Abstract

Introducere

Procesul și metodele de crioconservare permit supraviețuirea pe termen lung a organismelor la temperaturi de azot lichid (LN) (- 196 ° C). În depozitarea LN, unul dintre avantaje este amânarea pe termen lung a costurilor de regenerare. Deși nici o probă biologică nu este nemuritoare, exemplarele din depozitarea LN vor avea o durată de viață nedeterminată (Li și Pritchard 2009). Crioconservarea este singura ex situ metoda de conservare pentru conservarea pe termen lung a speciilor care nu pot fi depozitate în băncile de semințe, de ex. culturi clonale sau specii cu număr redus sau semințe recalcitrante. Mai mult, necesitând doar un spațiu minim și eforturi de întreținere, crioconservarea sa dovedit a fi un instrument foarte important pentru depozitarea pe termen lung a materialului genetic plantelor (Engelmann 2004; Matsumoto 2017).

Cele mai frecvent utilizate tehnici de crioconservare sunt vitrificarea, deshidratarea prin încapsulare, răcirea cu rată controlată și conservarea inactivă a mugurilor (Benson 2008; Benelli și colab. 2013; Jenderek și Reed 2017). Vitrificarea este un proces fizic în care soluția se solidifică într-o sticlă metastabilă la temperaturi foarte scăzute și evită cristalizarea (Sakai și colab. 2008). Multe protocoale de vitrificare a plantelor utilizează două tehnici principale: adăugarea de aditivi crioprotectori la concentrații foarte mari și îndepărtarea apei prin desicarea prin evaporare și deshidratarea osmotică. Un crioprotector acționează ca o substanță antigel și trebuie să fie netoxic pentru celulă la concentrația necesară pentru a fi eficientă (Benson 2008).

Rubus humulifolius plante din populația Jyväskylä au fost menținute in vitro în Grădina Botanică a Universității din Oulu din 2006 (20 de plantule prezentând toate una R. humulifolius clonă). Mai recent, R. humulifolius a fost inclusă ca specie țintă în proiectul UE Life + Ex Situ Conservation of Finnish Native Plant Species (ESCAPE) (LIFE + 2011 BIO/FI/917 ESCAPE; https://luomus.fi/en/exsitu-conservation-finnish -specii -plante-native). În timpul acestui proiect, am dezvoltat protocolul de crioconservare pentru R. humulifolius pentru a permite o conservare pe termen lung a germoplasmei populațiilor separate ale speciei.

Materiale și metode

Material vegetal

Culturi in vitro de micropropagate R. humulifolius C. A. Plantele Mey întreținute la Laboratorul de Biotehnologie al Grădinilor Botanice de la Universitatea din Oulu au fost utilizate ca material explicativ pentru prezentul studiu. Materialul vegetal a fost primit inițial de la Institutul de Resurse Naturale, Finlanda, unde a fost dezvoltat protocolul de micropropagare pentru a restabili speciile care reprezintă cel mai vestic habitat al R. humulifolius (Kypärämäki, Jyväskylä, Finlanda ETRS-TM35FIN: N 6901644, E 432210).

Cultivarea in vitro

Cultivarea/menținerea in vitro a R. humulifolius plantele au fost efectuate pe mediu ½ MS (Murashige și Skoog 1962) cu 0,1 mg/l BAP, 0,05 mg/l NAA, 100 mg/l mioinozitol, 30 g/l zaharoză și 7,6 g/l agar la 22 ° C sub 16/8 fotoperioadă. Iluminarea a fost asigurată de tuburi fluorescente (Osram L 30 W/830) cu o intensitate de 107-128 µmol/m 2/s. Plantele au fost transferate în mediu proaspăt la un interval de 3 luni.

Protocol de crioconservare

Pentru crioconservare a R. humulifolius, a fost utilizată o metodă de vitrificare prin picurare. În prezentul studiu, crioconservarea s-a făcut ca în protocolul de vitrificare prin încapsulare dezvoltat inițial pentru zmeură (Rubus idaeus) dar fără etapa de încapsulare (Wang și colab. 2005). Am studiat efectul unui pretratament de 10 zile cu sau fără acid abscisic (0, 2 sau 4 mg/l ABA) efectuat pe muguri de 1 lună disecați din lăstari multipli de plante in vitro. Pentru control, protocolul de crioconservare (vezi mai jos) a fost aplicat imediat după disecție (Tratamentul 1 din Tabelul 2). De asemenea, am studiat efectul intervalului de propagare asupra succesului crioconservării R. humulifolius. Mugurii au fost colectați de la plante donatoare de 1, 2 sau 4 luni (din ultima subcultură), denumiți ulterior ca vârstă in vitro. Toate experimentele/tratamentele au inclus muguri de control necrioconservați (tratați ca aceia crioconservați, dar fără înghețare în LN) și toate etapele de lucru din timpul procedurii de crioconservare au fost făcute aseptic. Mugurii din fiecare tratament au avut trei replici (trei plăci Petri/tratament) și experimentul a fost făcut o dată.

Pentru crioconservare, mugurii (dimensiunea de 2-4 mm) fie cu sau fără pretratare au fost mai întâi preculturați pe mediu ½ MS cu 0,1 mg/l BAP, 0,05 mg/l NAA, 100 mg/l mio-inozitol inclusiv 0,25, 0,5 și 0,75 M zaharoză pentru o zi pe concentrație (Fig. 1a). După aceea, mugurii au fost transferați în soluția de încărcare (0,75 M zaharoză, 2 M glicerol, ½ MS) timp de 90 de minute. După aceea, mugurii au fost vitrifiați în soluția 2 de vitrificare a plantelor (PVS2: 30% glicerol, 15% etilen glicol, 15% DMSO, 0,4 M zaharoză în ½ MS) timp de 3 ore. Incubațiile în soluție de încărcare și PVS2 au fost efectuate prin plasarea mugurilor pe plăci mici Petri umezite cu câte 2 ml din fiecare soluție la un moment dat. Etapele de precultură, încărcare și vitrificare au fost efectuate la temperatura camerei (RT). După crioprotecție în PVS2, bucățile de folie de aluminiu (0,5 × 1,5 cm) au fost preparate cu picături de 2-3 μl de PVS2 (Fig. 1b) și mugurii au fost transferați în picături (5 pe folie) și crioconservate prin transferarea rapidă a foliilor criotuburi umplute cu azot lichid (LN) timp de cel puțin 1 oră.

conservarea

A. Rubus humulifolius muguri după tratamentul cu zaharoză. b. Benzi de folie cu picături PVS2. c. Mugur regenerant la 2 săptămâni după crioconservare. d. Material crioconservat la 2 luni după crioconservare. e. Material crioconservat la 2 săptămâni după transfer în condiții ex vitro. f. Crioconservat iernat R. humulifolius plante

Recuperare după crioconservare

Primul pas în recuperarea crioconservării R. humulifolius mugurii dezghețau criotuburile la 40 ° C baie de apă timp de 3 minute. După aceea, criotuburile au fost deschise și foliile cu muguri transferate la 30 ml soluție de descărcare (zaharoză 1 M în ½ MS) la temperatura camerei. După aceea, excesul de umiditate a fost îndepărtat prin transfer pe hârtie de filtru și mugurii au fost cultivați pe mediu ½ MS cu 0,1 mg/l BAP, 0,05 mg/l NAA, 100 mg/l mioinozitol și 30 g/l zaharoză în Petri plăci timp de 4 zile în întuneric înainte de transferul la lumină în camera de cultură. Supraviețuirea (S) și regenerarea (R) mugurilor au fost estimate la mai multe puncte de timp (între 1 și 5 săptămâni) sub stereomicroscop. Mugurii clasificați ca supraviețuitori (S) au inclus ambii muguri regeneranți (R) adică muguri care formează lăstari noi (Fig. 1c) și muguri care erau în viață, dar nu se regenerau.

Transferul materialului crioconservat în condiții ex vitro

Aproximativ 4 săptămâni după decongelare mugurii crioconservați au început să producă lăstari care au fost transferați în borcane mai mari de cultură tisulară conținând mediu ½ MS cu 0,1 mg/l BAP, 0,05 mg/l NAA și 100 mg/l mioinozitol (Fig. 1d) . După câteva luni, lăstarii au început să producă rădăcini fie cu sau fără 0,1 mg/l acid indol-3-butiric (IBA). În total, 19 lăstari înrădăcinați au fost transferați, de la condiții in vitro la condiții in vivo (Fig. 1e). În primele săptămâni in vivo, s-a menținut o atmosferă cu umiditate ridicată. Plantele au fost lăsate să ierneze într-o seră neîncălzită (temperatura menținută peste 0 ° C la Grădinile Botanice ale Universității din Oulu).

analize statistice

Un test Chi de independență a fost efectuat atât pentru rezultatele de supraviețuire, cât și pentru cele de regenerare pentru mugurii crioconservați și de control. Dacă p valoarea a fost

Rezultate

Materialul in vitro al R. humulifolius a fost crioconservat cu succes prin metoda de vitrificare prin picurare. Cele mai mari procentaje de supraviețuire (62,0) și regenerare (52,0) de muguri crioconservați au fost obținute de la muguri vechi de o lună fără nici un pretratament (Tabelele 1, 2). O perioadă mai lungă de la ultima subcultură in vitro a avut un efect negativ asupra supraviețuirii post-crioconservare, deoarece doar 29,4%, reprezentând mugurii derivați din plantele donatoare de 2 luni, au supraviețuit, dar nu s-a observat nici o supraviețuire când mugurii au fost disecați de la 4 luni - plante donatoare vechi (Tabelul 1).

Pentru mugurii martor (fără crioconservare, fără pretratare) procentele de supraviețuire au fost de 73,3% pentru mugurii provenind de la plante donatoare vechi de o lună, în timp ce procentele de supraviețuire corespunzătoare pentru plantele donatoare de 2 și 4 luni au fost de 60,0% și 50,0%, respectiv (Tabelul 1). În consecință, procentul de supraviețuire al mugurilor martor (fără crioconservare, fără pretratare) derivat din plante donatoare de o lună a fost de 61,2%.

Efectul pretratamentului

Pretratarea cu sau fără ABA a avut un efect semnificativ atât în ​​control cât și în crioconservare R. humulifolius muguri. Cu toate acestea, efectul pretratamentului a diferit între mugurii de control necrioconservați și cei crioconservați.

Pentru controalele necrioconservate, toate cele trei pretratamente (0, 2 sau 4 mg/l ABA) au avut un efect pozitiv atât asupra supraviețuirii, cât și asupra regenerării. Procentul de supraviețuire a mugurilor proaspăt disecați a fost de 61,2%, în timp ce pre-tratamentul de 10 zile fără ABA (0 mg/l) a crescut supraviețuirea la 84,8%. În prezența a 2 sau 4 mg/l ABA, procentele de supraviețuire au ajuns la 93,5% și, respectiv, 96,8% (Tabelul 2). Același fenomen a fost observat și la procentele de regenerare - regenerarea mugurilor de control fără pretratare a fost de 51,0%, în timp ce după pretratarea de 10 zile fără ABA regenerarea a crescut la 75,8%, în timp ce cu 2 sau 4 mg/l ABA regenerarea a ajuns la 90,3 și 87,1%, respectiv (Tabelul 2).

În cazul mugurilor crioconservați, efectul pretratamentului de 10 zile cu 0, 2 sau 4 mg/l ABA a avut un efect negativ asupra recuperării după crioconservare. Procentul de supraviețuire a mugurilor proaspăt disecați a fost de 62%, în timp ce pretratamentul de 10 zile fără ABA (0 mg/l) a scăzut procentul de supraviețuire la 47,1%. Efectul a fost mai sever când a fost inclus ABA - doar 17,6 și 17,1% dintre muguri au supraviețuit din 2 și 4 mg/l pretratamente ABA (Tabelul 2), respectiv.

Procentele de regenerare a mugurilor tratați cu ABA au fost chiar mai mici. Pentru mugurii proaspăt disecați, procentul de regenerare a fost de 52,0, în timp ce după 10 zile de incubare post-disecție pe mediu fără ABA, procentul de regenerare a fost de 35%. În prezența a 2 sau 4 mg/l ABA, doar 5,9 și 8,6% din muguri s-au regenerat după decongelare (Tabelul 2), respectiv.

Transfer de la in vitro la ex vitro

Opt dintre cei 19 lăstari înrădăcinați transferați din condițiile solului in vitro în in vivo au supraviețuit pe parcursul primei veri. Aceste opt plante au iernat cu succes în seră neîncălzită și au fost sănătoase și au crescut după 1 an de transfer (Fig. 1f).

Discuţie

in prezent studiez, R. humulifolius, plantă nativă în pericol critic în sălbăticie în Finlanda, a fost crioconservată cu succes pentru a permite conservarea pe termen lung a speciei.

Protocol de crioconservare pentru conservarea germoplasmei R. humulifolius nu a fost raportat până acum. Cu toate acestea, genul Rubus include mai multe specii de fructe de pădure importante din punct de vedere economic și, prin urmare, mai multe protocoale de crioconservare, inclusiv răcirea cu rată controlată, încapsulare - deshidratare, vitrificare prin încapsulare, vitrificare PVS2 și vitrificare prin picurare au fost aplicate mai multor specii din acest gen (Reed 1993; Chang și Reed 1999; Vysotskaya și colab. 1999; Wang și colab. 2005; Gupta și Reed 2006; Ukhatova și colab. 2017). Pentru zmeura finlandeză (Rubus idaeus), a fost dezvoltat un protocol de încapsulare - vitrificare (Wang și colab. 2005). Prin urmare, pentru nativii pe cale de dispariție R. humulifolius genotip, protocolul de încapsulare - vitrificare a fost utilizat ca referință pentru dezvoltarea protocolului de vitrificare a picăturilor aplicat cu succes în prezentul studiu, rezultând procentaje ridicate de supraviețuire și regenerare (62% și respectiv 52%, Tabelul 2, Tratamentul 1).

Adăugarea ABA la mediile de creștere înainte de crioconservare a fost propusă anterior pentru a crește în continuare procentul de supraviețuire a mugurilor crioconservați și, prin urmare, a fost aplicată în multe protocoale de crioconservare ale diferitelor specii de plante. De exemplu, pentru lăstari accidentali de Begonia x erythrophylla, o perioadă de pre-creștere de 7 zile cu 1,9 sau 3,8 µM ABA înainte de disecarea lăstarilor pentru crioconservare, a crescut semnificativ regresul lăstarilor de la 24 la 35% sau respectiv 43% (Burritt 2008) în timp ce 7,6 (M ABA a dus la o recreștere de 20% . În mod similar, atunci când in vitro lăstari de pere (Pyrus cordata) au fost precultivați pe medii de cultură cu 50, 75 și 150 µM ABA timp de 3 săptămâni înainte de disecția mugurilor și crioconservare, s-a observat o creștere semnificativă a regrowth de la 0 la 7%, 10% sau respectiv 18% (Chang și Reed 2001). Supraviețuirea Wanda pumila a fost, de asemenea, semnificativ crescută atunci când primordiile de lăstari au fost cultivate timp de 3-6 zile pe medii, inclusiv ABA (1,0 mg/l) (Na și Kondo 1996). Prin urmare, în prezentul studiu anterior crioconservării, mugurii disecați au fost pretratați timp de 10 zile pe medii cu 0, 2 sau 4 mg/l ABA.

Conform rezultatelor noastre, tratamentul prealabil cu ABA are un efect divergent asupra controlului și asupra mugurilor crioconservați R. humulifolius (Masa 2). Același efect divergent al pretratamentului ABA a fost observat și pentru sfecla de zahăr in vitro (Beta vulgaris) sfaturi de împușcare în care supraviețuirea mugurilor de control a crescut în prezența ABA de la 57 la 70% după 1 săptămână de pre-tratament ABA. În mod contradictoriu, 37% din vârfurile de lăstari crioconservate au supraviețuit crioconservării fără tratament ABA și cu supraviețuirea tratamentului ABA de o săptămână a scăzut de la 37 la 23% (Vandenbussche și Proft 1998).

Pentru mai multe specii, este necesară aclimatizarea la rece pentru a sprijini tratamentul ABA. De exemplu, cinci Rubus genotipuri (trei soiuri de mure și două zmeură), ABA nu a avut niciun efect asupra recuperării la temperatura camerei, în timp ce aclimatizarea la frig a crescut semnificativ procentele de recuperare. Mai mult, pentru unele genotipuri, frigul împreună cu ABA au crescut sinergic recuperarea (Reed 1993). De exemplu, pentru pere (P. cordata), Tratamentul ABA singur a produs o creștere de 18%, în timp ce cea mai mare regenerare post-crioconservare (> 70%) a fost obținută atunci când un tratament la rece de 2 săptămâni a fost combinat cu o creștere de 50 µM ABA în mediul de pre-tratament. Mai mult, prezența ABA a redus semnificativ timpul de pretratare la rece necesar pentru recuperarea cu succes după crioconservare (Chang și Reed 2001). Pentru Beta vulgaris, s-a observat, de asemenea, efectul sinergic al tratamentului cu frig și ABA - ABA singur a crescut supraviețuirea de la 23 la 45%, în timp ce supraviețuirea combinată la rece și ABA a crescut la 70% după îngheț (Vandenbussche și Proft 1998). Astfel, pentru studiile viitoare, un pretratament la rece ar putea fi, de asemenea, inclus în protocol pentru a vedea dacă ar putea îmbunătăți recuperarea post-crioconservare a R. humulifolius.

Se știe că intervalul de cultivare in vitro, precum și timpul de la inițierea inițială a culturilor in vitro afectează rezultatul crioconservării. De exemplu, supraviețuirea tinerilor (22 de luni de la inițiere) culturi in vitro de mesteacăn de argintBetula pendula) a fost semnificativ mai mare (37,5%) decât cea din culturile vechi de 55 de luni (14,8%) (Ryynänen și Häggman 2001). În cazul în care Dianthus caryophyllus, supraviețuirea vârfurilor de lăstari a crescut cu timpul din ultima subcultură ajungând la 21% după 3 zile, 94% după 14 zile și 98% după 3 săptămâni și 2 luni din ultima subcultură (Dereuddre și colab. 1988).

Nu există experimente de crioconservare anterioare pentru R. humulifolius. Cu toate acestea, rezultatele pot fi comparate cu cele obținute pentru alte specii din același gen. Gupta și Reed (2006) au raportat 96-100% supraviețuire și 45-78% creștere din patru Rubus (mure și zmeură) genotipuri după crioconservare prin vitrificare PVS2. În mod corespunzător, Wang și colab. (2005) au raportat 46-90% de supraviețuire și 50-85% de creștere după crioconservarea a 7 zmeură (Rubus idaeus) genotipuri. Recent, Ukhatova și colab. (2017) au raportat 85-100% supraviețuire și 24-89% regenerare a 12 soiuri de zmeură roșie. Astfel, rezultatele actuale, 61% supraviețuire și 51% regenerare după expunerea la LN, sunt în concordanță cu cele prezentate până acum pentru specia de gen Rubus. De fapt, supraviețuirea și regenerarea mugurilor de control proaspăt disecați (-LN, tratați cu toate soluțiile, cu excepția înghețării în LN) au fost la fel cu cei crioconservați (supraviețuire 62% și regenerare 52%) (Tratamentul 1 în tabelul 2), arătând că toate sfaturile de fotografiere care au supraviețuit tratamentelor de crioconservare ar putea rezista la îngheț în LN. Prin urmare, în viitor, s-ar putea testa dacă diferiți timpi de incubație în soluția de încărcare și PVS2 ar putea afecta supraviețuirea și regenerarea atât a mugurilor de control, cât și a mugurilor crioconservați de R. humulifolius.