Abstract

În această revizuire prezentăm dovezi actuale cu privire la posibilitatea crioconservării țesutului cordonului ombilical pentru utilizare clinică ulterioară. Sunt evidențiate protocoalele pentru obținerea vaselor derivate din cordonul ombilical, grefele pe bază de jeleu din Wharton, celulele stromale multipotente și alte produse biomedicale din cordoanele ombilicale crioconservate și sunt discutate aplicațiile lor clinice prospective. Examinarea literaturii recente indică faptul că ar trebui să ne așteptăm la o cerere mare de crioconservare a țesuturilor cordonului ombilical în viitorul apropiat.

cordonului

fundal

În 1974, sângele din cordonul ombilical (UCB) a fost raportat ca fiind o sursă de celule stem hematopoietice și progenitoare [1], iar în 1988, s-a efectuat primul transplant de UCB crioconservat la un sugar cu anemie Fanconi, o boală moștenită a măduvei osoase. în Franța [2]. În următorii 30 de ani, au fost publicate numeroase studii care demonstrează potențialul regenerativ al anumitor populații de celule derivate din UCB și a fost înființată o rețea globală de biobănci publice și private ale UCB [3, 4].

De mulți ani, țesuturile solide ale cordonului ombilical (UC) au fost tratate ca un deșeu medical fără valoare. Cu toate acestea, ultimul deceniu a fost remarcabil pentru dezvoltarea intensivă a produselor biomedicale pe baza țesuturilor UC - de exemplu, celule stem mezenchimale derivate din UC (MSC), care pot fi obținute din UC totală sau din compartimentele sale disecate (perivascular, intervascular), zonele subamniotice ale jeleului Wharton și stratul subendotelial al vaselor de sânge). Cu potențialul lor proliferativ ridicat, stabilitatea cariotipului și fenotipului, plasticitatea diferențierii, activitatea paracrină și proprietățile imunomodulatoare, MSC derivate din UC pot revendica titlul noului „standard de aur”, eliminând renumitele MSC derivate din măduva osoasă [5,6, 7]. Alte exemple de produse biomedicale derivate din UC sunt vasele UC decelularizate utilizate ca grefe pentru chirurgia vasculară [8,9,10] și matricea extracelulară derivată din jeleu Wharton pentru vindecarea rănilor [11].

Principalul dezavantaj al UC ca sursă de țesut este caracterul tranzitoriu: este disponibil numai într-o perioadă scurtă de timp imediat după naștere. O soluție eficientă la această problemă poate fi oferită de crioconservarea ei atentă, cu toate eforturile depuse pentru a proteja componentele utile (celule, matrice stromale, țesuturi specializate) în timpul depozitării. Această scurtă revizuire prezintă dovezi actuale cu privire la posibilitățile crioconservării țesutului UC, care ar permite utilizarea componentelor sale particulare în terapia celulară și medicina regenerativă.

Crioconservarea vaselor derivate din UC

Reconstrucția chirurgicală a vaselor mici implică transplantul autolog ca standard de aur, dar acest lucru nu este întotdeauna accesibil [9]. Vasele ombilicale decelularizate cu diametru adecvat și lungime considerabilă fără ramuri reprezintă un material adecvat pentru proteze vasculare [8,9,10, 12,13,14,15]. Acest lucru face ca crioconservarea eficientă a vaselor derivate din UC să fie extrem de importantă pentru chirurgia vasculară. Experimentele arată că, deși crioconservarea vaselor UC afectează semnificativ eficacitatea ulterioară a decelularizării (care poate fi atribuită condensării matricei extracelulare în timpul înghețării), nu are nicio influență asupra proprietăților lor mecanice, cum ar fi rigiditatea, presiunea de rupere și rezistența la retenția suturii [12].

Protocoalele pentru crioconservarea vaselor de sânge UC ca biomaterial pentru transplantul alogen nu implică conservarea componentei celulare. Din acest motiv, mediul de crioconservare este compus din soluție salină fără crioprotectoare. Este utilizat în exces de> 20 de volum față de volumul de material proaspăt la o rată de răcire de 1 ° C/min, cu depozitare ulterioară la - 20 ° С [12]. În cazul crioconservării vaselor de sânge UC pentru transplant autolog, conservarea celulelor vii din pereții vaselor de sânge ar avea sens. Cu toate acestea, nu a fost efectuată nicio investigație adecvată a supraviețuirii celulelor în timpul criostocării vaselor UC cu crioprotectoare [15]. În același timp, posibila utilitate a schelelor derivate din vasele de sânge UC nu se limitează la chirurgia vasculară, ci poate fi extinsă la opțiunile de inginerie a țesuturilor pentru nerv [16], țesut parodontal [17] și țesut moale musculo-scheletic [18]. regenerare.

Crioconservarea jeleului Wharton

Stroma UC conține o substanță gelatinoasă unică care lipsește în corpul uman după naștere. Se numește Wharton’s jelly (WJ) după Thomas Wharton (1614–1673), medic și anatomist englez. WJ protejează vasele de sânge (două artere ombilicale și o venă ombilicală) de aglomerare și asigură, de asemenea, flexibilitatea cordonului. Este un rezervor bogat de factori de creștere și conține cantități semnificative de componente ale matricei extracelulare, cum ar fi colagenul (tipurile I, III, IV și V), acidul hialuronic și mai mulți glicozaminoglicanii sulfatati [5]. O astfel de combinație atractivă de caracteristici biomecanice și biochimice face din WJ un material candidat important pentru aplicații medicale. De exemplu, s-a demonstrat că o schelă biomimetică spongioasă, care fusese produsă din WJ decelularizat utilizând o tehnică de uscare prin congelare, îmbunătățește atașarea, penetrarea și creșterea fibroblastelor și accelerează procesele de vindecare a rănilor [11].

Alogrefele decelularizate sunt utilizate în mod regulat în practica clinică, în special în oftalmologie și în tratamentul plăgilor [19]. Una dintre cele mai frecvente alogrefe se bazează pe membrana amniotică, care constă dintr-un monostrat de epiteliu simplu cu o membrană bazală groasă și regiunea stromală avasculară subiacentă. Această grefă se obține prin deshidratare sau, alternativ, prin îngheț, care protejează mai bine arhitectura țesuturilor și moleculele biologic active ale matricei extracelulare [19]. Materialul alogrefă cu structură similară pe baza WJ din UC crioconservate a fost introdus în 2014. Conținutul de acid hialuronic cu greutate moleculară ridicată (care se sugerează a fi izoforma cheie a acidului hialuronic responsabil pentru proprietățile terapeutice) după decongelare este raportat mai mare în WJ decât în ​​membrana amniotică. Mai mult, extrasele de țesut UC, dar nu de membrană amniotică, promovează expresia anti-inflamatorie a citokinei IL-10 și o scădere a expresiei pro-inflamatorii a citokinei IL-12 în linia celulară de macrofage RAW264.7. Acest rezultat indică faptul că alogrefele UC au anumite avantaje [19].

Similar cu cazul țesutului vascular, crioconservarea UC pentru obținerea matricilor WJ nu implică conservarea componentei celulare. Din acest motiv, țesutul proaspăt este pur și simplu răcit la - 80 ° C fără crioprotectoare [19]. Grefele obținute pe baza WJ crioconservate s-au dovedit deja a fi eficiente în tratamentul spinei bifide [20], ulcerelor complexe ale extremităților inferioare cu capsule osoase, tendinoase, musculare și/sau articulare expuse, precum și multiple comorbidități, inclusiv diabetul zaharat, ischemie și osteomielită subiacentă [21,22,23].

Crioconservarea componentei celulare UC

Inițierea sarcinii cu spermă care a fost depozitată pe gheață uscată pentru o perioadă scurtă de timp a fost efectuată pentru prima dată în 1953. Introducerea ulterioară a azotului lichid pentru criostocarea pe termen lung a spermei la începutul anilor 1960 a contribuit substanțial la eficacitatea abordării [24]. ]. Criotehnologiile contemporane permit conservarea pe termen lung a celulelor atât în ​​suspensii, cât și în fragmente de țesuturi întregi (de exemplu, țesut adipos întreg [25, 26], țesut folicular dentar [27], fragmente de măduvă osoasă [28], testicul [29] și ovarian [30] țesuturi), din care celulele pot fi izolate cu succes după decongelare. Comparativ cu depozitarea celulelor izolate, depozitarea țesuturilor neprelucrate are o serie de avantaje: minimizarea timpului, a forței de muncă și a cheltuielilor materiale; stocarea celulelor în mediul lor natural; posibilitățile viitoare de izolare și extindere a celulelor în conformitate cu standardele viitoare încă necunoscute.

Studiile experimentale la scară completă asupra crioconservării țesutului UC au început în urmă cu aproximativ 10 ani. Mai multe tipuri de celule UC, inclusiv celule epiteliale și endoteliale, sunt valoroase pentru medicina regenerativă și ingineria țesuturilor și pot fi cultivate [31,32,33]. Destul de recent, a fost raportată o metodă eficientă pentru crioconservarea celulei endoteliale a venei ombilicale (HUVEC) [34]; important, etapa de cultivare și extindere a celulei înainte de transferul probelor la biobancă este permisă în această procedură. Pe scurt, peletele primare de endoteliu, care sunt izolate de UC prin digestie enzimatică, sunt congelate și plasate într-un congelator de azot lichid pentru depozitare pe termen lung, urmate de dezghețare rapidă la + 37 ° C. Cu acest protocol, 14 culturi HUVEC viabile au fost obținute cu succes din 17 pelete endoteliale primare, ceea ce reprezintă o rată de succes de 82%. Autorii consideră că această abordare este utilă pentru îmbunătățirea eficienței și logisticii biobancării, în special atunci când se prelucrează colecții mari de probe endoteliale [34].

Cu toate acestea, majoritatea acestor studii se concentrează în principal pe izolarea CSM din țesutul UC crioconservat. Este important de menționat că se presupune că potențialul terapeutic al MSC-urilor se reduce substanțial în timpul criostorajului (așa-numitul „efect de asomare crionică”), ceea ce explică eșecurile multiple ale studiilor clinice care utilizează transplanturi de celule imediat după decongelare [35]. În acest sens, crioconservarea întregului țesut UC pentru izolarea ulterioară și extinderea MSC în scopuri experimentale sau clinice reprezintă o strategie de alegere.

Studiile de pionierat în acest domeniu nu au avut succes, deoarece nu s-au obținut culturi MSC din probe de WJ crioconservate timp de 1 săptămână, 1 lună sau 6 luni în azot lichid, în ciuda crioprotecției cu 10% dimetil sulfoxid (DMSO) și 5% glicerol [36]. Atât DMSO cât și glicerolul sunt crioprotectoare renumite utilizate pentru a preveni deteriorarea celulelor în timpul înghețării stocurilor de culturi celulare prin întreruperea formării intracelulare a cristalelor de gheață. Cu toate acestea, conservarea celulelor vii într-o probă WJ preparată cu 1,5 M DMSO și 0,1 M zaharoză prin înghețare lentă (dar nu prin vitrificare) a fost demonstrată în 2012 [37]. În 2013 au fost publicate și date mai convingătoare despre obținerea MSC din țesuturile UC după depozitare în azot lichid; aceste MSC au fost identice din punct de vedere fenotip și funcțional cu cele obținute din țesuturi proaspete [38]. Mai multe grupuri științifice și-au raportat succesul pe parcursul anilor 2014-2018, sugerând o varietate de protocoale pentru crioconservarea țesutului UC. Rezultatele sunt prezentate în Tabelul 1.

O altă problemă care limitează critic aplicabilitatea clinică a MSC-urilor crioconservate derivate din țesuturi este prezența proteinelor xeno în mediul de crioconservare, care conține de obicei până la 90% din volumul serului de vițel fetal. Utilizarea mediilor fără xeno crește semnificativ eficacitatea izolării MCS din probele de crioconservate UC [43, 44], în timp ce creșterea ulterioară a celulelor în condiții fără xeno facilitează o îmbunătățire substanțială generală a proprietăților lor (apoptoză redusă și imunogenitate), creșterea proliferării, creșterea secreției factorului de creștere a hepatocitelor și a prostaglandinei E2) [45, 46]. Este plauzibil ca înlocuirea propusă a serului de vițel cu ser autolog sau substanțe farmacologice adecvate (de exemplu, albumina serică umană) să prevaleze în cele din urmă. În opinia noastră, standardul fără xeno pentru crioconservarea țesutului UC ar trebui introdus cât mai curând posibil.

Perspectivele actuale ale operațiunilor bancare de țesut UC

Concluzii

Examinarea literaturii recente arată că ar trebui să ne așteptăm la o cerere mare de crioconservare a țesuturilor UC umane în viitorul apropiat. Alegerea unui protocol pentru crioconservare depinde de sarcina - conservarea vaselor de sânge, WJ sau a componentei celulare. Eficacitatea obținerii celulelor vii din țesuturile UC dezghețate este în mare măsură influențată de compoziția mediului crioprotector, modul de îngheț și protocolul utilizat pentru izolarea celulelor. Deși sunt disponibile puține date despre supraviețuirea celulelor endoteliale sau epiteliale în țesuturile UC crioconservate, unele protocoale actuale permit obținerea MSC din țesuturile UC după criostorare care sunt identice din punct de vedere fenotip și funcțional cu cele obținute din țesuturile proaspete.