizat din nou. Omogenatul a fost incubat timp de 1 oră la 4 ° C și apoi centrifugat la 100.000 g timp de 1 oră la 4 ° C. Supernatantul rezultat a fost colectat ca fracție extrasă cu FA, care a fost neutralizată cu un volum de 20 de ori de tampon Tris 1 M (pH 11,0).

Nivelurile de Aβ 40 și Aβ 42 în fracțiunea FA sau oligomerul Aβ în fracțiunea TBS au fost măsurate folosind kituri ELISA specifice oligomerului Aβ 40, Aβ 42 sau Aβ (specific 82E1) (Immuno-Biological Laboratories Co., Ltd., Japonia) și în conformitate cu instrucțiunile producătorului. Am folosit un format standard pentru măsurarea speciilor monomerice Aβ cu utilizarea anticorpilor de captare C-terminali și a anticorpilor de detectare N-terminali sau de regiune mijlocie. Pentru a detecta speciile de oligomeri Aβ, același anticorp N-terminal, 82E1 (la resturile Aβ 1-16, Immuno-Biological Laboratories, Inc, SUA), a fost utilizat atât pentru captare, cât și pentru detectare.

Imunoblotarea și testul capcanei de filtrare

Pentru analiza imunoblotării, șoarecii cerebrali au fost extrasați în tampon de testare radio-imunoprecipitare (RIPA) (50 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, 1% Triton X100, 1% NP-40, 0,5% Deoxicolat, 0,1% SDS, pH 8,0) cu cocktail inhibitor de protează și suficient omogenizat pe gheață. Probele au fost incubate o noapte la 4 ° C și centrifugate la 14.000 g timp de 20 de minute. Supernatantele au fost utilizate direct pentru analiza Western blot. Protocolul detaliat a fost descris anterior [10], [11]. În experimentele anterioare, am folosit două tipuri de geluri (5-20% geluri cu gradient de poliacrilamidă (Atto, Japonia) și 4-12% NuPAGE Gel Bis-Tris (Invitrogen, SUA)) și două tipuri de anticorpi (iepure policlonal anti ) -APP anticorp C-terminal și anticorp monoclonal 6E10 de șoarece). Deoarece experimentul utilizând gel NuPAGE Bis-Tris de 4-12% și anticorp C-terminal policlonal anti-APP policlonal de iepure a fost cel mai cantitativ, la fel ca cel utilizat în prezentul studiu. Anticorp policlonal anti-APP C-terminal de iepure a fost obținut de la SIGMA.

Testul filtrului de capcană a fost efectuat așa cum sa descris anterior [11]. Pe scurt, a fost măsurată concentrația de proteine ​​a probelor de cerebr în fracția extrasă de TBS și o cantitate egală de proteină a fost supusă filtrării sub vid printr-un aparat de blotare cu 96 de godeuri (Bio-Rad Laboratories, SUA) conținând nitroceluloză de 200 nm membrană. Membrana a fost apoi incubată cu anticorpul primar la 4 ° C peste noapte. Apoi a fost blocat de TBS conținând 4% lapte degresat și incubat cu anticorp secundar legat de HRP (GE Healthcare, Marea Britanie; diluat 1-2000) timp de 1 oră. Apoi, a fost dezvoltat utilizând sistemul de analiză ECL Western Blotting (GE Healthcare). Anticorpul anti-oligomer (A11, Invitrogen) a fost utilizat pentru detectarea oligomerului Aβ în fracția solubilă TBS.

Imunohistochimie

Secțiunile țesuturilor fixate în paraformaldehidă și încorporate în parafină ale șoarecilor au fost deparafinate și rehidratate. Antigenele secțiunilor de țesut au fost activate prin autoclavă timp de 10 minute în tampon citrat 10 mM (pH 6,0). Activitatea peroxidazei endogene a fost suprimată cu 0,6% peroxid de hidrogen. Ulterior, secțiunile de țesut au fost blocate de ser de cal și incubate cu anticorpi primari timp de 1 oră. Secțiunile au fost apoi incubate cu Histofine Simple Stain MAX PO (Nichirei Corporation, Japonia) timp de 1 oră. Ulterior, marcarea a fost vizualizată prin incubare cu o soluție de 3,3-diaminobenzidină (Merck & Co., Inc, SUA) cu peroxid de hidrogen. Toate imaginile au fost analizate vizual cu ajutorul unui microscop, ECLIPSE 80i (Nikon Corporation). Anticorpul anti-Aβ (6E10) (1∶200; SIGMA) a fost utilizat pentru detectarea plăcii Aβ.

Testul activității neprilizinei

Activitatea proteolitică a neprilizinei a fost măsurată așa cum s-a descris anterior, dar cu modificări minore [17]. Pe scurt, șoarecii cerebrali au fost extrasați în tampon RIPA și concentrațiile de proteine ​​au fost analizate. 25 μg de probe extrase au fost incubate cu 50 μM substrat 3-dansil-D-Ala-Gly-p- (nitro) -Phe-Gly (DAGNPG) (SIGMA) și 1 μM inhibitor al enzimei de conversie a captopril-angiotensinei (ACE )- în 200 μl de tampon Tris-HCI 50 mM (pH 7,6) timp de 1 oră la 37 ° C. Reacțiile au fost oprite prin încălzirea probelor la 100 ° C timp de 5 min, urmate de 5.000 g × 5 min de centrifugare. 180 µl de supernatant au fost diluați în 400 µl de tampon Tris-HCI 50 mM (pH 7,6) și fluorescența a fost determinată folosind Infinite 200 PRO (Tecan Japan Co., Ltd., Japonia) (excitație 342 nm, emisie 562 nm).

analize statistice

Toate valorile sunt date în medii ± SE. Comparațiile au fost efectuate folosind un test t Student nepereche. Pentru compararea analizei multiparametrice, am folosit ANOVA factorială unidirecțională, urmată de o analiză post-hoc folosind testul post-hoc Bonferroni. Semnificația statistică a diferențelor dintre scorurile medii în timpul IGTT și faza de achiziție a testului Morris au fost evaluate cu măsuri repetate bidirecționale ANOVA (model liniar general/RM-ANOVA) și Bonferroni analiza post-hoc pentru comparații multiple. Valoarea p Figura 1. Tratament de exercițiu administrat șoarecilor APP-HFD la diferite perioade de timp.

(A) Greutatea corporală relativă se modifică în decurs de 20 de săptămâni la șoarecii de control APP, APP-HFD, APP-HFD + Ex 0-10, APP-HFD + Ex 5-15 și APP-HFD + Ex 10-20. Greutatea corporală cu 2 săptămâni înainte de fiecare dietă a fost considerată drept valoarea inițială (0 g). (B) Nivelurile de glucoză din sânge în timpul testului de toleranță la glucoză după o injecție intra-peritoneală de glucoză (2 g/kg greutate corporală). Nivelurile de glucoză la jeun la APP-HFD + Ex 0-10 șoareci (F (4, 20) = 9.03, p Figura 3. Efectul exercițiului asupra funcției de memorie a fost abolit de HFD la șoarecii transgenici APP.

(A) Timpul pentru a ajunge la platforma țintă a șoarecilor WT-HFD tratați cu efort (superior) și șoarecilor APP-HFD (inferiori) în faza de achiziție a testului de labirint de apă Morris, la 20 de săptămâni după ce au avut HFD. Șoarecii WT-HFD + Ex 0-10 și șoarecii WT-HFD + Ex 5-15 au avut același timp pentru a ajunge la platformă ca șoarecii WT-HFD + Ex 10-20. De asemenea, șoarecii APP-HFD + Ex 0-10 și șoarecii APP-HFD + Ex 5-15 au avut tendința de a dura mai mult decât șoarecii APP-HFD + Ex 10-20 pentru a ajunge la platformă; cu toate acestea, acest lucru a fost statistic nesemnificativ. (B) Timpul necesar pentru a ajunge la poziția obiectivului șoarecilor WT-HFD tratați cu efort (stânga) și șoarecilor APP-HFD (dreapta) în faza de probă de probă a testului de labirint de apă Morris, la 20 de săptămâni după ce a avut HFD. Șoareci WT-HFD + Ex 0-10 (F (4, 10) = 18,63, p Figura 4. HFD după exercitarea oligomerului Aβ crescut, precum și nivelurile de Aβ depuse la șoarecii APP-HFD.

(A) Analiza imunohistochimică utilizând anticorp anti-Aβ (6E10). Imagini reprezentative ale secțiunilor de hipocampus imunocolorat cu Aβ de la șoareci de control APP, APP-HFD, APP-HFD + Ex 0-10, APP-HFD + Ex 5-15 și respectiv APP-HFD + Ex 10-20 șoareci. Bara de scală, 0,5 mm. Creșterea depunerii Aβ a fost observată la șoareci APP-HFD + Ex 0-10 și APP-HFD + Ex 5-15, comparativ cu cea de la șoareci APP-HFD + Ex 10-20. Cu toate acestea, cantitatea de depunere Aβ la șoareci APP-HFD + Ex 0-10 și șoareci APP-HFD + Ex 5-15 a fost mai mică decât cea la șoareci APP-HFD. (B) Cantitatea de Aβ 40 în fracțiunea FA a șoarecilor de control APP, APP-HFD, APP-HFD + Ex 0-10, APP-HFD + Ex 5-15 și APP-HFD + Ex 10-20 șoareci a fost analizată de ELISA . Nivelul Aβ 40 în fracțiunea FA a șoarecilor APP-HFD + Ex 0-10 a fost mai mare decât cel al șoarecilor APP-HFD + Ex 10-20 (F (4, 15) = 10,40, p = 0,009). Cu toate acestea, cantitatea de Aβ 40 la șoareci APP-HFD + Ex 0-10 (p = 0,028) și șoareci APP-HFD + Ex 5-15 (p = 0,004) a fost mai mică decât la șoarecii APP-HFD. * indicat p Figura 5. HFD după terminarea exercițiului a promovat acumularea APP CTFβ la șoarecii APP-HFD.