Abstract

Pentru a testa posibilele efecte proinflamatorii acute ale acizilor grași, am indus o creștere a concentrațiilor de acid gras gras fără plasmă (FFA) după o perfuzie de lipide și heparină timp de 4 ore la 10 subiecți sănătoși. Am determinat activitatea de legare a factorului nuclear-κB (NF-κB) în celulele mononucleare (MNC), subunitatea p65 a NF-κB, generarea speciilor reactive de oxigen (ROS) prin MNC și leucocitele polimorfonucleare (PMN). De asemenea, a fost măsurată reactivitatea arterei brahiale, utilizând dilatarea mediată de flux postischemică. Activitatea de legare a NF-κB în extractele nucleare MNC a crescut la 163 ± 17% și 144 ± 14% comparativ cu nivelurile bazale la 2 și 4 h (P 2) au participat la studiu (Tabelul 1). Toți participanții au avut o toleranță normală la glucoză, nu au luat niciun medicament, au avut tensiune arterială normală și au avut profiluri lipidice normale de post. Toți voluntarii și-au dat consimțământul scris și informat, iar protocolul de studiu a fost aprobat de Comitetul de cercetare umană al Universității de Stat din New York la Buffalo.

acizilor

Protocol.

Participanții au venit la centrul de cercetare clinică la 8.00 a.m., după un post peste noapte de 12 ore. Un cateter a fost introdus în vena antecubitală. A fost obținută o probă de sânge inițială și o emulsie de trigliceride (Liposyn, 10%; Abbott Laboratories, North Chicago, IL) și heparină (0,2 unități · kg -1 -1 min -1) au fost perfuzate la o rată de 50 ml/h pentru 4 ore. Am folosit o concentrație mai scăzută de Liposyn în comparație cu majoritatea studiilor anterioare, deoarece perfuzia cu 20% Liposyn a dus la ser lipemic în care separarea MNC și PMN nu a fost posibilă. Infuzia de trigliceride a fost oprită după 4 ore, iar probele de sânge au fost colectate la 0, 2, 4 și 6 ore. Reactivitatea vasculară a fost, de asemenea, măsurată la 0, 2, 4 și 6 ore. În două ocazii diferite, șapte subiecți au participat la alte două studii în care 0,9% soluție salină fiziologică normală sau 5% dextroză au fost perfuzate timp de 4 ore și probele au fost colectate la 0, 2, 4 și 6 ore.

Izolarea MNC și PMN.

Probele de sânge au fost colectate în Na-EDTA ca anticoagulant. Un total de 3,5 ml din proba de sânge anticoagulată a fost stratificat cu atenție peste 3,5 ml de mediu de izolare PMN (Robbins Scientific, Sunnyvale, CA). Probele au fost centrifugate la 450g într-un rotor rotativ timp de 30 de minute la 22 ° C. La sfârșitul centrifugării, două benzi separate în partea de sus a peletei de celule roșii din sânge. Banda superioară este formată din MNC, iar partea inferioară este formată din PMN. Banda MNC a fost recoltată cu o pipetă Pasteur, spălată în mod repetat cu soluția de sare echilibrată Hanks și reconstituită la o concentrație de 4 × 105 celule/ml în soluția de sare echilibrată Hanks. Această metodă oferă randamente> 95% suspensie MNC pură.

Măsurarea generației ROS.

Testul de deplasare a mobilității electroforetice NF-κB.

Testul de întârziere a gelului NF-kB a fost efectuat așa cum s-a descris anterior. Extractele de proteine ​​care se leagă de ADN au fost preparate din MNC-uri prin metoda descrisă de Andrews și colab. (15). Concentrațiile totale de proteine ​​au fost determinate utilizând testul proteinei BCA (Pierce, Rockland, IL). Testul de întârziere a gelului NF-κB a fost efectuat utilizând un kit de detectare a proteinelor de legare NF-κB (Life Technologies, Long Island, NY). Pe scurt, oligonucleotida cu catenă dublă care conține o repetare în tandem a secvenței consens pentru situsul de legare NF-κB a fost radiomarcată cu y-P 32 de kinază T4. Apoi, 5 μg din extractul nuclear s-au amestecat cu tamponul de incubare și amestecul a fost preincubat la 4 ° C timp de 15 min. S-a adăugat oligonucleotidă marcată (60.000 cpm) și amestecul a fost incubat la temperatura camerei timp de 20 min. Probele au fost apoi aplicate pe godeuri de 6% gel de poliacrilamidă fără denaturare. Gelul a fost uscat sub vid și expus la film cu raze X. Densitometria a fost efectuată utilizând software-ul analistului molecular Bio-Rad (Hercules, CA).

p47 subunitate phox, p65 (Rel A) și IκB, și IKK-α și IKK-β Western blot.

Western blot a fost efectuat așa cum s-a descris anterior. Pe scurt, concentrațiile totale de proteine ​​au fost determinate utilizând testul proteinei BCA (Pierce). Douăzeci de micrograme de omogenate totale au fost utilizate pentru SDS-PAGE. Western blot a fost efectuată folosind un anticorp împotriva subunității p47 phox achiziționate de la Transduction Labs (San Diego, CA) și anticorpi policlonali împotriva NF-κB p65 (Rel A) sau IκB (Rockland, Gilbertsville, PA) sau IKK-α și IKK- β (Biotehnologie, Santa Cruz, CA). Analiza densitometrică a Western blots a fost efectuată utilizând software-ul analist molecular Bio-Rad.

Imunoprecipitarea IKK și testul kinazei in vitro.

Proteină C reactivă plasmatică, MIF, TNF-α, moleculă de aderență intracelulară solubilă-1, substanțe reactive ale acidului tiobarbituric și măsurători ale proteinelor chimiotratante monocite.

MIF cu plasmă, proteina chimiotratantă monocitară-1 (MCP-1), molecula de adeziune intracelulară solubilă (sICAM-1) și TNF-α au fost testate cu kituri de testare imunosorbentă enzimatică (ELISA) din sisteme de cercetare și dezvoltare (Minneapolis, MN). Trusa ELISA de proteină C reactivă (CRP) a fost achiziționată de la Laboratoarele de sisteme de diagnosticare (Webster, TX). Substanțele reactive ale acidului tiobarbituric (TBARS) au fost măsurate folosind metoda descrisă de Yagi și colab. (16).

Măsurători ale FFA plasmatice, insulinei și glucozei.

Nivelurile FFA au fost măsurate în plasmă care conțin EDTA și inhibitor de lipoproteină lipază Paraoxon (dietil-p-nitrofenil-fosfat, 0,275 mg/ml sânge; Sigma, St. Louis, MO) printr-un test colorimetric (Wako, Richmond, VA). Nivelurile de insulină au fost determinate folosind un kit ELISA de la Laboratoarele de sisteme de diagnosticare. Nivelurile de glucoză au fost măsurate în plasmă prin analizorul de glucoză YSI 2300 STAT Plus (Yellow Springs, OH).

Evaluarea reactivității arteriale brahiale.

Diametrul arterei brahiale a fost măsurat printr-un ultrasonograf de înaltă rezoluție Acuson 128XP/10 cu un traductor cu matrice liniară de 7,5 MHz așa cum s-a descris anterior (17). Brațul a fost comprimat cu 40 mm deasupra tensiunii arteriale sistolice timp de 5 minute, iar diametrul arterei brahiale a fost înregistrat la 15 s și din nou la 45 până la 60 s după ischemie. Reactivitatea vasculară a fost evaluată la 0, 2, 4 și 6 ore.

analize statistice.

Analiza statistică a fost efectuată utilizând software-ul SigmaStat (Jandel Scientific, San Rafael, CA). Toate datele sunt exprimate ca medie ± SD. Analiza a fost efectuată cu Kruskal-Wallis ANOVA pe rânduri. Metoda Dunnett a fost utilizată pentru toate procedurile de comparație multiple. Datele pentru generarea ROS de către MNC, PMN și MIF au fost transformate logaritmic. Testul de rang semnat Wilcoxon a fost utilizat pentru a compara vasodilatația dependentă de endoteliu.

REZULTATE

FFA plasmatic, trigliceride și concentrații de insulină.

Concentrația plasmatică de FFA a crescut de la 352 ± 62 μmol/l la 621 ± 59 μmol/l la 2 h, 732 ± 75 μmol/l la 4 h (subunitatea P phox a NADPH oxidazei în omogenatele MNC, totuși, nu s-a modificat în timpul perfuziei (datele nu sunt afișate).

Concentrațiile TBARS în plasmă și raportul TBARS/trigliceride.

Generarea ROS de către PMN înainte și după perfuzia lipidică la 2, 4 și 6 ore. Rețineți că generația ROS a crescut semnificativ la 2 și 4 ore.